专利名称：一种具有抗肿瘤活性的翠绿针毛蕨总黄酮制备方法及其含量测定方法
技术领域：
本发明涉及一种植物药提取的具有抗肿瘤活性的总黄酮，具体涉及翠绿针毛蕨总 黄酮及其制备方法，以及该总黄酮的含量测定方法。
背景技术：
黄酮类化合物广泛存在于自然界，是一类重要的天然有机化合物，一般分为黄 酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、花色素、查耳酮、双黄酮、异黄酮等。黄酮类化合物生物 活性多种多样，如对心血管的作用，抗病毒作用，抗炎作用等，其中黄酮类化合物的抗肿瘤 作用日益受到广泛关注。恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病，药物治疗在恶 性肿瘤疗法中占有重要的地位，其中从中草药中发现新的具有抗肿瘤活性的物质是一个重 要的研究方向。翠绿针毛蕨(Macrothelypteris viridifrons (Tagawa) Ching)为金星蕨科 (Thelypteridaceae)针毛蕨属(Macrothelypteris)植物，又名假普通针毛蕨。植株高60 1 IOcm,根状茎短而直立，先端被红棕色，具毛的披针形鳞片。叶簇生；叶柄长30 50cm，禾 秆色，基部被灰白色的短针毛，向上光滑；叶片几与叶柄等长或略长，四回羽裂；羽片10 12对，互生或近对生，斜上，柄长11. 5 5cm，基部一对最大，长圆批针形，渐尖头，基部略变 狭，圆截形，第二对起向上的羽片和基部一对同行，但基部不变狭，渐次缩小，具短柄，三回 羽裂；一回小羽片10 15对，互生，平展，二回羽裂；叶脉可见，侧脉单一，斜上，每裂片2 3对。叶为薄草质，干后草绿色，下面被较多的、长约1mm，开展的针状毛，上面沿小羽轴有较 多的短针毛，叶轴禾秆色，下面光滑，有光泽。孢子囊群小，圆形，每裂片1 2枚，生于基部 侧脉的近顶端；囊群盖小，圆肾形，绿色，膜质，背面略有1 2根长柔毛，成熟后不见。孢子 圆肾形，周壁表面具较烯的小刺状和小穴状纹饰。广泛分布于长江以南各省，常见。本课题 组通过对翠绿针毛蕨的化学成分进行研究得知该植物中含有大量类黄酮化合物，由于该类 黄酮化合物有着非苯环的特殊B环结构，常用的的亚硝酸钠_硝酸铝等比色法不适用于该 类黄酮的含量测定。本发明涉及的翠绿针毛蕨总黄酮是从金星蕨科针毛蕨属植物翠绿针毛蕨 (Macrothelypteris viridifrons (Tagawa) Ching)的干燥全草中提取纯化得到的抗肿瘤有 效部位，试验证明该有效部位对各种肿瘤细胞具有明显的杀伤作用，体现了明显的抗肿瘤 作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤作用的翠绿针毛蕨总黄酮及其制备方法；本发明的另一个目的是提供准确简便的翠绿针毛蕨总黄酮含量测定方法。实现本发明的技术方案是本发明提供的具有抗肿瘤活性的翠绿针毛蕨总黄酮，是以翠绿针毛蕨干燥全草为
4原料，按以下方法提取得到的产物a.以翠绿针毛蕨干燥全草为原料，将其洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得翠绿针毛 蕨原料粗粉；b.将翠绿针毛蕨原料粗粉用乙醇、甲醇、60 90%含水乙醇、60 90%含水甲醇 为提取溶剂，加热至70 90°C提取，所用有机溶剂量与翠绿针毛蕨原料粗粉重量比为6 15 1，重复提取1 3次，除去药渣，滤液在减压条件下浓缩干燥得翠绿针毛蕨浸膏；C.将所得翠绿针毛蕨浸膏超声溶解于蒸馏水中，用3 5倍量的石油醚萃取2 3次，合并水层，水层以碱溶液调PH值至5 7，优选PH值为6，过滤，得翠绿针毛蕨滤液；d.将所得翠绿针毛蕨滤液以酸溶液调PH值至1 2，放置于4°C冰箱下过夜，次 日过滤，滤液放置待用，所得沉淀用蒸馏水洗至中性，真空干燥即得翠绿针毛蕨碱提酸沉黄 酮；e.将上述步骤d中所述的滤液用大孔树脂吸附，以蒸馏水洗脱水溶性物质，再以 50 70%的含水乙醇进行洗脱，洗脱液在减压条件下回收溶剂，浓缩干燥，即得翠绿针毛 蕨大孔树脂黄酮；f.合并上述翠绿针毛蕨碱提酸沉黄酮和大孔树脂黄酮，即得翠绿针毛蕨总黄酮。上述步骤c中所述的用以调PH值的碱溶液是氢氧化钠或氨水。上述步骤d中所述的用以调PH值的酸溶液是浓盐酸或浓硫酸。本发明制备翠绿针毛蕨总黄酮的方法简便，且重现性好，产品得率高。本发明提供的具有抗肿瘤作用的翠绿针毛蕨总黄酮的药效如下(1)体外抗肿瘤活性将本发明提取纯化所得翠绿针毛蕨提取物配制成四个浓度 梯度的含药培养基，以相同的方法配制阳性对照药五氟尿嘧啶，选用传代后处于对数生长 期的H印G2、Tca-8113、MCF-7、M5、K562肿瘤细胞株，采用MTT法对翠绿针毛蕨总黄酮进 行体外抗肿瘤活性研究，结果显示翠绿针毛蕨提取物对各种肿瘤细胞均显示较强的细胞毒 性，且毒性与剂量成正比，IC50值均与五氟尿嘧啶相当。(2)体内抗肿瘤活性采用移植肿瘤S18tl荷瘤小鼠，以本发明提取纯化所得翠绿针 毛蕨总黄酮按一定剂量灌胃给药，阳性对照组为五氟尿嘧啶，阴性对照组为生理盐水等容 量给药，每日2次，连用10天，结果显示翠绿针毛蕨提取物具有明显的抑制肿瘤作用，且抑 瘤率与给药剂量成正比。实验证明本发明提供的翠绿针毛蕨总黄酮具有较强的体内外抗肿瘤作用。因翠绿针毛蕨中所含黄酮有着非苯环的特殊B环结构(类黄酮)，不具有黄酮的特 征显色反应，本发明提供的翠绿针毛蕨总黄酮含量测定方法由以下方式来实现(1)将纯度大于98%的原芹菜素(该化合物有着非苯环的特殊B环结构)做为对 照品，用甲醇配制成梯度的标准溶液，在262nm波长下，分别测定标准溶液的吸光度值，根 据吸光度值和对应的浓度建立标准曲线；(2)将翠绿针毛蕨提取物用甲醇溶解配制成待测溶液，在262nm波长下测吸光度， 根据所得吸光度值由标准曲线计算出待测溶液浓度，然后根据稀释倍数换算成翠绿针毛蕨 提取物中总黄酮的含量。本发明操作简单，稳定性、重复性好，易于控制。
具体实施例方式实施例1本发明提供的具有抗肿瘤活性的翠绿针毛蕨总黄酮的制备(1)原料的制备以翠绿针毛蕨(2009年10月采白江西九江，经九江森林植物标本 馆谭策铭研究员鉴定为蕨类植物门金星蕨科针毛蕨属植物翠绿针毛蕨(Macrothelypteris viridifrons(Tagawa)Ching)的干燥全草为原料，将其洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得翠绿 针毛蕨原料粗粉待用；(2)溶剂提取将翠绿针毛蕨原料粗粉用有机溶剂乙醇、甲醇、60 90%含水乙醇 或60 90%含水甲醇为提取，加热至70 90°C提取，所用溶剂量与翠绿针毛蕨粗粉重量 比为6 15 1，重复提取1 3次，合并滤液，除去药渣，滤液在减压条件下浓缩干燥得翠 绿针毛蕨浸膏；(3)碱溶将上述翠绿针毛蕨浸膏，超声溶解于蒸馏水中，用3 5倍量的石油醚 萃取2 3次，合并水层，水层以碱溶液(如氢氧化钠，氨水)调PH值至5 7，以6最佳， 沉淀滤除，得翠绿针毛蕨滤液；(5)酸沉将上述翠绿针毛蕨滤液以酸溶液(如浓盐酸)调PH值至1 2，放置于 4°C冰箱下过夜，次日过滤，滤液留着待用，沉淀用蒸馏水洗至中性，真空干燥即得翠绿针毛 蕨碱提酸沉黄酮；(6)将上述酸沉后滤液选取几种不同极性的大孔树脂做静态吸附实验，得到纯化 翠绿针毛蕨黄酮的最优树脂，以最优树脂做动态吸附试验，单独考察乙醇洗脱剂浓度，上样 液PH值，上样液浓度，饱和上样量，并正交设计考察吸附流速，水洗体积，洗脱剂体积和洗 脱流速，根据本发明的总黄酮含量测定方法计算得率和纯度，得出最佳翠绿针毛蕨黄酮纯 化工艺；(7)依据上述翠绿针毛蕨黄酮大孔树脂纯化工艺将翠绿针毛蕨酸沉后滤液进行 大孔树脂交换，洗脱液在减压条件下回收乙醇溶剂，浓缩干燥即得翠绿针毛蕨大孔树脂黄 酮；(8)合并上述所得翠绿针毛蕨碱提酸沉黄酮和大孔树脂黄酮，即得翠绿针毛蕨总 黄酮，含量为50 60% ；实施例2取翠绿针毛蕨干燥全草，粉碎，过蹄，加入10倍体积的70 %乙醇，90°C回流提取 60min。重复提取两次，合并提取液，减压浓缩回收溶剂，真空干燥得总浸膏。称取一定量 总浸膏加蒸馏水超声溶解，用三倍量的石油醚萃取2次，合并水层，水层用15%氢氧化钠调 PH至6，过滤，沉淀滤除，滤液以浓盐酸调PH值至1，放置于4°C冰箱过夜，次日过滤，所得沉 淀用蒸馏水洗至中性，真空干燥即得翠绿针毛蕨碱提酸沉黄酮。剩余滤液以氢氧化钠调PH 至4后，进行大孔树脂吸附。按照饱和吸附量140mg/g干树脂，称取一定量HPD500树脂，以 上样液浓度为3. 73mg/ml，吸附流速为lml/min，水洗体积为5倍柱体积，洗脱剂乙醇浓度为 50%，洗脱剂体积为3倍柱体积，洗脱流速为lml/min进行总黄酮的纯化，合并洗脱液，减压 浓缩，真空干燥即得翠绿针毛蕨大孔树黄酮，合并翠绿针毛蕨碱提酸沉黄酮和大孔树脂黄 酮，所得翠绿针毛蕨总黄酮纯度为54%。实施例3
本发明方法翠绿针毛蕨总黄酮对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用传代后处于对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7吹打分散于含10%灭活小牛血清 的培养基中，倒置显微镜下用细胞计数板测定浓度并调整到2X 105cellS/mL。在96孔板中 每孔加入该细胞悬液100μ L，于37°C 5% CO2的培养箱中培养24h。加入灭菌的含有样品 的培养液溶液100 μ L，使样品终浓度分别为0. 1，1. 0，10. 0，100. 0 μ g/mL。继续于37°C 5% CO2的培养箱中培养48h。之后每孔加入10 μ L5mg/mL的MTT溶液继续培养4h。小心吸除 细胞液，每孔加入DMSO 200 μ L以溶解生成的甲臢，并在细胞板振荡仪上振荡IOmin后用酶 标仪在570nm处测定OD值，计算IC5tl值。结果显示，抑制率与药物浓度呈正比，总黄酮的 IC50值(3. 75士0. 23 μ g/mL)低于五氟尿嘧啶(6. 66士0. 16 μ g/mL)，表明翠绿针毛蕨总黄酮 对人乳腺癌细胞MCF-7有明显的抑制作用。实施例3翠绿针毛蕨总黄酮对人肝癌细胞Hep G2的抑制作用采用同实施例2类似的方法，进行翠绿针毛蕨总黄酮对人肝癌细胞Hep G2的抑制 作用研究，结果显示，总黄酮IC5tl值(4. 11 士 0. 14 μ g/mL)低于五氟尿嘧啶(6. 08 士 0. 27 μ g/ mL)，表明翠绿针毛蕨总黄酮对人肝癌细胞H印G2同样具有很强的抑制作用。
权利要求
一种具有抗肿瘤活性的翠绿针毛蕨总黄酮的含量测定方法，包括以下步骤(1)将纯度在98％以上的原芹菜素做为对照品，用甲醇配制成梯度的标准溶液，在262nm波长下，分别测定标准溶液的吸光度值，根据吸光度值和对应的浓度建立标准曲线；(2)将翠绿针毛蕨提取物用甲醇溶解配制成待测溶液，在262nm波长下测吸光度，根据所得吸光度值由标准曲线计算出待测溶液浓度，然后根据稀释倍数换算成翠绿针毛蕨提取物中总黄酮的含量。
2.一种具有抗肿瘤活性的翠绿针毛蕨总黄酮提取工艺，包括如下步骤a.以翠绿针毛蕨干燥全草为原料，将其洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得翠绿针毛蕨原 料粗粉；b.将翠绿针毛蕨原料粗粉用乙醇、甲醇、60 90%含水乙醇、60 90%含水甲醇为 提取溶剂，加热至70 90°C提取，所用有机溶剂量与翠绿针毛蕨原料粗粉重量比为6 15 1，重复提取1 3次，除去药渣，滤液在减压条件下浓缩干燥得翠绿针毛蕨浸膏；c.将所得翠绿针毛蕨浸膏超声溶解于蒸馏水中，用3 5倍量的石油醚萃取2 3次， 合并水层，水层以碱溶液调PH值至5 7，优选PH值为6，过滤，得翠绿针毛蕨滤液；d.将所得翠绿针毛蕨滤液以酸溶液调PH值至1 2，放置于4°C冰箱下过夜，次日过 滤，滤液放置待用，所得沉淀用蒸馏水洗至中性，真空干燥即得翠绿针毛蕨碱提酸沉黄酮；e.将上述步骤d中所述的滤液用大孔树脂吸附，以蒸馏水洗脱水溶性物质，再以50 70%的含水乙醇进行洗脱，洗脱液在减压条件下回收溶剂，浓缩干燥，即得翠绿针毛蕨大孔 树脂黄酮；f.合并上述翠绿针毛蕨碱提酸沉黄酮和大孔树脂黄酮，即得翠绿针毛蕨总黄酮。
3.根据权利要求2所述的提取工艺，其特征在于，步骤c中所述的用以调PH值的碱溶 液是氢氧化钠或氨水。
4.根据权利要求2所述的提取工艺，其特征在于，步骤d中所述的用以调PH值的酸溶 液是浓盐酸或浓硫酸。
5.一种具有抗肿瘤活性的翠绿针毛蕨总黄酮，其特征在于，它是以翠绿针毛蕨干燥全 草为原料，按以下方法提取得到的产物a.以翠绿针毛蕨干燥全草为原料，将其洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得翠绿针毛蕨原 料粗粉；b.将翠绿针毛蕨原料粗粉用乙醇、甲醇、60 90%含水乙醇、60 90%含水甲醇为 提取溶剂，加热至70 90°C提取，所用有机溶剂量与翠绿针毛蕨原料粗粉重量比为6 15 1，重复提取1 3次，除去药渣，滤液在减压条件下浓缩干燥得翠绿针毛蕨浸膏；c.将所得翠绿针毛蕨浸膏超声溶解于蒸馏水中，用3 5倍量的石油醚萃取2 3次， 合并水层，水层以碱溶液调PH值至5 7，优选PH值为6，过滤，得翠绿针毛蕨滤液；d.将所得翠绿针毛蕨滤液以酸溶液调PH值至1 2，放置于4°C冰箱下过夜，次日过 滤，滤液放置待用，所得沉淀用蒸馏水洗至中性，真空干燥即得翠绿针毛蕨碱提酸沉黄酮；e.将上述步骤d中所述的滤液用大孔树脂吸附，以蒸馏水洗脱水溶性物质，再以50 70%的含水乙醇进行洗脱，洗脱液在减压条件下回收溶剂，浓缩干燥，即得翠绿针毛蕨大孔 树脂黄酮；f.合并上述翠绿针毛蕨碱提酸沉黄酮和大孔树脂黄酮，即得翠绿针毛蕨总黄酮。
6.根据权利要求5所述的具有抗肿瘤活性的翠绿针毛蕨总黄酮，其特征在于，步骤c中 所述的用以调ra值的碱溶液是氢氧化钠或氨水。
7.根据权利要求5所述的具有抗肿瘤活性的翠绿针毛蕨总黄酮，其特征在于，步骤d中 所述的用以调ra值的酸溶液是浓盐酸或浓硫酸。
全文摘要
本发明提供了一种具有抗肿瘤作用的翠绿针毛蕨总黄酮及其制备方法，同时还提供了翠绿针毛蕨总黄酮含量测定方法。本发明提供的具有抗肿瘤活性的总黄酮是从植物翠绿针毛蕨干燥全草经溶剂提取、碱提酸沉处理及大孔树脂纯化得到，其主要成分是类黄酮化合物，有着非苯环的特殊B环结构，常规的总黄酮含量测定方法不适用，本发明制定了简便易行的翠绿针毛蕨总黄酮含量测定方法，并优化了翠绿针毛蕨总黄酮的提取纯化工艺，最终得到的翠绿针毛蕨总黄酮具有明显的抗肿瘤活性。本发明提供的翠绿针毛蕨总黄酮含量测定方法有利于翠绿针毛蕨资源的质量控制和有效利用，应用前景广阔。
文档编号A61P35/00GK101966207SQ201010518809
公开日2011年2月9日 申请日期2010年10月25日 优先权日2010年10月25日
发明者吴光华, 熊朝梅, 阮金兰, 魏安华 申请人:华中科技大学