用于基于亚单位的痘病毒疫苗的包含痘病毒衍生肽和针对抗原呈递细胞的抗体的免疫偶联物的制作方法

专利名称：用于基于亚单位的痘病毒疫苗的包含痘病毒衍生肽和针对抗原呈递细胞的抗体的免疫偶联物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗和/或预防痘病毒感染(包括但不限于天花)的基于亚单位的疫苗的设计、产生和应用。在优选实施方案中，疫苗包含来自一种或多种病毒蛋白的亚单位抗原肽的免疫偶联物。在更优选实施方案中，病毒蛋白是免疫调节因子，如病毒IL-18结合蛋白(VIL18BP)，但是可使用替代病毒蛋白，如病毒包膜蛋白。在其它替代实施方案中，基于亚单位的疫苗可能包含来自一种以上病毒蛋白(如免疫调节因子和包膜蛋白)的抗原肽的组合。病毒抗原肽连接到抗体或其抗原结合片段，从而将所述亚单位靶向输送到抗原产生细胞(APC)。在最优选的实施方案中，基于亚单位的疫苗并有针对HLA-DR抗原的抗体或抗体片段，如L243抗体；但是本领域技术人员会意识到其它APC靶向抗体是已知的，并且可以使用。免疫偶联物的使用提供大幅增加的免疫原性和对病毒抗原的改进的免疫系统反应，同时避免接触活病毒疫苗的免疫力低下的个体感染的可能性。优选地，基于亚单位的疫苗在体内有效地诱导对天花和/或其它痘病毒的免疫性，并且防止受其感染。相关技术具有交叉反应抗原的一组复合病毒即正痘病毒包括牛痘病毒(VV)、猴痘病毒和引起天花(痘疮，VAR)的病毒。天花已不再是一种自然发生的传染病，它已被持续到1978年为止的一个大规模的免疫规划所消灭，从那时起世界人口的例行性疫苗接种停止(Minor，2002, British Med J 62 213-224) 0当时，剩余的病毒原液存放于美国和前苏联。最近出现的生物恐怖主义的威胁、最近爆发的猴痘(⑶C MMWR2003)，和尤其在全世界据估计只有不到一半的人口进行接种的情况下天花病的致命性质，重新激起了对于研制针对VAR或此病毒家族的其它危险成员的疫苗保护的关注。采用活性VV的天花疫苗目前代表针对天花进行免疫的最有效的手段(Rosenthal等，2001，Emerg. Infect. Dis. 7 =920-926) 0这种疫苗产生短暂的病毒血症，它在大多数个体中得以消退，并留下长久的免疫力。然而，这种疫苗也由于包括全身性病毒血症和死亡的严重不良反应而引起安全问题(He等，2007，JID 196 =1026-1032 ；Rosenthal等，2001)。因此，如果客观形势要求进行人口免疫，就必须开发替代接种策略。替代疫苗的几种方法已经尝试过，或正在开发中。具有缺失或突变基因的减毒痘病毒形式，如 Akhara 改良牛痘(MVA) (Grandpre 等，Vaccine 27 1549-56，2009)，可赋予针对痘病毒的强毒株的部分免疫力。用灭活病毒进行的免疫已得到研究，但它并没有赋予与活病毒相同程度的保护；无论使用哪一种灭活方法，都需要多IO3-IO4个单位的灭活病毒来保护小鼠免受激发影响(Turner等1970，J Hyg. Camb68 197-210)。这一事实意味着，用活性病毒进行免疫所获得的保护包括非活性病毒不能够产生或在非活性病毒中不存在的因子。痘病毒产生一系列分泌性宿主免疫反应修饰因子，其会中和掉宿主细胞因子和先天防御机制。通过削弱宿主的第一道防线，病毒可能能够建立感染(如在粘膜中)，并在宿主细胞内开始第一阶段的感染性复制。存在对于针对痘病毒(如天花)的疫苗的需要，所述疫苗比灭活病毒更有效，但可避免活病毒疫苗所出现的安全性问题。发明概述本发明公开了针对痘病毒(如天花)的亚单位疫苗的改进的组合物和其使用方法。在优选实施方案中，该疫苗包含一个或多个亚单位抗原肽与结合抗原呈递细胞(APC)，如树突状细胞(DC)的抗体或抗体片段偶联以形成免疫偶联物。向受试者施用疫苗可诱导对痘病毒的免疫力，并且有效地预防或治疗痘病毒感染。任选地，该疫苗可能并有一种或多种佐剂，如氢氧化铝、CpG DNA、磷酸钙或基于细菌的佐剂(例如，德氏保加利亚乳杆菌(L. delbroeckii/bulgaricus))。VV和VAR都产生的一种宿主免疫调节因子是病毒白细胞介素18结合蛋白(vIL18BP,牛痘病毒C12L基因)。和其它病毒宿主防御调节因子一样，该基因在感染的早期阶段表达，它通过中和掉关键促炎性细胞因子IL-18来削弱宿主免疫力，所述促炎性细胞因子刺激NK、⑶8和Thl⑶4细胞产生干扰素-Y (IFN)，它进而活化抗原呈递细胞(APC)和其它细胞，并且引导对Thl类型的免疫反应(Born等，2000，J. Immunol. 164 =3246-3254 ；Scott,1991,J Immunol147 :3149-3155 ；Pien等，2002，· Immunol. 169 :5827-5837 ；Xiang和Moss, 1999，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :11537-11542)。在优选实施方案中，选择亚单位抗原肽以模拟VIL18BP的表位。其它示例性宿主免疫调节因子及其Iocusjag标识符在表1中提供。在其它优选实施方案中，亚单位抗原肽源于病毒免疫调节蛋白。本领域技术人员将认识到各种病毒免疫调节蛋白是已知的并且可以使用。非限制性实例包括干扰素-Y (IFN-y)受体同源物(B8R基因)、补体调节蛋白同源物(B5R基因)和丝氨酸蛋白酶抑制剂(B13R、B14R、B22R基因)。多种痘病毒免疫调节蛋白已得以报道，但其对病毒免疫原性的影响一直没有得到很好地表征。(参见例如Jackson等J Virol79 =6554-59, 2005 ；B12R基因(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)；B15R基因(IL-1和IL-6受体)；B16R基因(IL-1受体)、B18R基因(IFN- α受体)、B19R基因(IL-1和IL-6受体、IFN抑制因子)。表1.痘病毒免疫调节蛋白
VACWR001VACWRO11VACWRO12
TNF-α受体样细胞凋亡锌(Zn)指样
VACWRO13 (VAC WR C12L) IL-18 结合蛋白
VACWR025VACWR028VACWR033VACWR034VACWR059VACWRl 72VACWRl 90VACWR208
阻断C3b/C4b补体活化细胞内信号转导抑制因子丝氨酸蛋白酵抑制因子干扰素抗性
dsRNA结合因子；干扰素结合因子Toll样受体调节因子IFN-γ受体样
锌指样
VACV WR 215
TNF-aRVACWR217TNF-α 受体样
VACV COP B19R (VACWR200) I 型 IFN 结合因子
VACV COPA39RVACV COPA40RVACV COPA41L_6] VACV A4L
VACV A27L (VACWR150)VACV D8L (VACWR113)VACV B5R (VACWR187)
脑信号蛋白样(semaphoring-like)
II型膜蛋白
分泌性糖蛋白
免疫显性抗原
表面结合疏酸肝素
表面结合疏酸软骨素
为跨高尔基体(trans-Golgi)中的IMV膜包覆所必需在替代实施方案中，亚单位抗原肽可能源于病毒包膜蛋白或其它病毒蛋白。非限制性实例包括D8L、A27L、L1R和A33R基因的蛋白产物。本领域技术人员将认识到所述各种痘病毒基因和蛋白质的DNA和氨基酸序列是本领域熟知的并且可公开获得(关于牛痘病毒WR的完整基因组序列以及所编码的蛋白质序列，参见例如GenBank登录号AYM3312)。免疫偶联物的抗体组分将复合物引导至APC，其中抗原肽组分经加工以引起对痘病毒和/或表达靶抗原的受感染细胞的免疫反应。各种APC靶向抗体是本领域已知的，如结合选自由以下组成的组的抗原的抗体HLA-DR、CD74、CD209 (DC-SIGN)、CD;34、CD74、CD205、TLR2 (toll 样受体 2)、TLR4、TLR7、TLR、BDCA-2、BDCA-3 和 BDCA-4。在更优选实施方案中，抗体结合选自HLA-DR和CD74的抗原。在最优选实施方案中，抗体结合HLA-DR。在一些优选实施方案中，痘病毒疫苗包含人源化、人或嵌合抗-HLA-DR抗体，如L243抗体。L243抗体已被描述(例如美国专利第7，612，180号，其实施例部分以引用方式并入本文)并且特征在于具有重链互补决定区(⑶R)序列⑶R1(NYGMN，SEQ ID NO:1), CDR2 (WINTYTREPTYADDFKG ，SEQ ID NO :2)，和 CDR3 (DITAWPTGFDY，SEQ ID NO 3)和轻链 CDR 序列 CDRl (RASENIYSNLA, SEQ ID NO 4)，CDR2 (AASNLAD, SEQ ID NO 5),和CDR3 (OHFWTTPWA，SEQ ID NO :6)。然而，可使用本领域中已知的其它抗-HLA-DR抗体(参见例如美国专利第6，416，958,6, 894，149,7, 262，278号，其实施例部分分别以引用方式并入本文)。在其它优选实施方案中，痘病毒疫苗包含人源化、人或嵌合抗-CD74抗体，如LLl抗体。LLl抗体已被描述(例如美国专利第7，312，318号，其实施例部分以引用方式并入本文)并且特征在于具有轻链⑶R序列⑶R1(RSSQSLVHRNGNTYLH，SEQ ID NO:7)，CDR2 (TVSNRFS, SEQ ID NO :8)，禾口 CDR3 (SQSSHVPPT, SEQ ID NO :9)禾口重链 CDR 序列 CDRl(NYGVN, SEQ ID NO 10), CDR2(WINPNTGEPTFDDDFKG ，SEQ ID NO: 11)，禾口⑶R3 (SRGKNEAWFAY，SEQ ID NO: 12)。或者，可利用其它抗⑶74抗体或针对其它APC或DC相关抗原的抗体(参见例如 LifeSpan Biosciences Inc.，Seattle, WA ；BioLegend, SanDiego, CA ；Abeam, Cambridge, ΜΑ)。在各种实施方案中，抗体或其抗原结合片段可能是嵌合、人源化或人抗体或其抗原结合片段。使用嵌合抗体优于亲本鼠源抗体，因为它们具备人抗体恒定区序列，因此不会引起和鼠源抗体一样强的人抗小鼠抗体(HAMA)反应。为了进一步降低诱发HAMA反应的可能性，使用人源化抗体是更优选的。正如下面所讨论，通过将鼠源框架和恒定区序列用相应人抗体框架和恒定区序列替换来使鼠源抗体人源化的技术是本领域熟知的，并已应用于众多的鼠源抗癌抗体。抗体人源化还可能涉及将一个或多个人框架氨基酸残基用来自亲本鼠源框架区序列的相应残基取代。也如下面所讨论，产生人抗体的技术也是熟知的，而且此类抗体可并入主题痘病毒疫苗构建体中。其它实施方案涉及编码融合蛋白(如抗体-亚单位抗原肽融合蛋白)的DNA序列，含有所述DNA序列的载体和宿主细胞，以及制造用于产生痘病毒疫苗的融合蛋白的方法。在一些实施方案中，使用DNL (对接-和-锁定)技术制造亚单位疫苗的情况下，融合蛋白可包含DDD (二聚化和对接域)部分或AD (锚定域)部分。在替代实施方案中，可通过例如抗体或抗体片段与抗原肽的化学交联来形成免疫偶联物。发明详述定义本文使用的术语“一”和“所述(该)”可能是指单数或复数，除非上下文另外明确指出仅表示单数。本文使用的术语“约”是指数值加上或减去百分之十(10% )。例如，“约100”是指90和110之间的任何数字。抗体是指全长(即自然发生或通过正常的免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(如IgG抗体)，或免疫球蛋白分子的免疫活性、抗原结合部分，如抗体片段。抗体片段是抗体的一部分，如F (ab丨)2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。无论结构为何，抗体片段结合由完整抗体识别的相同抗原。因此，该术语与“抗原结合抗体片段”同义地使用。术语“抗体片段”还包括由可变区组成的分离片段，如由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段以及轻链和重链可变区通过连接肽连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。本文使用的术语“抗体片段”不包括无抗原结合活性的抗体部分，如Fc片段或单个氨基酸残基。其它抗体片段，例如单域抗体片段是本领域已知的，并且可用于所主张的构建体中。(参见例如 Muyldermans 等，TIBS 26 :230-235,2001 ；Yau 等，J Immunol Methods281 161-75,2003 ；Maass 等，J Immunol Methods 324 :13-25,2007)。术语抗体融合蛋白可指具有相同或不同特异件的一个或多个相同或不同单链抗体或抗体片段相连的重组产生的抗原结合分子。融合蛋白的价态指示融合蛋白相对于单个抗原或表位所具有的结合臂或位点的数量，即一价、二价、三价或多价。抗体融合蛋白的多价性是指它可以在结合抗原时利用多重相互作用，从而提高与抗原结合的亲合力(avidity)。特异性指示抗体融合蛋白能够结合的抗原或表位的数量，即单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义，例如IgG的天然抗体是二价的，因为它有两个结合臂，但是它是单特异性的，因为它结合一个表位。单特异性、多价融合蛋白对于表位有一个以上结合位点，但只结合一个表位。融合蛋白可能包含单一抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性组合，或同一抗体组分的多个拷贝。此外，融合蛋白可包含抗体或抗体片段和亚单位肽抗原。然而，该术语不是限制性的，并且多种蛋白或肽效应物可并入融合蛋白中。在另一个非限制性实例中，融合蛋白可包含用于产生如下讨论的DNL构建体的AD或DDD序列。嵌合抗体是含有来源于一个物种的抗体(优选啮齿动物抗体)的可变域(包括互补决定区(⑶R))，而抗体分子的恒定域来源于人抗体的恒定域的重组蛋白。对于兽医应用，嵌合抗体的恒定域可能源于其它物种，如猫或狗。人源化抗体是来自一个物种的抗体(例如啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的重链和轻链可变链转移至人重链和轻链可变域(例如框架区序列)的重组蛋白。抗体分子的恒定域源自人抗体。在某些实施方案中，来自亲本(啮齿动物)抗体的有限数量的框架区氨基酸残基可取代入人抗体框架区序列。人抗体是例如由经“工程化”以响应于抗原激发而产生特异性人抗体的转基因小鼠获得的抗体。在这种技术中，人重链和轻链基因座的元件被引入到源自胚胎干细胞系的包含内源性鼠源重链和轻链基因座的靶向断裂的小鼠品系中。转基因小鼠可以合成具有针对特定抗原的特异性的人抗体，并且所述小鼠可以用来产生分泌人抗体的杂交瘤细胞。从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等，Nature Genet. 7 :13 (1994)，Lonberg等，Nature368 856 (1994)，和Taylor等，ht. Immun. 6 :579 (1994)描述。完全人抗体也可以通过基因或染色体转染方法，以及噬菌体展示技术来构建，所述方法和技术都是本领域已知的。关于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变域基因谱体外产生人抗体和其片段，参见例如McCafferty等，Nature 348:552-553(1990)。在此技术中，将抗体可变域基因同框克隆至丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并且以功能性抗体片段形式展示于噬菌体颗粒的表面上。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质的选择也导致编码展现这些性质的抗体的基因的选择。这样，噬菌体模拟B细胞的某些性质。噬菌体展示可以多种方式执行，关于评论，参见例如Johnson和Chiswell，Current Opinionin Structural Biology 3:5564-571(1993)。人抗体也可通过在体外活化的B细胞产生。参见美国专利第5567610号和第52四275号，其实施例部分以引用方式并入本文。附图简述

图1.源自 VIL18BP 序列(SEQ ID NO 23)的肽的结合和吸收。(A) vIL18BP110 (SEQID NO 16)与 T2 细胞结合。所示的肽(TT830，SEQ ID NO 19 ；vA4L229, SEQ ID NO :18 ；vIL18BP008, SEQ IDNO 13 ；vIL18BP105, SEQ ID NO 15 ；vIL18BP110, SEQ ID NO :16 ；vIL18BP117，SEQ ID NO :17)与T2细胞一起孵育Mh。显示HLA-A02在T2细胞中的相对丰度。从左到右的条形图分别代表从0到40μ g/mL以10-μ g/mL增量递增的肽的浓度。⑶vIL18BP105(SEQ IDNO :15)展现最高的供体PBMC吸收。在与所示的经生物素化肽孵育Mh之后，评价平行双份样品。NJ01、NJ04、NJ07和NJ08。在添加抗生物素蛋白-FITC偶联物之后，通过流式细胞术分析结果。每个肽的荧光值等于同一实验中的肽处理细胞的荧光值减去未处理细胞的荧光值。肽浓度为20微克/毫升。图2.来自接种供体的PBMC在与病毒肽一起孵育时增殖。将来自接种㈧和未接种(B)人供体的负载 CFSE 的 PBMC 与 10 μ g/mL指定肽(vA27L003, SEQ ID NO :20 ；vD8L118,SEQ ID NO 22 ；vIL18BP105, SEQ ID NO : 15或对照)一起孵育5天。收获细胞，并利用流式细胞术分析(平均值士SD)。条形图按以下顺序显示未填实条形图，培养基对照；实心黑色条形图，2.5mg/mL肽(或SEA)；水平-阴影线浅灰色条形图，5. Omg/mL肽；垂直-阴影线深灰色条形图，10.0mg/mL肽。(C)来自独立实验的结果，其中来自指定样品的细胞与vD8L118(SEQ ID NO :22) —起孵育以测定细胞内细胞因子和活化标志物的表达。结果显示于所嵌入表(C)中(D8L，VD8L118肽，SEQ ID NO :22)。*相比于培养基对照，组平均值P< 0. 05 (t-检验)。图3.应答⑶8+IFN-Y +细胞具有TEM或⑶45RA-终末分化细胞的表型。针对CD45RA和CCR7表达，对来自接种供体的CD8+PBMC进行了评估。数目代表细胞总数的百分比。对于TEM群体，VD8L118相比于培养基对照的P < 0. 019 (ANOVA)(左下象限)。图4.⑶8+细胞的⑶107a表达。相比于脱粒潜在标志物⑶107a，评估⑶8+细胞群体的IFN-γ、IL-2。数目和条形图值代表针对以下细胞的门中细胞百分比㈧⑶8+IFN- y +细胞、⑶⑶8+IFN- γ -细胞，和(C)⑶8+IL-2+细胞。*相比于培养基对照，组平均值P < 0. 04 (t-检验)。图5.肽抗体存在于接种供体的血清中。将来自未接种或接种供体的血清1 200稀释并且在针对以下肽的改良ELISA中与固定于96-孔板上的肽一起孵育(A)肽 vA27L003 (SEQ ID NO :20)、(B)肽 vD8L110(SEQ ID NO :21)，禾口 (C)肽 vIL18BP102(SEQID NO 14)。圆点代表每个供体的A450。*相比于未接种者，P < 0. 03 (ANOVA)。未接种供体:213、704、220 ；接种供体:05、12A、12B、19、26、720、308、416 和 920。肽 vD8L110 和VIL18BP105 是包括 vD8L118 和 vIL18BP105 全序列的 25-聚体。图 6.相对于 VIL18BP105 的 HLA_DR04tg 脾细胞增殖。以 vIL18BP105_L243 偶联物(偶联物)或游离vIL18BP105(游离)接种的HLA-DR04tg小鼠，原初(naiVe)HLA-DR04tg小鼠(HLA-DR04tg原初)和野生型C57BL/6J(WT原初)(n = 3小鼠/组)。用与不同浓度的肽一起孵育的经CFSE标记的脾细胞进行三次重复试验。结果是3次独立实验的代表值(n = 3，平均值士 SD)。图7.第一次加强免疫之后7和14天，用CIL18BP105 (偶联物)和IL18BP105 (游离)免疫的HLA-DR04tg小鼠中的肽特异性血清抗体产生。原初HLA-DR04tg小鼠血清用作对照(原初)。实验用汇集的血清三次重复执行(n = 3，平均值士SD)。图8.来自免疫小鼠的血清抗体与完整VIL18BP蛋白的结合。针对识别完整VIL18BP蛋白的抗体，对用单独L243抗体、VIL18BP105肽(SEQ ID NO 15)、与L243抗体偶联的病毒IL18BP105肽(CIL18BP105)、单独培养基免疫的小鼠或原初小鼠的血清进行测试ο图9.亚单位疫苗的基于脂质体的免疫偶联物。㈧脂质体展示的肽-L243抗体偶联物。(B)脂质体展示的没有抗体的裸肽。痘病毒疫苗
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亚单位抗原肽痘病毒产生一系列分泌性宿主免疫反应修饰因子，其会中和掉宿主细胞因子和先天防御机制。削弱宿主的第一道防线会使病毒建立感染(如在粘膜中)，并接着开始第一阶段的感染性复制。VV和其它痘病毒产生的一种因子是病毒白细胞介素18结合蛋白(VIL18BP，牛痘病毒C12L基因)，其在感染的早期阶段表达(Born等J Immunol 164 3246-54,2000)。它通过中和掉关键促炎性细胞因子IL-18来起作用，所述促炎性细胞因子刺激NK、⑶8和Thl⑶4细胞产生干扰素-Y (IFN- Y )，它引导对Thl类型的获得性免疫(Livingston 等，J Immunol168 :5499_5506，2002 ;Pien 等，J Immunol 160 :5827-37,2002 ；Scott, JImmunol 147 :3149-55,1991 ；Turner 等，J Hyg Camb 68 197-210，1970 ；Xiang和Moss, PNAS USA 96 :11537-542，1999)。在下面的实施例中所描述的研究解决对VIL18BP的宿主反应是否牵涉到对于痘病毒感染的抗性的问题。如果是这样，替代疫苗策略应包括这一因子和/或类似的抗原。最近报道另一种正痘病毒宿主防御调节因子即I型IFN-结合蛋白对于致病力是必不可少的(Xu等，JExp Med 205 =981-92,2008)并且可为包含于亚单位痘病毒疫苗中的候选物。正如下面所讨论的，其它已知的病毒蛋白也可作为基于亚单位的痘病毒疫苗的亚单位抗原肽的候选物而包含在内。如以下实施例中所描述，通过研究VIL18BP抗原肽是否能够引起经接种人受试者的外周血单核细胞(PBMC)和血清的回忆反应来测试人免疫力的基于亚单位肽的疫苗方法。细胞介导的免疫性在对痘病毒的抗性中的重要性仍在研究中，但是免疫性需要抗体反应得到了一定公认(Chaudhri 等，J Virol 80 :6339-44,2006 ；Combadiere 等，J Exp Med199，1585-89，2004 ;Kim 等，Clin Vaccine Immunol 13:1172-74,2006)。除了 VIL18BP-衍生肽以外，来源于其它VV基因的肽即D8L和A27L也得以测试。D8L蛋白对于病毒吸附和进入细胞是重要的，并且已显示可在痘病毒感染的小鼠模型中引起强烈的保护性免疫(Kan-Mitchell 等，J Immunol 172 =5249-61,2010 ；Berhanu 等，J Virol82 :3517- ，2008)。A27L蛋白对于病毒吸附和组装也是重要的，并且针对它的抗体提供保护性免疫(Berhanu 等，J Virol 82 =3517-29,2008 ；Chun g 等，J Virol 72:1577-85,1998 ；Scott,J Immunol 147:3149-55,1991)。本发明的总体目标是选择和开发供包含于多表位疫苗规格中的T-细胞(HLA-结合)和B-细胞抗原肽。肽具有相对易于合成、修饰和组合成多抗原复合物的优势。为了提高其免疫原性，将肽与靶向APC的抗体如针对HLA-DR抗原的抗体连接。靶向APC的抗体作为专门的抗原呈递细胞，树突状细胞(DC)在发动先天免疫和适应性免疫中发挥着举足轻重的作用，并已被用于产生有效的疫苗(Vulink等，Adv Cancer Res. 2008,99 363-407 ；0' Neill 等，Mol Biotechnol. 2007，36 131-41)。在体内将抗原靶向输送到 APC和DC代表一种有前途的接种方法，因为它可以避开费力而昂贵的离体抗原负载和培养，并且有助于免疫疗法的大规模应用CTacken等，Nat Rev Immunol. 2007，7 :790-802)。更重要的是，体内APC和/或DC靶向接种可更高效地引发抗肿瘤免疫反应，并且可更有效地控制动物模型中的肿瘤生长(Kretz-Rommel 等，J Immunother 2007,30 :715-726) 除了 DC以外，B细胞是另一类型强效的抗原呈递细胞，它能够预激Thl/Th2细胞(Morris 等，J Immunol. 1994,152:3777-3785 ；Constant, J Immunol. 1999,162 5695-5703)和经由交叉呈递来活化 CD8T 细胞(Heit 等，J Immunol. 2004,172 :1501-1507 ；Yan等，Int Immunol. 2005，17 :869-773)。最近据报道，在体内将抗原靶向输送至B细胞打破 MUCl 的免疫耐受(Ding 等，Blood 2008，112 :2817-25)。在本发明的各种实施方案中，可将针对一般由APC并且特别由DC表达的抗原的抗体并入免疫偶联物疫苗中以便将亚单位抗原肽靶向输送至免疫系统细胞。两个示例性APC抗原是HLA-DR和CD74。HLA-DR是主要组织相容性复合物种类II细胞表面受体，它在抗原呈递中起作用以引起T-细胞免疫反应。HLA-DR发现于多种抗原呈递细胞上，如巨噬细胞、B-细胞和树突状细胞。如上所述，针对HLA-DR的抗体(包括L243抗体)是本领域已知的。此类抗体可与亚单位抗原肽偶联以便递送至APC。另一种APC表达的抗原是⑶74，它是适当MHC II折叠和将MHC II-⑶74复合物靶向输送至内涵体所必需的II型膜内在蛋白(Stein等，Clin Cancer Res. 2007,13 5556s-5563s ;Matza 等，Trends Immunol. 2003,24(5) :264-8) CD74 表达不限于 DC，而是发现于几乎所有抗原呈递细胞中(Freudenthal等，Proc Natl Acad Sci USA. 1990，87 :7698-702 ;Clark 等，J Immunol. 1992,148(11) :3327-35)。CD74 在 APC 中的广泛表达可提供超过只是表达于髓性DC中的一些优势，因为已报道将抗原靶向输送至其它APC(如B细胞)可打破免疫耐受(Ding等，Blood 2008，112 =2817-25)，并且靶向输送至类浆细胞DC可将抗原交叉呈递至原初⑶8T细胞。更重要的是，⑶74也表达于滤泡DC中(Clark等，J Immunol. 1992,148(11) :3327-35)，所述滤泡DC是对于抗原呈递至B细胞起关键作用的DC亚群(Tew等，Immunol Rev. 1997，156 :39-52)。这一表达谱使CD74成为用于体内靶向接种的优秀候选物。各种抗CD74抗体是本领域已知的，如LLl抗体(Leung等，MolImmunol. 1995,32 :1416-1427 ；Losman 等，Cancer 1997,80 :2660-2666 ；Stein 等，Blood2004，104 :3705-11)。抗体和抗体片段在各种实施方案中，抗体或抗体的抗原结合片段可并入痘病毒疫苗中。抗原结合抗体片段是本领域熟知的，如F(ab' )2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等，并且可使用任何此类已知片段。如本文所使用的抗原结合抗体片段是指与完整或亲本抗体识别的相同抗原结合的抗体的任何片段。制备几乎任何目标抗体或片段的偶联物的技术是已知的(例如美国专利第7, 527，787号)。制备针对几乎任何靶抗原(如HLA-DR或CD74)的单克隆抗体的技术是本领域熟知的。参见例如 Kohler 和 Milstein，Nature 256 :495 (1975)，和 Coligan 等(编著)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第 1 卷，第 2. 5. 1-2. 6· 7 页(John ffiley&Sons 1991)。简单地说，单克隆抗体可通过以下步骤获得将包含抗原的组合物注入小鼠，取出脾脏以获得B-淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞，克隆杂交瘤细胞，选择产生所述抗原的抗体的阳性克隆，培养产生所述抗原的抗体的克隆，和从杂交瘤细胞培养物中分离抗体。单克隆抗体(MAb)可通过多种行之有效的技术从杂交瘤细胞培养物中分离和纯化。此类分离技术包括利用蛋白质-ASEPHAROSE 的亲和色谱、体积排阻色谱和离子交换色谱。参见例如Coligan第2. 7. 1-2. 7. 12页和第2. 9. 1-2. 9. 3页。还参见Baines 等 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第 10 卷，第 79-104 页中的 “Purification ofImmunoglobulin G(IgG)，，(The Humana Press, Inc. 1992)。在最初培殖针对免疫原的抗体之后，可对抗体测序并且随后通过重组技术来制备。鼠源抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员熟知的。使用来源于人源化、嵌合或人抗体的抗体组分避免了与鼠源恒定区的免疫原性相关的潜在问题。嵌合抗体嵌合抗体是人抗体的可变区被例如小鼠抗体的可变区(包括小鼠抗体的互补决定区(CDR))替换的重组蛋白。嵌合抗体在施用给受试者时呈现降低的免疫原性和增加的稳定性。克隆鼠源免疫球蛋白可变域的一般技术公开于例如Orlandi等，Proc. Nat' 1Acad. Sci. USA 86 :3833 (1989)。构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员熟知的。举例来说，Leung等，Hybridoma 13:469(1994)中通过将编码鼠源LL2 (—种抗-CD22单克隆抗体)的Vk和Vh域的DNA序列与相应人κ和IgG1恒定区结构域组合来产生LL2嵌合体。人源化抗体产生人源化MAb的技术是本领域熟知的(参见例如Jones等，Nature 321 522(1986) , Riechmann 等，Nature 332 323 (1988) , Verhoeyen 等，Science 239 1534 (1988)，Carter 等，Proc. Nat ‘ 1 Acad. Sci. USA 89 :4285 (1992)，Sandhu, Crit. Rev.Biotech. 12 :437 (1992)，和 Singer 等，J. Immun. 150 :2844(1993))。嵌合或鼠源单克隆抗体可通过将来自小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变链的小鼠CDR转移到人抗体的相应可变域中来人源化。嵌合单克隆抗体的小鼠框架区(FR)也替换为人FR序列。因为简单地将小鼠CDR转移到人FR中常常导致抗体亲和力降低或甚至丧失，所以可能需要额外修饰以便恢复鼠源抗体的原有亲和力。这可以通过将FR区域中的一个或多个人残基替换为其鼠源对应物以获得具有针对其表位的良好结合亲和力的抗体来实现。参见例如Tempest等，Biotechnology 9:266(1991)和 Verhoeyen 等，Science 239:1534(1988)。一般来说，不同于其鼠源对应物并且接近或毗邻一个或多个⑶R氨基酸残基的那些人FR氨基酸残基将是替换的候选物。人源化形式的L243和LLl抗体是已知的(参见例如美国专利第7612180号和第7312318号)。人抗体使用组合方法或用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产生完全人抗体的方法是本领域已知的(例如 Mancini 等，2004，New Microbiol. 27 :315-28 ；Conrad 和Scheller,2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8 :117-26 ；Brekke 禾口 Loset,2003,Curr. Opin.Phamacol. 3 :544-50)。完全人抗体也可以通过基因或染色体转染方法，以及噬菌体展示技术来构建，所述方法和技术都是本领域已知的。参见例如McCafferty等，Nature 348:552-553(1990)。与嵌合或人源化抗体相比，预计此类完全人抗体表现出更少的副作用并且在体内基本上如内源性人抗体一样发挥作用。在一些实施方案中，所主张的方法和程序可利用由此类技术产生的人抗体。在一个替代方案中，噬菌体展示技术可用于产生人抗体(例如Dantas-Barbosa等，2005，Genet. Mol. Res. 4 :126-40)。可从正常人或表现出特定疾病状态(如癌症)的人产生人抗体(Dantas-Barbosa等，200 。从患病个体构建人抗体的优点是可使循环抗体谱偏向针对疾病相关抗原的抗体。
在此方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等^00 从骨肉瘤患者构建人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。一般来说，从循环血液淋巴细胞中获得总RNA (同上)。 重组Fab从μ、γ和κ链抗体谱克隆并且插入噬菌体展示文库中(同上)。将RNA转变为cDNA并且用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物来产生FabcDNA文库 (Marks 等，1991，J. Mol. Biol. 222 :581-97)。根据 Andris-Widhopf■等执行文库构建 Q000， Phage Display Laboratory Manual, Barbas ^ ( ^m^- ), M 1 ，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 第 9. 1 到 9. 22 页)。最终 Fab 片段用限制性内切酶消化并且插入噬菌体基因组中以产生噬菌体展示文库。如本领域中已知，此类文库可通过标准噬菌体展示方法进行筛选(参见例如Pasqualini和Ruoslahti，1996，Nature 380 :364-366 ；Pasqualini,1999, The Quart. J. Nuc1. Med. 43 :159-162)。噬菌体展示可以多种方式执行，关于其评论，参见例如Johnson和Chiswell， Current Opinion in Structural Biology 3 :5564-571 (1993)。人抗体也可通过在体外活化的B细胞产生。参见美国专利第5567610号和第5229275号，其全部内容以引用方式并入本文。本领域技术人员将认识到这些技术是示例性的并且可利用制造和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。在另一替代方案中，经基因工程化以产生人抗体的转基因动物可用于使用标准免疫方案来产生针对基本上任何免疫原靶标的抗体。从转基因小鼠获得人抗体的方法由 Green 等，Nature Genet. 7 :13(1994)，Lonberg 等，Nature 368 :856(1994)，和 Taylor 等， Int. Immun. 6 =579(1994)公开。此种系统的非限制性实例是来自Abgenix(Fremont，CA)的 XenoMouse (例如 Green 等，1999，J. Immunol. Methods231 :11-23)。在XenoMouse 和类似动物中，小鼠抗体基因经灭活并且替换为功能性人抗体基因，而小鼠免疫系统的其余部分仍然完好。将XenoMouse 用包含人IgH和Ig κ基因座的部分(包括大部分可变区序列) 以及附加基因和调控序列的生殖细胞系配置YAC(酵母人工染色体)来转化。人可变区谱可用来产生抗体产生B-细胞，所述B-细胞可通过已知技术加工成杂交瘤细胞。用靶抗原免疫的XenoMouse 通过正常免疫反应产生人抗体，其可通过以上讨论的标准技术来收获和/或产生。可利用多种XenoMouse 品系，其各自能够产生不同种类的抗体。转基因方式产生的人抗体已被证明具有治疗潜力，同时保持正常人抗体的药代动力学性质(Green 等，1999)。本领域技术人员将认识到所主张的组合物和方法不限于使用XenoMouse 系统，而是可利用经基因工程化以产生人抗体的任何转基因动物。抗体片段识别特定表位的抗体片段可以通过已知的技术产生。抗体片段是抗体的抗原结合部分，如F(ab' )2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。F(ab，)2片段可通过胃蛋白酶消化抗体分子来产生，而Fab'片段可通过还原F(ab，)2片段的二硫桥键来产生。另外，可构建Fab' 表达文库(Huse等，1989，Science, 246 :1274-1281)以允许快速简便地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab'片段。？(油)2片段可通过木瓜蛋白酶消化抗体来产生，而Fab片段可通过二硫键还原来获得。单链Fv分子(scFv)包含VL域和VH域。VL和VH域联合形成靶结合位点。这两个域进一步通过连接肽(L)共价连接。制造scFv分子和设计合适连接肽的方法描述于美
14国专利第 4，704，692 号、美国专利第 4，946，778 号、R. Raag 和 M. Whitlow, "Single ChainFvs. "FASEB 第 9 卷:73-80 (1995)以及 R. Ε. Bird 和 B. W. Walker,"Single Chain AntibodyVariable Regions, ” TIBTECH，第 9 卷132-137(1991)。产生单域抗体的技术也是本领域已知的，例如Cossins等Q006，Prot ExpressPurif 51 :253-259)中所公开。单域抗体(VHH)可通过标准免疫技术例如从骆驼、羊驼或美洲轮获得。(参见例如 Muyldermans 等，TIBS 洸230_2；35，2001 ;Yau 等，J ImmunolMethods 281 161-75，2003 ；Maass 等，J Immunol Methods 324 :13-25,2007) VHH 可具有强效的抗原结合能力并且可与常规VH-VL对难以接近的新的表位相互作用。(Muyldermans等，2001)。羊驼血清IgG含有约50 %的仅骆驼科重链IgG抗体(HCAb) (Maass等，2007)。羊驼可用已知抗原如TNF- α免疫，并且可分离结合靶抗原并中和靶抗原的VHH(Maass等，2007)。扩增几乎所有羊驼VHH编码序列的PCR引物已得到鉴定并且可用于构建羊驼VHH噬菌体展示文库，其可用于通过本领域熟知的标准生物淘选技术来分离抗体片段(Maass等，2007)。抗体片段可通过全长抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或编码该片段的DNA的另一宿主中表达来制备。抗体片段可用常规方法对全长抗体进行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得。这些方法描述于例如Goldenberg的美国专利第4，036，945号和第4，331，647号和其中所含的参考文献。还参见Nisonoff等，Arch Biochem. Biophys. 89 230 (1960)；Porter，Biochem. J. 73 :119(1959) ,Edelman 等，METHODS IN ENZYM0L0GY 第 1 卷，第 422 页(Academic Press 1967)，和 Coligan 第 2. 8. 1-2. 8. 10 页和第 2. 10. -2. 10. 4 页。已知的抗体虽然针对HLA-DR或CD74的抗体是优选的，但是痘病毒疫苗可替代地使用与靶细胞表面上的另一抗原结合或与其反应的抗体来产生。优选的额外MAb可包括可与CD209 (DC-SIGN)、CD34、CD205、TLR2 (toll 样受体 2)、TLR4、TLR7、TLR9、BDCA-2、BDCA-3 或BDCA-4反应的人源化、嵌合或人MAb。此类抗体可从如美国菌种保藏中心的公共来源或商业抗体供应商获得。例如，针对 CD209 (DC-SIGN)、CD34、BDCA-2、TLR2、TLR4、TLR7 和 TLR9 的抗体可从 Santa CruzBiotechnology 公司(Santa Cruz, CA)购买。针对 CD205 和 BDCA-3 的抗体可从 MiltenyiBiotec公司(Auburn，CA)购买。众多的其它抗体商业来源是本领域技术人员已知的。这些抗体只是示例性的并且多种其它抗体和其杂交瘤细胞是本领域已知的。本领域技术人员将认识到针对几乎任何APC-相关抗原的抗体序列或分泌抗体的杂交瘤细胞可通过针对选定的相关靶抗原的抗体来简单搜索ATCC、NCBI和/或USPTO数据库而获得。克隆抗体的抗原结合域可使用本领域熟知的标准技术来扩增、切除、连接到表达载体上，转染至改造的(adapted)宿主细胞中并用于蛋白质产生。免疫偶联物在各种实施方案中，痘病毒疫苗可以免疫偶联物形式施用。制造具有抗体或融合蛋白的共价或非共价偶联物的许多方法是本领域已知的并且可利用任何此类已知方法。例如，抗原肽可经由二硫键形成而连接于经还原抗体组分的铰链区。另外，此类药剂可使用异双功能交联剂，如N-琥珀酰3- -吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)来连接。Yu等，Int. J. Cancer 56:244(1994)。此类偶联的一般技术是本领域熟知的。参见例如 Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRCPressl991) ；MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch 等(编著)，第 187-230 页中的 Upeslacis 等，“Modification of Antibodies by ChemicalMethods” (ffiley-Liss, Inc. 1995) ；MONOCLONAL ANTIBODIES PRODUCTION，ENGINEERINGAND CLINICAL APPLICATION, Ritter 等(编著)，第 60-84 页中的 Price，"Productionand Characterization of Syntheticn Peptide-Derived Antibodies，， (CambridgeUniversity Press 1995)。对接和锁定(DNL)方法在替代实施方案中，包含免疫偶联物的基于亚单位的疫苗可通过其它技术产生。一种几乎将任何蛋白或肽与任何其它蛋白或肽偶联的技术称为对接和锁定(DNL)技术。DNL方法利用在cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)的调控(R)亚单位和A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定域(AD)之间发生的特异性蛋白/蛋白相互作用(Baillie等，FEBS Letters. 2005 ；579 :3264o Wong和 Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004 ；5 :959)。PKA在一种由第二信使cAMP与R亚单位的结合所触发的研究最彻底的信号转导途径中发挥核心作用，它于1968年首次从兔骨骼肌中分离(Walsh等，J. Biol. Chem. 1968 ；243 3763) 0全酶的结构由通过R亚单位来保持非活性形式的两个催化亚单位所组成(Taylor, J. Biol. Chem. 1989 ；264 :8443)。PKA的同工酶被发现具有两种类型的R亚单位(RI 和 RII)，并且每种类型具有 α 和 β 同种型(Scott, Pharmacol. Ther. 1991 ；50 :123)。R亚单位仅以稳定二聚体形式得以分离并且二聚化域已被证明由前44个氨基末端残基组成(Newlon等，Nat. Struct. Biol. 1999 ；6 :222)。cAMP与R亚单位的结合导致释放活性催化亚单位以产生广泛范围的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，其通过PKA对接于AKAP而发生区室化来定向于选定底物(Scott 等，J. Biol. Chem. 1990 ；265 ；21561)。自从第一种AKAP即微管相关蛋白-2于1984年得到表征(Lohmann等，Proc. Natl.Acad. Sci USA. 1984 ；81 6723)以来，集中于各种亚细胞位点(包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、核、线粒体，和内质网)的50多种AKAP已被鉴定出在从酵母到人范围内的物种中具有不同结构(Wong 和 kott，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004 ;5 :959)。AKAP 针对 PKA 的 AD 是14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等，J. Biol. Chem. 1991 ；266 :14188)。AD的氨基酸序列在个别AKAP之间具有很大差异，其中针对RII 二聚体的结合亲和力据报道在2到90nM范围内(Alto 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA. 2003 ； 100 :4445)。引起关注的是，AKAP 只与二聚体R亚单位结合。对于人RII α，AD与由23个氨基末端残基形成的疏水表面结合(Colledge^P Scott, Trends Cell Biol. 1999 ;6 :216)。因此，人 RII α 的二聚化域和 AKAP 结合域都位于相同 N-末端 44 氨基酸序列内(Newlon 等，Nat. Struct. Biol. 1999 ；6 :222 ；Newlon 等，EMBO J. 2001 ；20 :1651)，它在本文中称为 DDD0人RII α的DDD和AKAP的AD作为连接物模块我们已开发一种将人RII α的DDD和AKAP的AD用作优秀连接物模块对以便将以下称为A和B的任何两个实体对接成非共价复合物的平台技术，所述非共价复合物可通过将半胱氨酸残基引入DDD和AD的战略位置以促进形成二硫键而进一步锁定为稳定栓系的结构。“对接-和-锁定”途径的一般方法如下。实体A通过将DDD序列连接至A的前体，产生以下被称为a的第一组分来构建。因为DDD序列将实现二聚体的自发形成，所以A将由 组成。实体B通过将AD序列连接至B的前体，产生以下被称为b的第二组分来构建。
中所包含的DDD的二聚基元产生与b中所包含的AD序列结合的对接位点，由此促进％和b 的即刻缔合，以便形成由组成的二元、三聚体复合物。此结合事件由于将两个实体经由二硫桥键来共价固定的后续反应而变得不可逆，因为最初结合相互作用使置于DDD和AD上的反应性硫醇基团处于接近位置中以便于位点特异性地连接，所以此后续反应非常高效地基于有效局部浓度的原理而发生(Chmura等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001 ；98 :8480)。在一些替代实施方案中，痘病毒疫苗免疫偶联物基于％13结构的变化形式，其中抗-HLA-DR或抗-⑶74抗体或F (ab ‘ ) 2或F (ab) 2抗体片段的每个重链在其C-末端连接至 AD部分的一个拷贝。因为每个抗体或片段有两个重链，所以每个抗体或片段有两个AD部分。亚单位抗原肽被连接到互补DDD部分。在DDD部分二聚化之后，每个DDD 二聚体与连接至IgG抗体或F(ab' )2或？(油)2片段的其中一个AD部分结合，产生每个IgG或F(ab' )2 或F(ab)2单位四个抗原肽的化学计量关系。然而，本领域技术人员将认识到可利用替代复合物，如抗原肽与AD序列连接和将抗-HLA-DR或抗-⑶74MAb或片段与DDD部分连接，产生效应因子部分的不同化学计量关系。例如，通过将DDD序列与IgG抗体或F(ab' )2片段的每个重链的C-末端连接，和将AD序列与抗原肽连接，可构建包含一个抗原肽和一个抗体或片段的DNL复合物。通过将DDD和AD远离两个前体的功能性基团连接，预计此类位点特异性连接可保存两个前体的初始活性。此方法在性质上是模块化的并且潜在地可用于位点特异性地和共价地连接广泛范围的物质。在优选实施方案中，DDD或AD部分与抗体或抗原肽共价连接以形成融合蛋白或肽。制造融合蛋白的多种方法是已知的，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。此类双链核酸可通过标准分子生物学技术插入表达载体中以产生融合蛋白(参见例如 Sambrook 等，Molecular CloninR, A laboratory manual，第 2 版， Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor，NY，1989)。在此类优选实施方案中，AD 和/或DDD部分可与蛋白质或肽的N-末端或C-末端连接。然而，本领域技术人员认识到 AD或DDD部分的连接位点可变化。例如，虽然可在保持抗原结合活性的同时将AD或DDD部分连接至抗体或抗体片段的N-或C-末端，但是与C-末端的连接使AD或DDD部分处于远离抗原结合位点的位置并且似乎产生更强的结合相互作用(例如Chang等，Clin Cancer Res 2007，13 :5586s-91s)。多种效应因子部分的位点特异性连接还可使用本领域已知的技术来执行，如使用二价交联试剂和/或其它化学偶联技术。治疗性处理的方法制剂痘病毒疫苗可根据已知方法配制以制备药学适用组合物，其中痘病毒疫苗以混合物形式与药学合适赋形剂组合。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学合适赋形剂的一个实例。其它合适赋形剂是本领域技术人员熟知的。参见例如Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第 5 版(Lea&Febiger 1990)，和 Gennaro (编著)， REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第 18 版(Mack Publishing Company 1990)和其修订版。痘病毒疫苗优选皮下或鼻腔施用。更优选地，痘病毒疫苗以单个或多个推注剂形式经由皮下注射施用。施用制剂可以单位剂型提供，例如提供于安瓿或多剂量容器中，其中添加防腐剂。组合物可采用如油性或水性载体中的混悬液、溶液或乳状液这样的形式，并且可含有配方剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。另外，活性成分可呈在使用之前用合适载体(例如无菌无热原水)复水的粉末形式。可使用其它制药方法来控制痘病毒疫苗的作用持续时间。可通过使用络合或吸附痘病毒疫苗的聚合物来制备缓释制剂。例如，生物相容聚合物包括乙烯-醋酸乙烯共聚物基质和硬脂酸二聚体与癸二酸的酸酐共聚物基质。Sherwood等，Bio/Technology 10:1446 (199 。从此种基质中释放的速率取决于痘病毒疫苗的分子量、基质内的痘病毒疫苗的量和分散颗粒的大小。Saltzman等，Biophys. J. 55 :163(1989) ； Sherwood等，上述。其它固体剂型描述于Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5 版(Lea&Febiger 1990)，和 Gennaro (编著)，REMINGTON，S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第 18 版(Mack Publishing Company 1990)和其修订版。一般来说，人施用痘病毒疫苗的剂量取决于如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学状况和既往病史等因素而有所不同。在单次施用中向接受者提供约lmg/kg到25mg/kg范围内的痘病毒疫苗剂量可能是可取的，但是如情况需要也可施用更低或更高剂量。举例来说，l-20mg/kg剂量对于70kg患者为70-1，400mg,或对于1. 7-m患者为41_824mg/m2。如需要可重复给药以诱导免疫反应。在替代实施方案中，治疗肽可通过吸入途径施用(例如Sievers等，2001，PureAppl. Chem. 73 =1299-1303)。超临界二氧化碳雾化已用于从包括蛋白质和肽的各种药剂中产生纳米或微米尺度的颗粒(同上)。将超临界二氧化碳与蛋白质或肽水溶液混合所形成的微泡可在与形成药物粉末的替代方法相比较低的温度(25至65°C)下干燥，从而保留治疗肽的结构和活性(同上)。在某些情况下，可将稳定剂如海藻糖、蔗糖、其它糖、缓冲剂或表面活性剂添加到溶液中，以进一步保存功能活性。产生的颗粒小到足以通过吸入施用。在其它替代方案中，可利用水溶液的鼻腔施用。试剂盒各种实施方案可涉及含有适合于治疗或诊断患者的患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可含有至少一种或多种如本文所述的痘病毒疫苗免疫偶联物。如果包含施用组分的组合物不是经配制以便通过鼻腔施用或吸入来递送，能够通过皮下注射来递送试剂盒组分的装置可被包括在内。一种类型的装置是用于将组合物注入受试者的身体内的注射器。在一些实施方案中，治疗剂可以含有无菌、液体制剂或冻干制剂的预充式注射器或自动注射笔形式提供。试剂盒组分可以包装在一起或分隔至两个或更多个容器中。在一些实施方案中，容器可为含有适合于复水的组合物的无菌、冻干制剂的小瓶。试剂盒还可能包含一种或多种适合于复水和/或稀释其它试剂的缓冲剂。可使用的其它容器包括但不限于小袋、盘、盒、管等。试剂盒组分可以被包装于容器内并保持无菌。可以包含在内的另一个组成部分是向使用者提供试剂盒的使用方法的说明书。表达载体其它实施方案可能涉及包含编码痘病毒疫苗免疫偶联物或其组成蛋白的核酸的DNA序列。融合蛋白可包含与亚单位抗原肽连接的抗-HLA-DR抗体。另外，所编码融合蛋白可包含与抗体或抗原肽连接的DDD或AD部分。各种实施方案涉及包含编码DNA序列的表达载体。载体可含有可与嵌合、人源化或人可变区序列连接的编码人免疫球蛋白的轻和重链恒定区和铰链区的序列。此外，载体可能含有在选定的宿主细胞中表达所编码的蛋白质的启动子、增强子和信号或前导序列。 特别有用的载体是pdHL2或GS。更优选地，轻链和重链恒定区和铰链区可来自人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中任选地同种异型(allotype)位置中的至少一个氨基酸更换为不同IgGl 同种异型中的氨基酸，并且其中任选地基于EU编号系统的EU重链的氨基酸253可替换为丙氨酸。参见 Edelman 等，Proc. Natl. Acad, ki USA 63:78-85(1969)。在其它实施方案中，IgGl序列可转换为IgG4序列。本领域技术人员将认识到对表达构建体进行基因工程化并将其插入宿主细胞中以表达工程化蛋白质的方法是本领域熟知的，并且属于例行实验。宿主细胞及表达克隆抗体或片段的方法已描述于例如美国专利第7531327、7537930和7608425号，其实施例部分以引用方式并入本文。
实施例下面的实施例用来说明而非限制本发明的权利要求。实施例1.针对痘病毒亚单位抗原肽的免疫反应材料和方法肽设计.具有针对HLA I类和/或HLA II类分子的多个潜在结合位点的9_聚体或15-聚体肽序列通过目测筛查HLA锚定残基是否处于正确间距，或使用基于万维网的方法(例如 BIMAS 或 SYFPEITHI [Parker 等，J Immunol 152 163-75，1994 ；Rammensee 等， Immunogenetics 50 :213-19,1999])而从痘病毒开放阅读框架获得，其中选择是基于特异性 HLA-结合的较高潜力(表 2)。vIL18BP(C12L)、A4L (Boulanger 等，J Virol 72:170-79， 1998)、A27L(Chung 等，J Virol72 1577-85，1998)或 D8L (Hsaio 等，J Virol 73 :8750-61) W抗原的核苷酸和氨基酸序列从NIH GenBank入藏登记号:AY243312来检索。这些肽通过其基因来源和编号(例如VIL18BP105或VD8L118)来定名。表2.痘病毒VIL18BP-衍生肽、A4L2^和TT830的氨基酸数目和HLA限制。
权利要求
1.一种免疫偶联物，其包含a)至少一种来自痘病毒蛋白的抗原肽；和b)结合抗原呈递细胞(APC)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段与所述抗原肽偶联；其中将所述免疫偶联物施用给受试者诱导针对所述痘病毒的免疫反应。
2.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述痘病毒蛋白是病毒免疫调节因子。
3.根据权利要求2所述的免疫偶联物，其中所述痘病毒蛋白是病毒IL-18结合蛋白(VIL18BP)。
4.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述痘病毒蛋白是包膜蛋白。
5.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述痘病毒蛋白选自由L1R、A27L和D8L组成的组。
6.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述免疫偶联物包含至少一种来自病毒免疫调节因子的抗原肽和至少一种来自病毒包膜蛋白的抗原肽。
7.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述痘病毒是天花。
8.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述抗体或其片段结合选自由以下组成的组的 APC 抗原HLA-DR、CD74、CD209 (DC-SIGN)、CD34、CD74、CD205、TLR2 (toll 样受体 2)、TLR4、TLR7、TLR9、BDCA-2、BDCA-3 禾口 BDCA-4。
9.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述APC抗原是HLA-DR或CD74。
10.根据权利要求9所述的免疫偶联物，其中所述抗体或其片段是抗-HLA-DR抗体，其包含重链互补决定区(CDR)序列 CDR1NYGMN(SEQ ID N0:1)、CDR2 WINTYTREPTYADDFKG (SEQID NO 2) ^P CDR3 DITAVVPTGFDY (SEQ ID NO :3)以及轻链 CDR 序歹丨J CDRl RASENIYSNLA (SEQID N0:4)、CDR2 AASNLAD (SEQ ID NO :5)和 CDR30HFWTTPWA (SEQ ID NO :6)。
11.根据权利要求9所述的免疫偶联物，其中所述抗体或其片段是抗-CD74抗体，其包含轻链 CDR 序列 CDR1RSSQSLVHRNGNTYLH(SEQ ID NO :7)、CDR2 TVSNRFS (SEQ ID NO:8)和 CDR3 SQSSHVPPT (SEQ ID NO 9)以及重链 CDR 序列 CDR1NYGVN(SEQ ID N0:10)、CDR2WINPNTGEPTFDDDFKG(SEQ ID NO :11)和 CDR3 SRGKNEAffFAY(SEQ ID NO :12)。
12.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述抗原肽具有选自由以下组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO :13,SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16,SEQ ID N0:17、SEQ ID NO :18,SEQID NO 19,SEQ ID NO 20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ IDNO :23、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ IDNO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO :34、SEQ IDNO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ IDNO 39 禾口 SEQ ID NO :40。
13.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述免疫偶联物是包含所述抗原肽和所述抗体或抗体片段的融合蛋白。
14.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述抗原肽与所述抗体或抗体片段共价连接。
15.根据权利要求1所述的免疫偶联物，其中所述抗原肽是第一融合蛋白的一部分，所述抗体或其片段是第二融合蛋白的一部分，并且所述第一和第二融合蛋白彼此结合。
16.根据权利要求15所述的免疫偶联物，其中第一融合蛋白包含来自人蛋白激酶A(PKA)RI α、RII α、RI β或RII β的二聚化和对接域(DDD)部分，并且所述第二融合蛋白包含来自AKAP蛋白的锚定域。
17.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的免疫偶联物和药学上可接受的载体。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物是亚单位疫苗。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中将所述疫苗施用给受试者提供针对痘病毒感染的免疫力。
20.根据权利要求18所述的药物组合物，其中将所述疫苗施用给受试者诱导针对天花感染的免疫力。
21.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种佐剂。
22.—种诱导针对痘病毒感染的免疫力的方法，其包括向受试者施用根据权利要求18所述的亚单位疫苗。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述痘病毒是天花。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述组合物皮下或鼻腔施用。
25.根据权利要求M所述的方法，其中脂质体亚单位疫苗经鼻腔施用。
26.根据权利要求17所述的方法，其中所述免疫偶联物以编码融合蛋白的表达载体形式施用，所述融合蛋白包含至少一种来自痘病毒蛋白的抗原肽和结合APC的抗体或其抗原结合片段。
全文摘要
本发明涉及诱导针对诸如天花的痘病毒感染的免疫力的基于亚单位的疫苗的方法和组合物。优选实施方案涉及包含一种或多种与靶向抗原产生细胞(APC)的抗体或其片段连接的亚单位抗原肽的免疫偶联物。更优选地，所述抗体与HLA-DR结合并且所述抗原肽来自免疫调节因子，如病毒IL-18结合蛋白(vIL18BP)。然而，也可使用来自不同病毒蛋白的抗原肽的混合物。所述疫苗能够诱导针对痘病毒的免疫力，而没有在免疫功能低下宿主中发生播散性感染或传染给易感染的接触者的风险。
文档编号A61K39/385GK102573902SQ201080047418
公开日2012年7月11日 申请日期2010年10月29日 优先权日2009年11月5日
发明者A·P·泰勒, B·马卡比-潘祖, D·M·戈德堡 申请人:分子医学和免疫学中心