专利名称：中药杏仁在溶菌酶海藻酸钠微球中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药杏仁作为肠道吸收促进剂的新用途，特别是中药杏仁在溶菌酶海 藻酸钠微球中的应用。
背景技术：
溶菌酶(Lysozyme)是一种有效的抗菌剂，能使细菌细胞壁内的不溶性多糖分解 成可溶性糖肽，细菌内容物逸出，使革兰氏阳性菌溶解。在生物体内环境中，由于有分泌型 免疫球蛋白A和补体参与，溶菌酶还能水解某些革兰阴性菌。同时溶菌酶也参与生物体内 的多种免疫反应，改善和增强巨噬细胞和白细胞的吞噬功能，从而增强机体的抵抗力。它还 能激活血小板功能，改善局部组织的血液循环障碍，起到止血、消肿、加快组织修复的作用。市面上溶菌酶作为化学药物有溶菌酶含片、溶菌酶肠溶胶囊等，其作用多是在消 化道中抗菌消炎，而不能通过肠道屏障进入血液循环，其体内的生物利用度很有限。鉴于溶 菌酶在体内的重要作用，为提高溶菌酶的血药浓度，目前已有溶菌酶的注射制剂申请专利， 可应用于治疗由耐药菌引起的各种炎症及感染性疾病。但注射给药不仅使病人的顺应性 差，而且频繁给药给病人造成很多不便。口服给药作为更安全、方便的给药途径长期以来被人们广泛关注，由于消化系统 对口服蛋白类药物的分解，使其体内吸收效率低下，而微球等药物载体能保护蛋白类药物 的稳定，使其不受蛋白酶的降解。众多研究表明载药微球具有良好的负载、控释等作用，还 有一定的靶向性。其中海藻酸钠微球因其天然高分子材料的特点，具有良好的生物相容性 和可生物降解性，适用于蛋白类药物的口服给药(Machluf M，0rsola A，Atala A，Contmlled release of therapeutic agents :slow delivery and cell encapsulation, World J. Urol, 2000,18 (1) =80-83.)。适合海藻酸钠微球制备的W/0乳化-离子交联法不仅制作 工艺简单，乳化及离子交联过程在室温下进行，而且不使用戊二醛等交联剂，更有利于蛋白 ML夕舌个生白勺## (N. H. Cho, S. Y. Seong, K. H. Chun, et al, Novel mucosal immunization with polysaccharide-protein conjugates entrapped in alginate microspheres, J.Controlled Release,1998，53 :215_224.)。为增加蛋白类药物的生物利用度，在药物口服后需保护其生物活性并促进胃肠道 对其的吸收。虽然药物载体能提高蛋白类药物的稳定性，但在肠道促进吸收方面仍需要各 类促进剂的辅助，才能真正提高蛋白类药物的血药浓度。目前的肠道吸收促进剂分为小分 子和聚合物两种，如中链脂肪酸钠盐、胆酸盐类、一氧化氮供体等为小分子类吸收促进剂， 而聚合物类吸收促进剂有壳聚糖、交联聚丙烯酸酯等。其中多数吸收促进剂的作用与其细 胞毒性高度相关，所以无毒而有效的肠道吸收促进剂是研究人员关注的焦点。中药作为我国中医的特有药物，从丰富的中药材中筛选获得与现有的肠道吸收促 进剂功能相同的药物，有望找到毒性小、安全性好的新型肠道吸收促进剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种中药杏仁作在溶菌酶海藻酸钠微球中作为肠道吸收促 进剂的应用。本发明的发明目的通过如下技术方案实现中药材——杏仁(Bitter Apricot Seed)，杏仁归属肺、脾、大肠经，在中医中起祛 痰止咳、平喘、润肠、下气开痹的功效。溶菌酶海藻酸钠微球按文献参考采用W/0乳化-离子交联法制备采用W/0乳 化-离子交联法制备溶菌酶微球，以含海藻酸钠和溶菌酶的溶液作为水相，以加入Span-80 的1-辛醇作为油相。将水相加入油相中，探针式超声2min，形成W/0乳剂。在磁力搅拌下， 缓慢滴加氯化钙(CaC12)溶液，滴加完毕后持续搅拌lOmin交联固化。最后用异丙醇洗涤 微球悬浊液，离心分离微球，真空干燥。选择海藻酸钠的浓度为5% (W/V)，溶菌酶的浓度为 1% (W/V)，果糖的浓度为2% (W/V)作为最佳制备工艺条件，制得的微球具有良好的分散性 和稳定性，其平均粒径为(9. 45 士 3. 1) y m,包封率为57.6%，载药量为7.2%，溶菌酶酶活 为原来的76. 1%.将中药杏仁按常规方法煎制得中药杏仁干重0.4g/ml的汤剂备用；中药杏仁与溶 菌酶海藻酸钠微球的质量比为14-28 1。本发明以海藻酸钠微球作为蛋白类药物溶菌酶的载体，通过实验证明了杏仁能明 显促进口服溶菌酶的肠道吸收，提高其生物利用度，并且长期服用该药物后使溶菌酶在体 内的停留时间延长至一周。本发明结果表明，小鼠仅口服溶菌酶溶液后其肠道吸收不足1 %，而小鼠连续口服 杏仁与溶菌酶微球4天后其溶菌酶的肠道吸收高达8 %，再次延长口服杏仁与溶菌酶微球 的时间至14天后小鼠对溶菌酶的肠道吸收超过11%，而且停止给药后7天内仍能在血液中 检测出溶菌酶。可见杏仁能大幅度促进溶菌酶海藻酸钠微球的肠道吸收。
图1为溶菌酶的间接竞争ELISA法标准曲线图；图2为溶菌酶海藻酸钠微球的光学显微镜图；图3为中药杏仁对溶菌酶海藻酸钠微球的肠道吸收促进作用图；图4中药杏仁对溶菌酶的药效动力学影响图(饲喂14天后停药)。
具体实施例方式下面结合附图1-图4进一步说明本发明是如何实现的。实施例1.称取杏仁4g(10只小鼠用量)用常规方法煎煮至10ml液体，离心取上清，每只 小鼠口服约1.0ml每次。2.使用间接竞争ELISA法对溶菌酶的血药浓度进行测定间接竞争ELISA法检测步骤如下①包被0. 5 u g/ml的溶菌酶包被酶标板，每孔加入100 yl，置4°C冰箱中过夜。②封闭每孔加入300 u 1封闭液，37°C温育2小时。
③竞争每孔加入不同浓度的溶菌酶标准液50 u 1和抗血清溶液50 u 1，充分混合 后37°C温育1小时。④二抗每孔加入HRP-羊抗兔IgG100iil，37°C温育1小时。⑤显色每孔加入底物显色液100iil，37°C温育20min。⑥终止每孔加入50 u 1终止液。⑦检测使用酶标仪在490nm处检测其吸光度。间接竞争ELISA法的线性范围为0. 1 y g/ml-30 u g/ml之间，回归方程为y =-0. 0702x+0. 716，线性相关度为0. 99，标准曲线参见图1。3.溶菌酶海藻酸钠微球的制备按文献参考采用W/0乳化-离子交联法进行 制备，其中加入适量果糖作为蛋白保护剂，制得的海藻酸钠微球为白色粉末，光学显微镜 检测(参见图2)呈圆形，表面光滑圆整，球体分散均勻，粘连少，不破损，微球的粒径在
5.6-13. 8 iim 之间，平均粒径为(9. 45士3. 1) ii m(n = 20)。4.杏仁对溶菌酶海藻酸钠微球的肠道吸收促进作用实验组小鼠同时口服杏仁汤剂8_16g/kg和溶菌酶海藻酸钠微球0. 56g/kg ；中药 对照组仅口服溶菌酶海藻酸钠微球0. 56g/kg ；实验对照组仅口服杏仁汤剂8-16g/kg，连续 口服4天后，根据该药物药效动力学曲线，选取8小时(血药浓度最高)眼眶取血，检测溶 菌酶的血药浓度，结果参见图3 实验组的溶菌酶血药浓度为(17. 18士5. 22) u g/ml,是实验对照组血药浓度的
6.53倍，可见溶菌酶的肠道吸收明显增加。按小鼠总血量5ml计，经肠道吸收的溶菌酶总量 为85. 90 y g，生物利用度最高达到8. 59%，较实验对照组仅为左右的生物利用度，有了 明显的提高。5.杏仁对溶菌酶的药效动力学影响(饲喂14天后停药)因常规中药汤剂以一至两周为疗程，为进一步研究杏仁对溶菌酶的肠道吸收和体 内有效时间的维持，各组小鼠喂药连续14天，停药后8小时以及隔日取血，检测溶菌酶的血 药浓度，考察杏仁对溶菌酶的药效动力学影响，结果参见图4 实验组停药后8小时后溶菌酶血药浓度为(24. 75士 1. 06) u g/ml，按小鼠总血量 5ml计，经肠道吸收的溶菌酶总量为123. 75 ug,比实施例一中实验组的生物利用度提高了 3. 79%，可见适当延长服药周期，可能更有利于中药作用的发挥，可以提高溶菌酶的肠道吸 收。实验对照组小鼠停药24小时后血药浓度为3. 6 ii g/ml，48小时后接近于0 ；而实 验组的血药浓度在停药24小时后血药浓度为14. 55 u g/ml, 48小时后仍有6. 75 y g/ml，而 且在之后的3 7天内实验组的血药浓度在(3. 4 1. 9) y g/ml之间，是原吸收最大值的 20%左右，可见较长时间的连续服药后小鼠体内溶菌酶的停留时间有所延长，可能是药物 的累加作用使溶菌酶在小鼠体内维持了 一段时间。6.血液中溶菌酶的生物活性为验证口服溶菌酶海藻酸钠微球后经肠道吸收的溶菌酶是否仍保持其生物活性， 以实施例二中各组小鼠停药后8小时的血清检测其酶活，采用溶菌酶微球菌比浊法进行检 测，以其水解溶壁微球菌(Micrococcus luteus)的速度计算血清中溶菌酶的比活，结果如 表1所示
表1各组小鼠的溶菌酶血药浓度及比活
组别溶菌酶血药浓度(11溶菌酶的比活溶菌酶的活性保存g/ml)(U/wg)率实验组24. 75±1. 061683. 567. 34%中药对照组4. 75±3. 841681. 567.26%实验对照组5. 05±0. 932437. 597.50%*标准溶菌酶的比活为2500U/mg。实验组和中药对照组的溶菌酶生物活性有所损失，通过微球形式吸收的溶菌酶生 物活性的保存约为原来的67%左右，这与微球的制备工艺有关，使溶菌酶在装载微球的过 程中损伤了一部分的蛋白活性，但大部分的溶菌酶活性得以保存，并且以较高的肠道吸收 率进入体内。
权利要求
中药杏仁在溶菌酶海藻酸钠微球中的应用，其特征在于将中药杏仁按常规方法煎制得中药杏仁干重0.4g/ml的汤剂备用；采用W/O乳化 离子交联法制备溶菌酶海藻酸钠微球，使用时，中药杏仁与溶菌酶海藻酸钠微球的质量比为14 28∶1。
2.根据权利要求1所述的中药杏仁在溶菌酶海藻酸钠微球中的应用，其特征在于优 化制备工艺条件后制得的溶菌酶海藻酸钠微球的平均粒径为(9. 45士3. 1) ym，包封率为 57.6%，载药量为7.2%，溶菌酶酶活为原来的76. 1%。
全文摘要
本发明涉及中药杏仁在菌酶海藻酸钠微球中作为肠道吸收促进剂的应用，将中药杏仁按常规方法煎制得中药杏仁干重0.4g/ml的汤剂备用；采用W/O乳化-离子交联法制备溶菌酶海藻酸钠微球，使用时，中药杏仁与溶菌酶海藻酸钠微球的质量比为14-28∶1。中药杏仁能明显促进溶菌酶海藻酸钠微球的口服吸收，大幅度提高溶菌酶海藻酸钠微球的肠道吸收效率，提高溶菌酶的血药浓度。并且溶菌酶在体内保持良好的生物活性，能较好的行使其生物学功能。
文档编号A61P7/04GK101947315SQ20101027332
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者沈彦萍, 沈文婧, 陈宇光 申请人:上海沈李科工贸有限公司