专利名称：中药神曲在壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药神曲作为肠道吸收促进剂的新用途，特别是神曲在壳聚糖包覆的 溶菌酶脂质体的肠道吸收促进剂的应用。
背景技术：
溶菌酶(Lysozyme)，化学名称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，又称胞壁质酶，能切 断N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β -1，4糖苷键，破坏肽聚糖支架，在内部渗 透压的作用下使细胞胀裂开，具有溶解革兰氏阳性菌细胞壁的能力，是一种碱性的粘多糖 水解酶。而且溶菌酶作为一种重要的非特异性免疫因子，在体内具有抗菌消炎、免疫调节及 加快组织修复等多种功能(Tenovuo J. ,Clinical applications of antimicrobial host proteins lactoperoxidase lysozyme and lactoferrin in xerostomia :efficacy and safety, Oral Dis.，2002，8 (1) -.23-29.) 溶菌酶作为药物以含片、粉剂和肠溶胶囊为主，多作用于胃肠道等组织，或作为体 外用药，其体内吸收效率低下，生物利用度也很有限。为提高溶菌酶的血药浓度，改变口服 药物的剂型可能克服影响溶菌酶口服吸收的各种因素。研究人员对蛋白类药物的口服吸收给予广泛关注，其中最普遍、有效的方法就是 将药物微囊化处理。脂质体是一项比较成熟的药物载体技术，能避免内容物被氧化、降解， 或被人体的酸或酶破坏，而且与细胞有一定的亲和性，可增加药物透过细胞膜的能力。作为 药物载体，脂质体在体内具有一定的靶向性和药物缓释作用，能更有效并长时间的发挥药 效。而且脂质体膜材与哺乳动物细胞相似，由磷脂等组成，不会引起局部组织损伤，不诱发 过敏反应而能多次长期使用，对人体无毒、安全。有研究发现生物黏附性的给药系统能延长药物在吸收部位的停留时间，有助 于药物的吸收(Thanou M.，Verhoef J. C.，Junginger H. E.，Oral drug absorption enhancement by chitosan and its derivatives, Adv. Drug Deliv. Rev.，2001，52 117-126.)，壳聚糖是具有良好的生物相容性和较强的生物粘附性的多糖，作为药物载体的 材料有助于药物的吸收，其原因可能是膜上生物黏附和紧密连接的瞬间展开。因此以壳聚 糖包覆脂质体可进一步促进溶菌酶的吸收。为了更进一步促进溶菌酶的吸收，希望找到毒性小、安全性好的肠道吸收促进剂， 中药作为我国中医的特有药物，可以从丰富的中药材中筛选获得与现有的肠道吸收促进剂 功能相同的药物，促进溶菌酶的吸收。
发明内容
本发明的目的是提供一种中药神曲作为壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的肠道吸收 促进剂的应用。本发明的发明目的是通过如下技术方案实现的。将中药神曲按常规方法煎制得中药干重0. 6g/ml的汤剂；采用薄膜法制备壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体，制得的壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的载药量为5. 46mg/ml，使用时， 中药神曲与壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的体积比为15 1-5 3。所述壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体按文献参考采用薄膜法制备，将磷脂混合物和 维生素E溶于适量无水乙醚，水浴超声溶解。将溶液在旋转蒸发仪上减压蒸除有机试剂， 直至干燥脂质膜沉淀在瓶壁上，继续抽吸IOmin后停止。加入溶菌酶溶液继续旋转3小 时，探针式超声lmin，形成溶菌酶脂质体溶液。在磁力搅拌的作用下，缓慢滴加壳聚糖溶 液，10°C孵育1小时以上。选择卵磷脂胆固醇为4 1(W/W)，溶菌酶磷脂混合物为 1 6. 25 (W/W)作为最佳制备工艺条件，制得的微球具有良好的分散性和稳定性，其平均 粒径为(61.57士13.2)歷，包封率为81.9%，载药量为5. 46mg/ml，溶菌酶酶活为原来的 87. 9%。中药材——神曲(Medicated Leaven)，归属脾、胃经，在中医中起健脾和胃、消食 化积的功效。本发明以壳聚糖包覆的脂质体作为蛋白类药物溶菌酶的载体，通过实验证明了神 曲能明显促进口服溶菌酶的肠道吸收，提高其生物利用度，并且长期服用该药物后使溶菌 酶在体内的停留时间延长至一周以上。本发明结果表明，小鼠仅口服溶菌酶溶液后其肠道吸收不足1 %，而小鼠连续口服 神曲与溶菌酶脂质体4天后其溶菌酶的肠道吸收高达9%，再次延长口服神曲与溶菌酶脂 质体的时间至14天后小鼠对溶菌酶的肠道吸收超过13%，而且停止给药后9天内仍能在血 液中检测出溶菌酶。可见神曲能大幅度促进壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的肠道吸收。
图1溶菌酶的间接竞争ELISA法标准曲线；图2壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的透射电镜图；图3神曲对壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的肠道吸收促进作用；图4神曲和脂质体对溶菌酶的药效动力学影响图(饲喂14天后停药)。
具体实施例方式下面结合附图1-图4进一步说明本发明是如何实现的。实施例1.称取神曲6g(10只小鼠用量)用常规方法煎煮至IOml液体，离心取上清，每只 小鼠口服约1.0ml每次。2.使用间接竞争ELISA法对溶菌酶的血药浓度进行测定间接竞争ELISA法检测步骤如下①包被0. 5 μ g/ml的溶菌酶包被酶标板，每孔加入100 μ 1，置4°C冰箱中过夜。②封闭每孔加入300 μ 1封闭液，37°C温育2小时。③竞争每孔加入不同浓度的溶菌酶标准液50 μ 1和抗血清溶液50 μ 1，充分混合 后37°C温育1小时。④二抗每孔加入HRP-羊抗兔IgGlOOy 1，37°C温育1小时。⑤显色每孔加入底物显色液100μ 1，37°C温育20min。
⑥终止每孔加入50 μ 1终止液。⑦检测使用酶标仪在490nm处检测其吸光度。间接竞争ELISA法的线性范围为0. 1 μ g/ml-30 μ g/ml之间，回归方程为y =-0. 0702x+0. 716，线性相关度为0. 99，标准曲线参见图1。3.壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的制备按文献参考采用薄膜法进行制备，并用
0.2%的壳聚糖进行孵育包覆，制得的脂质体为乳白色混悬液，透射电镜检测(参见图2) 呈圆形，球体分散均勻，脂质体的粒径在52-80nm之间，平均粒径为(61. 57 士 13. 2)nm(n = 100)。4.神曲对壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的肠道吸收促进作用实验组小鼠同时口服神曲汤剂20_60ml/kg和壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体 4-12ml/kg ；中药对照组仅口服壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体8ml/kg ；实验对照组仅口服服 神曲汤40ml/kg，连续口服4天后，根据该药物药效动力学曲线，选取4小时(血药浓度最 高)眼眶取血，检测溶菌酶的血药浓度，结果参见图3 实验组的溶菌酶血药浓度为(19. 33士5. 55) μ g/ml,是实验对照组血药浓度的 7. 95倍，可见溶菌酶的肠道吸收明显增加。按小鼠总血量5ml计，经肠道吸收的溶菌酶总量 为96. 65 μ g，生物利用度最高达到9. 67%，较实验对照组仅为1 %左右的生物利用度，有了 明显的提高。而中药对照组的血药浓度为(4. 28士0.39) μ g/ml，是实验对照组血药浓度的
1.7倍，可见脂质体作为药物载体在一定程度上也能促进溶菌酶的肠道吸收。5.神曲和脂质体对溶菌酶的药效动力学影响(饲喂14天后停药)因常规中药汤剂以一至两周为疗程，为进一步研究神曲对溶菌酶的肠道吸收和体 内有效时间的维持，各组小鼠喂药连续14天，停药后4小时以及隔日取血，检测溶菌酶的血 药浓度，考察神曲对溶菌酶的药效动力学影响，结果参见图4 实验组停药后4小时后溶菌酶血药浓度为(27. 50士3. 54) μ g/ml，按小鼠总血量 5ml计，经肠道吸收的溶菌酶总量为137. 5 μ g，比实施例一中实验组的生物利用度提高了 4. 09%，可见适当延长服药周期，可能更有利于中药作用的发挥，可以提高溶菌酶的肠道吸 收。实验对照组小鼠停药24小时后血药浓度从6. 5 μ g/ml下降为2. 25 μ g/ml，48小 时后为1. 65 μ g/ml，其后一直持续到停药后第5天仍能在血液中检测出微量的溶菌酶，可 见在脂质体的保护下能一定程度上延长溶菌酶的体内停留时间。而实验组的血药浓度在停 药24小时后血药浓度为13. 35 μ g/ml，48小时后仍有6. 25 μ g/ml，而且在之后的3 9天 内实验组的血药浓度在(4. 39 2. 43) μ g/ml之间，是原吸收最大值的15%左右，可见神曲 能进一步延长溶菌酶在体内的停留时间，并维持较平稳的血药浓度。6.血液中溶菌酶的生物活性为验证口服壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体后经肠道吸收的溶菌酶是否仍保持其生 物活性，以实施例二中各组小鼠停药后4小时的血清检测其酶活，采用溶菌酶微球菌比浊 法进行检测，以其水解溶壁微球菌(Micrococcus luteus)的速度计算血清中溶菌酶的比 活，结果如表1所示表1各组小鼠的溶菌酶血药浓度及比活
权利要求
中药神曲在壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体中的应用，其特征在于将中药神曲按常规方法煎制得中药干重0.6g/ml的汤剂；采用薄膜法制备壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体，制得的壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的载药量为5.46mg/ml，使用时，中药神曲与壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的体积比为15∶1 5∶3。
2.根据权利要求1所述的中药神曲在壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体中的应用，其特征在 于优化制备工艺条件后制得的壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的载药量为5. 46mg/ml，溶菌 酶酶活为原来的87. 9%，平均粒径为(61. 57士 13. 2)nm，包封率为81. 9%。
全文摘要
本发明涉及一种中药神曲的新用途，尤其涉及一种中药神曲在壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体中的应用。将中药神曲按常规方法煎制得中药干重0.6g/ml的汤剂；采用薄膜法制备壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体，制得的壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的载药量为5.46mg/ml，使用时，中药神曲与壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的体积比为15∶1-5∶3。神曲能明显促进壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的口服吸收，大幅度提高壳聚糖包覆的溶菌酶脂质体的肠道吸收效率，提高溶菌酶的血药浓度。并且溶菌酶在体内保持良好的生物活性，能较好的行使其生物学功能。本发明对中药神曲和壳聚糖包覆的脂质体挖掘了新的医药用途，有很好的药用前景。
文档编号A61K36/00GK101933949SQ201010273320
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者沈彦萍, 沈文婧, 陈宇光 申请人:上海沈李科工贸有限公司