专利名称：促进中枢神经再生与功能恢复的hNgR-Fc融合蛋白疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及到一种能够促进中枢神经再生与功能恢复的 hNgR-Fc融合蛋白疫苗。
背景技术：
胶体金(Colloidal gold, CG)是指纳米金颗粒的一种存在状态，即金粒子粒径大 小约为1 IOOnm之间，存在于溶液中。胶体金是氯金酸的水溶液，属悬胶液，为带负电的 胶体。胶金粒和其它胶一样也具有双层电结构，中心为许多金分子构成的胶金核，其外为 AuO2-及部分反离子形成的吸附层，胶金核同吸附层一起组成胶金粒。胶体金如其它纳米颗 粒一样属单晶和多晶微粒，具有小尺寸效应、良好的表面和界面效应、靶向作用及缓释作用 等。目前，胶体金主要应用于免疫金标记技术及相关传感器技术，还没有应用于免疫佐剂的 研究报道。目前人和动物用的常规免疫佐剂主要是乳化的油_水佐剂、金属盐类佐剂(如铝 佐剂)、完全福氏佐剂(Complete Freund's adjuvant,CFA)和不完全福氏佐剂(Incomplete Freund' s adjuvant, IFA)等。但它们对抗原性较弱的多肽，特别是重组抗原效果不佳，或 存在严重的副作用，注射后在注射部位常引起无菌化脓，有时还会形成肉芽肿，且有长期的 油滞留于组织，易引起过敏反应等问题。研究表明，与周围神经损伤后的成功再生相比，中枢神经(CNS)再生失败 的主要原因是由于损伤微环境中多种再生抑制分子的存在。目前已发现这种轴突 # ^ Φ ^ ± Jg W H ft :Nogo-A> MAG (Myelin—associated glycoprotein)禾口 OMgp (Oligodendrocyte-myelin glycoprotein)，尽管三者蛋白结构明显不同，但却均能通 过一个共同受体Nogo-66受体(Nogo-66rec印tor，NgR)及其下游可能的信号通路，参与神 经再生的抑制作用。尽管有研究表明采用脊髓组织勻浆或髓鞘提取物免疫动物治疗脊髓损 伤(Spinal cord injury, SCI)可通过产生抗体封闭其抑制作用，促进损伤脊髓的恢复，但 脊髓组织勻浆或髓鞘提取物成分特别复杂，诱发自身免疫病的风险极高。鉴于NgR特殊的 靶分子效应，选择NgR为免疫原既可促进脊髓损伤后轴突再生，对神经元起到保护作用，又 可最大程度地降低诱发自身免疫病的风险性，从而开辟了克服CNS再生失败的新途径，为 进一步揭示神经再生机制及相关药物开发提供了新的契机。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进中枢神经再生的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，以提高其 免疫效果，并减小其毒副作用。本发明所述促进中枢神经再生的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，是由下述方法制成的组 合物将纯化的hNgR-Fc融合蛋白溶解于缓冲液中，所得溶液与等体积的胶体金混合得 混合液，在混合液中加入稳定剂。
hNgR-Fc融合蛋白在组合物中的浓度为30 60 μ g/ml。所述缓冲液的pH值为4 9。所述缓冲液为浓度为0. 005 0. 015M的柠檬酸钠缓冲液。
所述胶体金的粒径为10 50nm。所述稳定剂为聚乙二醇20000，其在组合物中的浓度为200 500 μ g/ml。本发明以hNgR-Fc (Fragment cristallizable)融合蛋白作为免疫原，并采用胶 体金作为蛋白疫苗的免疫佐剂。受体-Fc融合蛋白已经被证实是除了抗体药物以外，清 除体内多余配体分子的又一有效手段。受体结构域在融合蛋白中执行结合配体的功能， 而Fc部分可有多种作用，如可使用通用的标记二抗进行检测，可通过与protein A的结合 而使用亲和层析方便地纯化，大大延长药物在体内的半衰期，可提供额外的生物学效应， 如补体激活、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(Antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)等免疫调节活性。与抗体药物相比，受体-Fe融合蛋白可不必进行繁 琐的抗体筛选和人源化过程，并具有亲和力高、免疫源性低等优势。胶体金颗粒标记蛋白质(抗体、抗原)是通过异性电荷吸引产生的结合，这种结合 不影响蛋白质生物活性和免疫活性，这为胶体金作为免疫佐剂提供了理论依据。纳米颗粒 均勻性好，以其作为佐剂，可有效避免载体效应，延缓抗原的释放，持久增强机体体液免疫 和刺激淋巴细胞增殖，更重要的是它包裹的抗原颗粒是巨噬细胞(ΜΦ)和树突状细胞(DC) 的首选吞噬目标，为实现机体的有效免疫反应迈出重要一步。纳米颗粒还可形成水凝胶，特 别适合做蛋白质/多肽类药物载体，且不需要交联别的试剂或佐剂。制备胶体纳米金颗粒有多种不同的方法，本发明采用柠檬酸三钠还原法制备不同 粒经的纳米金颗粒。为验证柠檬酸三钠还原法制备的纳米金的可靠性，利用抗坏血酸还原 法制备粒径相近的纳米金作对照实验。通过裸眼观察、丁达尔现象、可见光光谱法和扫描电 镜鉴定制备的纳米金颗粒的粒径大小及均勻度。为观察纳米金颗粒对大鼠免疫功能的影响，本发明设计了三种均勻度较好的不同 粒径和三种剂量9个组合的纳米金对SD(Sprague-DawIey)大鼠进行肌肉注射，并设计了 一组正常对照实验；同时观察有无实验性变态反应性脑脊髓炎(Exprerimental allergic encephalomyelitis, EAE)的发生，以证明用纳米金免疫大鼠的安全性。采用噻唑蓝 (Thiazolyl blue,MTT)比色法测定外周血和脾脏淋巴细胞的增殖情况。由于IL-2是T淋 巴细胞增殖的关键免疫促进因子，而活化的T细胞产生IL-2能力的强弱又可作为评价机体 免疫功能的一项重要指标，本发明采用ELISA法检测外周血分离血清及脾脏淋巴细胞中的 IL-2水平。结果表明不同粒径和剂量的纳米金均可不同程度促进SD大鼠外周血和脾脏 淋巴细胞的增殖，其中15nm/0. 6ml剂量组和25nm/0. 4ml剂量组对大鼠外周血淋巴细胞增 殖有较强的促进作用，而15nm/0. 6ml剂量组则对脾脏淋巴细胞增殖促进作用最强。与正常 对照组相比，不同粒径不同剂量的胶体金均可促进外周血和脾脏淋巴细胞IL-2的分泌，其 中外周血15nm/0. 6ml剂量组促进作用最为明显，脾脏中则15nm/0. 6ml和25nm/0. 6ml剂量 组促进作用较强。纳米金的安全性评价结果证实，纳米金作为免疫佐剂具有很强的安全性。为获得大量天然表达的hNgR-Fc融合蛋白，本发明以真核表达载体 pcDNA-hNgR-Fc质粒(本实验室保存)为模板，经PCR扩增得到hNgR-Fc片段。所用引物如 下
Forward primer 5' GGAATTCCATATGAAGAGGGCGTCCGCTGG 3‘Nde I酶切位点Reverse pr imer 5' CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3'Xho I酶切位点引物两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点，PCR扩增的hNgR-Fc片段，经Nde I和 Xho I双酶切后回收纯化并将其克隆于同样双酶切的pET30a+表达载体(Invitrogen)中， 获得pET-hNgR-Fc重组表达质粒。经PCR、酶切和测序鉴定正确后将重组质粒转化至E. coli BL-2IpLys感受态细胞中诱导表达，并通过SDS-PAGE对表达的目的蛋白进行鉴定。然后通 过Protein A亲和柱来富集并纯化破菌上清中的目标蛋白hNgR-Fc，并进行SDS-PAGE分析 禾口 Western blot 鉴定。以获得的hNgR-Fc融合蛋白作为疫苗的主要组分，以15nm胶体金作为免疫佐剂制 备hNgR-Fc融合蛋白疫苗，并通过体外、体内实验初步对获得的疫苗进行效应学观察。
现结合附图对本发明作进一步详细说明。图IA是粒径为15nm胶体金的电镜扫描图片；图IB是粒径为50nm胶体金的电镜扫描图片；图2是纳米金溶胶的光谱扫描曲线图，柠檬酸三钠还原法制备的直径10、15、25、 50、60、70、98、147、160nm的胶体金颗粒与抗坏血酸还原法制备的直径8 13nm的胶体金颗 粒紫外_可见吸收光谱检测；图3A是外周血淋巴细胞增殖与纳米金颗粒直径之间的关系图(与正常对照组比 氺氺，P < 0. 01 ;氺，P < 0. 05)；图3B是脾脏淋巴细胞增殖与纳米金颗粒直径之间的关系图(与正常对照组比较， 氺氺，ρ < 0. 01 ;氺，ρ < 0. 05)；图4A是血清中IL-2水平与纳米金颗粒直径之间的关系图(与正常对照组比较， **，ρ < 0. 01)；图4B是脾脏淋巴细胞中IL-2水平与纳米金颗粒直径之间的关系图(与正常对照 组比较，**，P < 0.01)；图5A是重组质粒pET-hNgR-Fc的PCR鉴定结果图，其中1、2分别为假阳性和阳性 克隆，M 为 Wide Range DNA Marker (500-15000)；图5B是重组质粒pET-hNgR-Fc酶切鉴定结果图，其中M :DNA MarkerLamda-Hind III Digest ;1 :pET-30a(+) ;2 :pET-hNgR-Fc ;3 :pET-hNgR-Fc XhoI 单酶切；4 pET-hNgR-Fc Nde I+Xho I 双酶切；图5C是重组hNgR-Fc融合蛋白的原核表达和纯化的SDS-PAGE结果图，其中 1 诱导的菌体破菌上清；2 诱导的全菌裂解液；3 未诱导的全菌裂解液；4 纯化的重组 hNgR-Fc融合蛋白；图5D是重组hNgR-Fc融合蛋白的Western blot鉴定结果图，其中1 未诱导的全 菌裂解液；2 诱导的全菌裂解液；3 未诱导的菌体破菌上清；4 诱导的菌体破菌上清；图6是疫苗稳定性的光谱扫描检测曲线图7是ELISA法检测免疫大鼠血清中的抗NgR抗体滴度的结果图；图8A是hNgR-Fc融合蛋白疫苗免疫血清可中和抑制分子MAG对神经突起的抑制 作用，在预先用MAG处理的培养液中培养新生大鼠背根节神经元(Dorsalroot ganglia, DRG)，分别加入未经hNgR-Fc疫苗免疫的对照血清、hNgR-Fc疫苗免疫血清及NgR抗体培养 24h后，神经元突起的生长情况图，标尺25 μ m ；图8B是hNgR-Fc融合蛋白疫苗免疫血清可中和抑制分子MAG对神经突起的抑制 作用，各组神经元平均突起长度的统计分析图，其中数据表示为均数士标准误(与MAG+ 对照血清组相比，#，P < 0. 01)；图9A是脊髓半横切损伤模型行为学检测结果，BBB评分结果图，(与单纯损伤 (SCI)组相比，*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01)图9B是脊髓半横切损伤模型行为学检测结果，网格步行结果图，(与SCI组相比， *，ρ < 0. 05 ；**，ρ < 0. 01)图9C是脊髓半横断模型行为学检测结果，足迹试验结果图(红色标记大鼠前掌， 蓝色标记后掌)；图9D是脊髓半横切损伤模型行为学检测结果，足迹法结果图，(与SCI组相比，**， ρ < 0. 01)；图IOA是核黄(Nuclear yellow, NY)逆行示踪标记SCI组和SCI+hNgR-Fc免疫 组损伤部位头侧(距损伤部位中心上游约5mm处)脊髓冠状(横切)和纵切切片图，结 果显示hNgR-Fc融合蛋白疫苗接种可促进脊髓损伤后轴突的再生，标尺分别为300μπι和 149. 82ym ；图IOB是核黄(Nuclear yellow,NY)逆行示踪结果显示hNgR-Fc融合蛋白疫苗接 种可促进脊髓损伤后轴突的再生，以脊髓内的逆行标记的再生轴突纤维的荧光强度表示轴 突的再生情况(与SCI组相比，**，P <0. 01)；图11是组织学观察hNgR-Fc融合蛋白疫苗接种对损伤脊髓神经元影响的结果 图，结果显示hNgR-Fc融合蛋白疫苗接种对损伤脊髓神经元具有明显的保护作用，标尺 100 μ m0具体实施方法实施例1 柠檬酸三钠还原法制备纳米金先将0. lg/Ι的HAuCl4水溶液50ml加热至沸腾，随即迅速在搅拌下加入10g/l柠 檬酸三钠水溶液，根据加入柠檬酸三钠水溶液量的不同可分别制备不同粒径的纳米金。为进一步验证柠檬酸三钠还原法制备纳米金的可靠性，本发明设计用抗坏血 酸还原法制备纳米金作为对照实验。将在4°C预冷的HAuCl4水溶液lml、0. 2mol/l K2CO3L 5ml、双蒸水25ml混勻。在搅拌下加入Iml 0. 7%抗坏血酸水溶液，立即呈现紫红色。 加双蒸水至100ml，加热至溶液变为透明红色为止，胶体金颗粒直径为8 13nm。通过裸眼观察、丁达尔现象、可见光光谱法和扫描电镜鉴定制备的纳米金颗粒的 粒径大小及均勻度。结果表明制备的纳米金颗粒的粒径大小及均勻度均符合要求。实施例2 免疫动物本发明选取8 10周龄正常成年SD大鼠60只，体重200 220g，雌雄不拘。采 用三种粒径均勻度较好纳米金，每种粒径三种剂量，共9个组合，外加一个对照实验组，共10个处理。处理1 3组合分别注射直径为IOnm的纳米金0. 2ml、0. 4ml和0. 6ml三种剂 量组，处理4 6组合分别为15nm的0. 2ml,0. 4ml和0. 6ml三种剂量组，处理7 9组合 分别为25nm的0. 2ml,0. 4ml和0. 6ml三种剂量组。处理10为正常对照组，不做任何处理。 每组6只，饲喂普通块状饲料，自由饮食进水。免疫方式为后肢肌肉多点注射，每两天注射 1次，共注射4次，在第四次注射后7d进行处理。实施例3 纳米金的安全性评价考虑到纳米金有可能会刺激机体产生针对脑脊髓正常组织的自身免疫反应，诱发 大鼠变态反应性脑脊髓炎(Experimnetal allergic Enc印halomyelitis，EAE)，从而发生 一系列的毒副作用症状，本发明同时观察了大鼠EAE的发生情况。结果表明，所有大鼠在免 疫后第二天均出现活动、饮食减少，维持一天后逐步缓解，此后体重逐渐增加，无死亡大鼠。 首次免疫至免疫全过程均未出现EAE症状及表现。证实纳米金未诱导出大鼠EAE，具有较好 的生物安全性。实施例4 =MTT法检测淋巴细胞的增殖1、取材(1)将SD大鼠用戊巴比妥钠进行腹腔麻醉，75%酒精消毒后，打开腹腔；注射 器快速抽取心脏血液3 4ml。其中Iml转移到有抗凝剂肝素钠的EP管中，保存在4°C冰 箱中；Iml转移到不加抗凝剂的EP管中，常温放置，凝集后2000rpm离心20min，吸取血清于 EP管中-20°C保存备用。(2)快速取大鼠的脾脏，立即于PBS液中清洗。随后快速取0. Ig于Iml EP管中并 于液氮中速冻后转入-70°C冰箱中保存备用。(3)另称取脾脏0. lg，用Hank' s液继续清洗后转入5ml离心管中，加RPMI1640 培养液，4°C保存待取脾脏淋巴细胞时用。2、外周血淋巴细胞的MTT检测(1)取抗凝血Iml与Hank' s液1 1混勻于5ml离心管中后，小心加入盛有2ml 细胞分离液的5ml离心管中，以2000rpm离心15min，收集上清；(2)放入含Hank' s液的5ml离心管中，充分混勻后，以1500 2000rpm离心 IOmin0吸去上清液，沉淀经反复洗2次即得到所需细胞；(3)加Iml RPMI1640培养液(含10%小牛血清)悬浮细胞；(4)于96孔无菌培养板内加入细胞悬液200 μ 1(设复孔)，每孔加MTT溶液15 μ 1。 轻轻振荡后，37 °C温育3h ；(5)每孔加入二甲基亚砜(DMSO)IOOy 1，轻轻振荡。待甲膊颗粒完全溶解后，用酶 标仪于590nm波长测量OD值。3、脾脏淋巴细胞的MTT检测(1)在超净工作台中将培养液中的脾脏取出后置于培养皿中，剔除脾脏周围组织， 用剪刀反复剪切至糊状，置于200目的细胞筛上用注射器芯轻研脾脏，培养液冲洗滤过细 胞筛于另一培养皿中，收集于离心管中；(2) 1500rpm离心lOmin，弃上清，加入少许灭菌的氯化铵溶液以溶解红细胞，5min 后，同样离心弃上清，细胞用无血清的1640液洗涤一遍；(3)用Iml RPMI1640培养液(含10%小牛血清)悬浮细胞，于96孔无菌培养板内加入细胞悬液200 μ 1 (设复孔)，每孔加MTT溶液12 μ 1，轻轻振荡后，37°C温育3h ； (4) 每管加入适量二甲基亚砜100 μ 1，轻轻振荡，待甲膊颗粒完全溶解后，用酶标仪于590nm波 长测量OD值。结果表明，不同直径和剂量的纳米金对SD大鼠外周血和脾脏淋巴细胞的增殖均 有不同程度的影响，其中15nm/0. 6ml剂量组和25nm/0. 4ml剂量组对大鼠外周血淋巴细胞 增殖有较强的促进作用，而15nm/0. 6ml剂量组则对脾脏淋巴细胞增殖促进作用最强。实施例5 IL-2水平的检测胶体金免疫大鼠后，无菌条件下通过心脏取血分离血清，同时取脾脏，分离淋巴细 胞。采用IOml含5% FBS的PRMI 1640培养液制成细胞悬液，离心lOmin。经0. 17M的NH4Cl 裂解红细胞，PRMI 1640培养液洗涤，以台盼兰液检测细胞活性，确定活细胞超过90%。用 10% FBS的PRMI 1640调整脾细胞终浓度至5X 106/ml，接种于48孔培养板中，置37°C 5% 的CO2培养箱中培养48h。室温离心lOmin，收集上清。ELISA法检测血清和细胞培养上清中 IL-2的含量。实验方法按试剂盒说明进行实验前20min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室 温；按试剂盒说明将标准品稀释至不同浓度，设空白对照，同时将待测样品按1 50稀释； 除空白孔外，分别将不同浓度标准品和稀释样品ΙΟΟμ 1/孔加入相应孔中，封板胶封住反 应孔，37°C孵育90min ；用洗涤液充分洗涤酶标板4 6次，滤纸上印干；除空白孔外，每孔 加入生物素化一抗工作液ΙΟΟμ 1 ；充分混勻后封板胶封住反应孔，37°C孵育60min ；按上述 方法洗板4 6次；除空白孔外，每孔加酶标抗体工作液100μ 1，封板胶封住反应孔，37°C 孵育30min ；洗板同前；加入显色剂100μ 1/孔，避光37°C孵育10 15min ；加入终止液 100μ 1/孔，混勻后即刻(5min内)测量450nm处吸光值。根据标准品的吸光值及相应的浓 度作标准曲线，并根据样品的吸光值在标准曲线上读取IL-2对应的浓度。结果表明，与正 常对照组相比，不同粒径不同剂量的胶体金均可促进外周血和脾脏淋巴细胞IL-2的分泌， 其中15nm/0. 6ml剂量组对大鼠外周血淋巴细胞IL-2的分泌促进作用最强，而15nm/0. 6ml 剂量组和25nm/0. 6ml剂量组则对脾脏淋巴细胞IL-2的分泌均有较强的促进作用。实施例6 人NgR-Fc原核表达载体的构建及鉴定为获得大量天然表达的人NgR-Fc融合蛋白，本发明以真核表达载体 pcDNA-hNgR-Fc质粒(本实验室保存)为模板，经PCR扩增得到hNgR-Fc片段。所用引物如 下Forward pr imer 5' GGAATTCCATATGAAGAGGGCGTCCGCTGG 3'Nde I酶切位点Reverse primer 5' CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3‘Xho I酶切位点引物两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点，PCR扩增的hNgR-Fc片段，经Nde I 和Xho I双酶切后回收纯化并将其克隆于同样双酶切的pET30a+表达载体(Invitrogen) 中，获得pET-hNgR-Fc重组表达质粒，并进行PCR、酶切和测序鉴定验证构建载体的正确性。实施例7 人NgR-Fc可溶性融合蛋白的表达、纯化及鉴定将经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化至E. coli BL_21pLys感受态细胞中，用 LB培养基扩增，并在0D_达到0. 8左右时加入IPTG至终浓度为0. 5mmol/L，诱导表达3h， 通过SDS-PAGE初步检测目标蛋白hNgR-Fc的表达情况。然后通过Protein A亲和柱来富集并纯化破菌上清中的目标蛋白hNgR-Fc，并进行SDS-PAGE分析和Western-blot (用抗人 Fc的抗体作为一抗)鉴定。最终获得了纯度较高的人NgR-Fc融合蛋白。实施例8 hNgR-Fc融合蛋白的疫苗化将纯化的hNgR-Fc融合蛋白与15nm胶体金混合形成hNgR-Fc融合蛋白疫苗。考 虑到胶体金的稳定性，选用0. OlM柠檬酸钠缓冲液(pH = 6. 0)溶解hNgR-Fc抗原，并在与 15nm胶体金混合等体积混合后加入稳定剂聚乙二醇20000 (PEG20000)至终浓度500 μ g/ ml。选用0. OlM柠檬酸钠缓冲液(pH = 6. 0)原因如下一、制备胶体金时采用柠檬酸三钠 还原法，该缓冲液主要成分为柠檬酸三钠，没有引入新离子，对胶体金稳定性干扰小；二、柠 檬酸三钠作为一种临床用抗凝剂，无毒性；三、胶体金的PH与该缓冲液pH相近。hNgR-Fc融合蛋白疫苗化过程及组分如下取50 μ g纯化的hNgR-Fc融合蛋白溶 解于0. 6ml的0. OlM柠檬酸钠缓冲液(pH = 6)后，与0. 6ml 15nm胶体金(含0. 05% PEG) 等体积混合，最后加入稳定剂PEG20000至终浓度500 μ g/ml。实施例9 动物免疫及抗体滴度检测用纯化的50 μ g hNgR-Fc融合蛋白作为抗原按上述方法制备蛋白疫苗，并采用后 肢肌肉多点注射法免疫SD大鼠(n = 6只)。首次免疫2周后，加强免疫一次，1周后再加 强免疫一次。同时设弗氏佐剂(Freund' s adjuvant,FA)和胶体金(Colloidal gold,CG) 对照。弗氏佐剂初次免疫时采用50 μ g hNgR-Fc与完全弗氏佐剂(CFA)，加强免疫时用不完 全弗氏佐剂(IFA)，免疫方法相同。加强免疫2次后，通过心脏取血分离血清并采用ELISA法检测抗体效价。方法 如下预先包被酶标板，用包被缓冲液(0. 05M碳酸盐缓冲液，pH9. 6)将抗原NgR其稀释 为lyg/ml，每孔100μ 1，空白对照不包被，4°C过夜。弃液体后用洗涤液(PBS_T，0.05% Tween-20)将包被好的酶标板洗涤3次，每次2min。每孔加入100 μ 1 1 %的BSA封闭液， 37°C封闭lh。弃去封闭液，洗涤3次。加入不同稀释度的抗血清，每孔100 μ 1，37°C孵育 lh。洗涤3次后加入1 10000稀释的羊抗大鼠IgG-HRP(北京中杉)，每孔100μ 1，37°C 孵育lh，洗涤4次后，每孔加入100 μ 1 11^显色液，371显色201^11后，每孔加入5(^1终 止液(2Μ浓硫酸)终止反应。用酶标仪在450nm波长处读取吸光度值(0D值)。OD值大于 阴性孔3倍以上判断为阳性。以免疫前血清为阴性对照。结果表明，所有经hNgR-Fc融合 蛋白免疫的大鼠均产生抗NgR抗体，效价均大于1 6400且纳米金免疫佐剂明显优于弗氏 佐剂；胶体金对照组大鼠血清中NgR抗体检测呈阴性。实施例10 抗血清对神经元突起生长的影响在解剖显微镜下，于无菌预冷的D-Hank' s液中逐个摘取新生SD大鼠背根神经 节(Dorsal root ganglia，DRG)，转入2ml 0. 25%胰蛋白酶消化液中，37°C培养箱中作用 20min ；IOOOrpm离心5min，吸去胰酶消化液，加入FBS终止消化；IOOOrpm离心5min，吸去 FBS，加入DMEM/F12培养基(含FBS)制成单细胞悬液，接种在未包被的35mm Corning 培养皿内，置于37°C培养箱中孵育50min ；收集未贴壁的细胞悬液，IOOOrpm离心5min，换入 Neurobasal (NB)培养基吹打均勻，细胞计数后以IO6个/ml细胞密度接种在多聚赖氨酸包 被的24孔培养板中。预先用PBS将MAG蛋白浓度调至IOOng/ μ 1。待上述培养的DRG神经元贴壁后换 液，每孔400 μ 1 ΝΒ。随机分为3组，每组重复2次。第一组加入1 μ 1 MAG与未经hNgR-Fc融合蛋白疫苗免疫的对照血清(1 100)；第二组加入1 μ 1 MAG与hNgR-Fc融合蛋白疫苗 免疫血清(1 100)；第三组加入Iyl MAG与NgR抗体(1 1000)。上述各组细胞在培 养24h后用4%多聚甲醛固定，采用Image-ProPlus 5. 0软件测量培养24h后的突起长度， 进行神经元突起生长分析(Neuriteoutgrowth assay)。为减少误差，每次实验在200倍倒 置显微镜下随机选取10个视野进行测量，实验重复3次，每次复孔检测，取平均值进行统计 分析。结果表明，hNgR-Fc融合蛋白疫苗免疫血清可中和MAG对神经元突起生长的抑制作 用。实施例11 在体观察疫苗接种对损伤脊髓的修复作用用制备的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，接种大鼠，接种方法同前。免疫2周后，制备大鼠 脊髓半横切损伤模型，结合束路追踪、组织学观察和行为学检测技术，于6周后盲法观察损 伤脊髓头侧神经纤维的再生情况、神经元存活情况及脊髓损伤后的功能恢复情况。详细操 作过程如下脊髓背柱损伤后，各组动物在灌注前16 18h，在坐骨神经注射核黄(Nuclear yellow, NY)，以脊髓内的逆行标记的再生轴突纤维的荧光强度表示轴突的再生情况。组 织学观察则分别采用HE和尼氏染色法观察损伤神经元的存活情况。同时采用行为学方法 (BBB评分、网格步行、足迹试验)检测伤侧后肢功能的恢复情况。结果表明，hNgR-Fc融合 蛋白疫苗既可促进脊髓损伤后轴突的再生，又对神经元具有明显的保护作用，还可促进脊 髓损伤后功能的恢复。
权利要求
促进中枢神经再生与功能恢复的hNgR Fc融合蛋白疫苗，其特征在于，是由下述方法制成的组合物将纯化的hNgR Fc融合蛋白溶解于缓冲液中，所得溶液与等体积的胶体金混合得混合液，在混合液中加入稳定剂。
2.根据权利要求1所述促进中枢神经再生与功能恢复的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 征在于hNgR-Fc融合蛋白在组合物中的浓度为30 60 μ g/ml。
3.根据权利要求1所述促进中枢神经再生与功能恢复的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 征在于所述缓冲液的pH值为4 9。
4.根据权利要求1或3所述促进中枢神经再生与功能恢复的hNgR-Fc融合蛋白疫苗， 其特征在于所述缓冲液为柠檬酸钠缓冲液。
5.根据权利要求2所述促进中枢神经再生与功能恢复的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 征在于所述缓冲液为浓度为0. 005 0. 015M的柠檬酸钠缓冲液。
6.根据权利要求1所述促进中枢神经再生与功能恢复的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 征在于所述胶体金的粒径为10 50nm。
7.根据权利要求1所述促进中枢神经再生与功能恢复的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 征在于所述稳定剂为聚乙二醇20000。
8.根据权利要求6所述促进中枢神经再生与功能恢复的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 征在于所述稳定剂为聚乙二醇20000，其在组合物中的浓度为200 500 μ g/ml。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，涉及到一种能够促进中枢神经再生与功能恢复的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，是将纯化的hNgR-Fc融合蛋白溶解于缓冲液中，所得溶液与等体积的胶体金混合得混合液，在混合液中加入稳定剂所得到的组合物。该疫苗具有较好的免疫效果，能促进中枢神经再生与功能恢复，且毒副作用小。
文档编号A61K39/39GK101897960SQ20101014665
公开日2010年12月1日 申请日期2010年4月14日 优先权日2010年4月14日
发明者伍亚民, 周新富, 曾琳, 朱枫, 李红运, 王永堂, 鲁秀敏, 龙在云 申请人:中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所