表面吸附有治疗药剂的细菌孢子的制作方法

专利名称：表面吸附有治疗药剂的细菌孢子的制作方法
表面吸附有治疗药剂的细菌孢子本发明涉及一种在孢子上覆盖一种或多种治疗药剂的方法。本发明还涉及一种通过该方法获得的被覆孢子，以及被覆孢子作为疫苗的应用。新一代疫苗的发展遵循一系列战略途径，包括利用活的重组细菌。其中，遗传工程菌株孢子的使用已显示出具有粘膜的和耐热疫苗传输系统的前景。芽胞杆菌属的孢子目前被广泛用作益生菌，这是证明其安全性的有力例证。 活细菌作为疫苗传输系统的使用提供了一个推动研发新型且更高效疫苗的途径。活细菌疫苗包括沙门氏菌、志贺氏杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌和芽孢杆菌等众多种类(达特曼等，2006)。在一些情况下，所使用的策略是利用致病菌的生命周期，例如重组型、弱化的伤寒沙门菌Ty21a的一次口服剂量足够产生一种有效的免疫反应，这是因为细菌有效地以肠道相关的淋巴组织(GALT)为目标(布曼等，2000)。此外，经遗传工程操作获得的能在孢子表面或萌发孢子内表达异源抗原的枯草芽孢杆菌可被用于抗原的口服或经鼻接种，获得保护性免疫。枯草芽孢杆菌的孢子作为休眠的生命形式具有热稳定性、非致病性等优势，目前作为益生菌用于人体和动物(洪等，2005)。表达来自破伤风梭状芽孢杆菌(杜克等，2003)、产气荚膜梭菌(黄等，2008)、炭疽杆菌以及寄生虫中华支睾吸虫(周等，2008)的保护抗原的重组孢子都已在动物模型上显示出能够提供保护。另一方面，重组细菌的使用也提高了对转基因微生物(GMOs)的使用和清除来自宿主的细菌的关注(达特曼等，2006)。研发更好疫苗的第二个目的是识别新的能够提高免疫原性的佐剂、或弱化免疫原性抗原(例如，重组蛋白亚基和合成多肽)。目前，只有明矾一种佐剂获得了用于人体的许可，还有一系列潜在的疫苗佐剂正在研发中，包括免疫刺激性佐剂、粘膜佐剂、脂质颗粒和微粒佐剂(辛格等，1999和莫伊尔等，2004)。其中每一种都各有优缺点。新类型佐剂中的一种，即颗粒佐剂(例如，脂质体、病毒体、类病毒颗粒、丙交酯-乙交酯共聚物(PLG)微球体和免疫刺激复合体(ISCOMS))特别令人鼓舞，因为它们会模拟病原体而被免疫系统消灭。微粒佐剂高效地靶向抗原递呈细胞(APCs)，一旦进入细胞内，即被I类和II类MHC(主要组织相容性复合物)途径处理，使抗原递呈在APC表面。生物可降解的PLGs可诱导细胞毒性T淋巴细胞CTL应答；一个与细胞内病原体战斗的前提(马洛伊等，1994)。对共聚物佐剂的研究显示为了诱导大范围的免疫反应(抗体和细胞介导的免疫反应)有必要使抗原维持其天然形式(亨特等，2002)。在油包水乳状液中制备的许多抗原被抗原递呈细胞(APCs)快速包裹、降解，并进入II类通路，以攻击的模式诱导抗体的产生，未能达到保护作用。这可能是由于不能产生识别变构表位的关键的IgG2a亚类而失效(亨特等，2002)。抗原以其天然形式位于惰性表面的稳定性与诱导有效免疫反应的能力仍然是疫苗与佐剂配方的挑战之一。国际专利W003/055513和马凯尔等在1971年发表的文章公开了一种结合抗原的枯草芽孢杆菌孢子的使用；然而，孢子上被覆抗原却未公开。本发明提供了一种将治疗药剂吸附在细菌孢子上的方法，其中包含将孢子与治疗药剂在某一 pH条件下混合，该pH值小于或等于治疗药剂的等电点。已知在这种情况下，通过混合孢子和药剂，治疗药剂会吸附到孢子上。细菌孢子带负电荷的疏水表面可用于结合治疗药剂，例如抗原。治疗药剂结合到孢子表面，同时维持其天然构象和功能。尤其是当抗原吸附到孢子上时，会产生较强的免疫反应(例如，Thl和Th2应答)。
为了吸附治疗药剂，孢子和治疗药剂仅需接触数分钟；但是孢子与治疗药剂最好接触10分钟以上。孢子可以是任何合适的细菌孢子，包括芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌的孢子。孢子最好是益生菌孢子。尤其是芽孢杆菌孢子，例如枯草芽孢杆菌或克劳氏芽孢杆菌孢子。该孢子可以是一种遗传工程孢子，用于在其表面表达一种或多种治疗药剂。特别包括枯草芽孢杆菌PY79菌株、枯草芽孢杆菌HU58菌株(塔姆等，2006)、枯草芽孢杆菌HT251菌株(与PY79菌株等基因，其基因组上携带表达修饰的孢子外被蛋白CotB的重组基因，该蛋白与GST-Cpa247-370融合(黄等，2008))、来自破伤风梭状芽孢杆菌的枯草芽孢杆菌RH103菌株(表达免疫原、TTFC(破伤风毒素片段C)，其孢子表面上有与CotB蛋白嵌合体)(伊斯迪卡多等，2001)，以及克劳氏芽孢杆菌0/C菌株。绝大多数孢子是由枯草芽孢杆菌PY79菌株产生的。孢子优选为经过变性的(例如，灭活)，以防止其萌发而进一步增殖。本领域的技术人员已知多种灭活孢子的方法，包括高压灭菌法、UV辐射、Y辐射，以及对孢子进行遗传改造。孢子优选为经高压灭菌法灭活。治疗药剂可以是任何适合的治疗药剂，包括蛋白质，例如抗原、酶(如促进或加强分解的酶，即纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶等)、抗体分子、抗癌蛋白(例如，赫赛汀、P53等)，以及其他治疗蛋白(例如，来自ETEC(产肠毒素大肠杆菌)的不稳定毒素、霍乱毒素B亚基、破伤风毒素，等)；变性病毒或其他传染因子，例如HIV、甲型肝炎、乙型肝炎、流感病毒(正粘液病毒)、疱疹病毒、乳多泡病毒、正弹状病毒、水泡性口炎病毒(VSV)等)；化学小分子，比如抗癌因子(例如，泰克索(taxol))、标记物、受体激动剂和受体拮抗剂。“治疗药剂”包括直接治疗疾病或紊乱的活化剂和阻止疾病或紊乱(例如，疫苗抗原)的发展或恶化的预防疾病药剂。治疗药剂最好是一种抗原。适当的抗原包括来自传染因子、肿瘤抗原和过敏原的蛋白质或多肽。传染因子可以是原核的、真核的、阮病毒或病毒。合适的传染病毒包括HIV、甲型肝炎、乙型肝炎、流感病毒(正粘液病毒)、疱疹病毒、乳多泡病毒、正弹状病毒、水泡性口炎病毒(VSV)等。合适的传染细菌包括埃希氏菌(例如，大肠杆菌和ETEC(产肠毒素大肠杆菌))、军团菌、芽孢杆菌、奈瑟氏菌、嗜血杆菌、螺旋杆菌、棒状杆菌、肺炎球菌、沙门氏菌、分支杆菌、衣原体和志贺氏杆菌(例如，痢疾志贺菌，宋内志贺菌和福氏志贺菌)，等。适当的寄生生物包括隐孢子虫，弓形虫，利什曼虫，泰勒虫等，以及任何在其生命周期内具有胞内阶段的寄生虫，例如，疟原虫。肿瘤抗原可以是任何肿瘤的抗原。本领域的技术人员已知多种肿瘤抗原。肿瘤抗原的例子包括B7、CEA、ESOU Her2、Muc-U 0FA_iLRP (癌胚抗原未成熟层粘连蛋白受体蛋白)等。过敏原可以是该领域技术人员已知的任何一种过敏原。过敏原包括野草花粉(例如，Phl p 5b)、树花粉(例如，Bet vl)、房间尘埃粒(例如，Der pi)、动物毛屑(例如，猫Fel dl)、霉菌、乳胶、食物过敏原(例如，花生Ara h2、鸡蛋卵清蛋白和类卵粘蛋白)以及蜜蜂/黄蜂毒液(例如，磷脂酶A2)。多种不同的治疗药剂可吸附到孢子上。例如，不同的抗原可吸附到孢子上，提供对多种疾病的免疫保护。当若干种不同抗原吸附到孢子上时，抗原可彼此结合。此外，佐剂可被吸附到孢子上。适当的佐剂包括霍乱毒素B亚基(CTB)和不耐热的肠毒素(LTB)。其他佐剂，包括Thl佐剂(例如，加强的Thl免疫反应的佐剂)，是该领域技术人员所熟知的。国际专利W099/58683描述了多种合适的佐剂。该治疗药剂可连接到一种调节剂上。适当的调节剂包括能够加强治疗药剂吸附到孢子上的媒介、或能加强治疗药剂构象稳定的媒介。这种媒介包括谷胱甘肽-S转移酶(GST)、来自流感嗜血杆菌等20脂蛋白D、麦芽糖结合蛋白、￠-半乳糖苷酶和伴侣蛋白。此夕卜，调节剂可作为佐剂发挥作用，刺激接受过这种蛋白质的机体的免疫系统。“混合” 一词是指孢子和治疗药剂被安排为彼此接触，该治疗药剂可吸附到孢子表面。孢子与治疗药剂优选为通过连续的搅动而混合。治疗药剂与孢子在一定的pH条件下混合在一起，该pH值低于或等于治疗药剂的等电点。治疗药剂的等电点可利用多种标准技术来确定。特别是该混合PH值优选地低于治疗药剂的等电点。PH优选为小于7，或小于5，最适宜的是4或以下。混合期间的pH值小于治疗药剂的等电点，高于孢子的零电荷点(ZPC)，也就是使孢子在混合pH值条件下带负电荷。对于枯草芽孢杆菌孢子来说，其零电荷点约为2，因此，混合pH值最好高于2。孢子与治疗药剂优选在提高孢子与治疗药剂间的疏水与离子相互作用的条件下混合。根据所使用的孢子和治疗药剂，不同的盐浓度可促进静电或疏水作用，例如结合。需要确定特定孢子与治疗药剂结合的最适盐浓度。从根本上说，低盐浓度通常有利于离子相互作用，所以主要通过离子相互作用结合的蛋白质在低盐浓度下将有更好的结合。高盐浓度通常促进疏水相互作用，因此主要通过疏水相互作用结合的治疗药剂将在高盐浓度下更好地结合。低盐浓度通常是指低于0. 3M的盐浓度，优选为小于0. 15M，最好是小于0. 05M。高盐浓度通常是指高于0. 3M或更高，优选为0. 8M或更高的盐浓度。在本发明的一个具体实施例中，通过离子相互作用结合在一起的孢子与治疗药剂在结合溶液中混合在一起，该结合溶液的PH值小于或等于治疗药剂的等电点，其盐浓度小于0.3M。结合溶液可以是一种磷酸盐缓冲液(PBS)或任何其他适用溶液。在本发明的一个实施例中，该方法还包含通过结合一个或多个药用的载体或媒介物，将孢子与吸收的治疗药剂一起构成制药组分。制药组分可以是一种免疫原组分或疫苗组分，该方法还包含添加佐剂到该组分中。本发明还提供了一种通过该方法获得的免疫原组分或疫苗组分。免疫原组分或疫苗组分优选地包括一种或多种来自一种或多种传染因子的抗原。本发明还提供了免疫原组分或疫苗组分用于提高对一种或多种传染因子的保护性免疫应答。本发明还涉及一种提高个体对一种或多种传染因子的保护性免疫应答的方法，包含施用一定有效剂量的免疫原组分或疫苗组分，其中包括来自一种或多种传染因子的一种或多种抗原。本发明还提供了通过本发明所述方法获得的一种表面吸附有一种或多种治疗药剂的细菌孢子。
本发明还公开了一种通过本发明所述方法获得的用于治疗的表面吸附有一种或多种治疗药剂的细菌孢子。治疗类型将依赖于吸附在孢子上的治疗药剂。例如，如果一种抗原吸附在孢子上，那么它可用于提高对该抗原起源的传染因子的免疫系统应答。或者是，如果抗癌因子吸附在孢子上，那么则可用于治疗癌症。在本发明的一个具体实施例中，提供了对通过本发明所述方法获得的表面吸附有一种或多种抗原的孢子的使用，以提高个体对一种或多种抗原的保护性免疫应答。本发明还提供了一种提高机体对一种抗原的保护性免疫反应的方法，包含通过本发明所述方法，施用一定有效剂量的表面吸附有抗原的孢子。在本发明的一个进一步优选的实施例中，通过本发明所述方法获得的一种表面吸附有一种或多种抗原的孢子可用作疫苗。使用本方法的表面吸附有抗原的孢子可提供对多种不同的病原体的防护。广泛的免疫应答表明抗原可结合到孢子表面，同时保持其天然结构。发明者已确认孢子带负电荷的疏水表层提供了一个适合吸附治疗药剂的平台，例如蛋白质抗原。显而易见的是，杀死或灭活的孢子与活孢子同样有效。事实上，灭活孢子比活孢子的效率更高。孢子在其天然构象内呈现出一种结合抗原，促进细胞应答(Thl型偏移)及抗体反应。诱导的广谱免疫反应结合安全性的伴随得益表明孢子吸收适用于提高抗原的免疫原性，并释放其他治疗分子。利用本发明所述方法获得的被覆孢子可与任何其他适当的治疗药剂结合施用，例如，可进一步提高治疗作用的干扰素、细胞因子等。本发明还提供了一种制药组分，包含通过本发明所述方法获得的被覆孢子，以及任何可药用的载体或赋形剂。可药用的载体或赋形剂是本领域技术人员所熟知的。本发明的制药组分可以任何适当的方式施用，包括口服、肠道外、粘膜(口、鼻、直肠)和舌下。当口服施用被覆孢子时，它们优选地被覆有适当的涂层，以防止所吸附的药剂被降解。被覆孢子优选为经粘膜或肠道外施用。肠道外包括皮下、皮内、静脉注射、肌肉注射、关节内、滑膜腔内、胸骨内和颅内注射或输液。适用于肠道外的制剂包括含水或不含水灭菌的注射液，其中可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌性组分和溶解物，使制剂与个体的体液等渗，优选为血液；含水和不含水灭菌的悬浮液可包括悬浮剂或增稠剂。该配方可出现在单位剂量或多剂量容器内，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，在冻干的条件下储存，只需要在使用前直接添加灭菌的液态载体。此外，灭菌的可注射制剂可以是一种灭菌的可注射含水或含油悬浮液。这种悬浮液可通过本领域技术人员所熟知的技术，使用适当的分散或加湿剂(例如，吐温80)和悬浮剂制成。灭菌的可注射制剂也可以是一种溶于非毒性肠道外可接受的稀释液或溶液内的灭菌的可注射溶液或悬浮液，例如溶于1，3_ 丁二醇。可用的适当载体和溶剂包括甘露醇、水、林格式溶液、等渗氯化钠溶液。此外，灭菌的不挥发油通常可用作溶剂或悬浮介质。基于这一目的，还可使用任何不挥发清油，包括合成的单甘油 酯或双甘油酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物可用于血管注射剂的制备，因为它们是天然的可药用油剂，例如橄榄油或蓖麻油，特别是其聚乙醇氧化物变体。这些油溶液或悬浮液也可以包括长链的乙醇稀释剂或分散剂或乙醇类似物。本发明的制药组分也包括佐剂系统，以提高组分的免疫原性。佐剂系统提高Thl
型应答。本发明的制药组分可作为鼻气雾剂或吸入剂经鼻施用。这种组分可根据制药配方的常用技术来制备，可制成盐溶液，利用苯甲醇或其他防腐剂、促吸收剂来增强生物药效率，碳氟化合物和/或其他增溶剂或分散剂是本领域所熟知的。本发明被覆孢子对个体的施用计量依赖于多种因素，例如年龄、体重和个体的总体条件、治疗条件和施用被覆孢子的途径。适宜的剂量可以是每剂量IO5至IO11个孢子。如果在此范围内的剂量不够，则可提高剂量。鉴于研究报道，本领域技术人员会识别测试的适当的剂量水平。然而，仅作指引，适用于哺乳动物，尤其是人类时，活性药剂的每日剂量水平大约为0. 01mg/kg至10mg/kg,通常约lmg/kg。上述剂量是平均情况的典型。当然，根据个体情况可提高或降低剂量范围，这些都 属于本发明的范围内。剂量范围需要依赖于孢子与吸附药剂的选择、施用途径、药物配方的性质、主体条件的性质，以及主治医师的判断。疫苗组分是便于注射的形式。常规佐剂可用于加强免疫应答。疫苗的适当单位剂量为0. 5-5mg/kg抗原,这一剂量优选在I至3周内分I至3次接种。在该标识剂量范围，没有观察到本发明化合物具有会阻碍应用于合适个人的有害毒性作用。鉴于多种治疗药剂和多种用药方式的不同功效，可预期到所需剂量的广泛变化。例如，口服用药将比静脉注射的剂量高。剂量水平的变化可利用标准的经验程序进行优化调节，这是本领域技术人员熟知的。下面将参考所附示图中的实施例对本发明进行描述。 图I显示了碱性磷酸酶(AP)的吸附受pH值的影响。饱和的AP被吸附在具有2 X IO9个孢子(PY79，0/C,高压蒸汽灭菌的PY79和0/C孢子)的200 U I结合缓冲液(分别为pH4，pH7和pHIO的PBS)的悬浮液中，置于RT (室温)下45min。该混合物用相同缓冲液清洗3次，然后收集颗粒并悬浮在100 ill的底物(pNPP，p-硝基苯基磷酸盐)中。45min后测定上层液体的OD (405nm)。吸附在孢子上的AP的量在AP活性参照的基础上，从OD值转化获得。图2显示出NaCl浓度对孢子吸附碱性磷酸酶的影响。在200 含有不同浓度的NaCl的结合缓冲液(pH4)(分别为0. 03M，0. 06M，0. 125M，0. 5M和1M)中，在室温条件下45min，饱和的AP被吸附在2X IO9个孢子(枯草芽孢杆菌PY79，克劳氏芽孢杆菌0/C)上。用相同的缓冲液清洗混合物3次，然后重悬于IOOiU底物(pNPP)中。45min后测定上层液体的OD (405nm)。吸附在孢子上的AP的量在AP活性参照的基础上，从OD值转化获得。图3显示了不同洗脱缓冲液对碱性磷酸酶从吸附孢子上的分离。在200 Ul结合缓冲液(PBS，pH4)中，饱和的碱性磷酸酶于室温被吸附在2X IO9个孢子(PY79，0/C和高压灭菌的PY79，0/C孢子)上。然后用相同的缓冲液清洗3次孢子，用不同的洗脱缓冲液(PBSpH4, PBS+1M NaCl，PBS+1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X), PBS+lMNaCl+1 % Triton X，PBS+辛烷基P -D-吡喃葡萄糖苷，PBS+辛烷基P -D-吡喃葡萄糖苷+IM NaCl)清洗I次，然后用PBS清洗I次。通过离心收集孢子体，然后重溶于100 u I的pNPP底物内。45分钟后在405nm处检测上清的0D。孢子上的AP百分比是通过与只用结合缓冲液(PBS，pH4)清洗的孢子上的AP总量比较而计算的。注意不同缓冲液中的AP活性相似。图4显示了 PBS浓度对碱性磷酸酶吸附在孢子上的影响。在200 ill结合缓冲液(PH4，分别为0. 001M, 0. 01M, 0. IM的PBS)中，饱和的碱性磷酸酶于室温被吸附在2 X IO9个孢子(PY79，0/C和高压灭菌的PY79，0/C孢子)上45min。用相同的缓冲液清洗3次混合物，然后重溶于100 U I的pNPP底物内。45min后测定上清的OD (405nm)。吸附在孢子上的AP量是在参照AP活性的基础上，从OD值转化获得。图5显示了免疫原吸附到孢子上。图板A :在不同pH值的缓冲液(PBS)中，纯化的PY79悬浮液与纯化的重组蛋白(2 Ug)于室温混合lh。离心收集孢子，清洗两次，并提取外被蛋白。利用1/10的提取物做大小分级的蛋白质免疫印迹检测。在不同情况下均检测到一个主要条带，如图所示。0. I y g的纯化重组蛋白用以比较。对照泳道(Con)显示了在没有蛋白质的整个流程中获得的孢子的相应的印迹结果。
图板B:如图板A所示，将2iig的破伤风毒素片段C(TTFC)结合到孢子外层。泳道1，作为对照的0. I ii g TTFC ;泳道2，非结合的PY79孢子；泳道3，PY79孢子+TTFC ;泳道4，未结合的高压灭菌的PY79孢子；泳道5，高压灭菌的PY79孢子+TTFC。图板C :孢子悬浮液(2 X 109菌落形成单位(c. f. u.))经离心后重悬于0. 2ml pH4的PBS中。纯化的重组TTFC蛋白(2 ii g)被添加到孢子悬浮液中，与结合混合物于室温孵育I小时。孢子经离心后，用PBS pH4清洗2次。洗过的沉淀再溶于200 u I PBS内，pH4(泳道A)，pH7 (泳道B)或pHIO (泳道C)。在指示时间点(30,60和90min)，对孢子进行离心，保存上清，取其中的1/20上样于12%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE胶)。沉淀重溶于IOOyl孢子外被抽提缓冲液中，在68°C孵育I小时，去除孢子外被中的蛋白质，其中的1/10上样于12% SDS-PAGE胶中。0. I ii g的重组蛋白作为对照进行电泳。图6显示了吸附动力学。孢子悬浮液(2X IO9Cfu)与10 y g的重组蛋白混合于PBS(pH4)中，于室温孵育，从而获得样品。用PBS(pH4)清洗孢子2次。〇，TTFC+PY79孢子；▲，GST-Cpa247_37Q+PY79 孢子；■，PA+HU58 孢子。图7显示了枯草芽孢杆菌PY79孢子的电动力学和疏水性。在pH介于I至12的水中，PY79孢子纯化悬浮液的Zeta ( ^ )电位测量(〇)。在pH3_8范围内，经孢子吸附碳氢化合物(SATH)试验确定PY79孢子的疏水性(■)。图8显示了蛋白吸收的离子和疏水性。图板A :重组的 ITFC (IOii g)与 PY79 孢子(2 XlO9Cfu)在 0. 2ml PBS(pH4，0. 15M)的纯化的悬浮液于室温混合I小时。经PBS两次洗涤后，将沉淀重悬于pH4PBS、IM NaCl,0. 1% TritonX-100，或IM NaCl+0. 1% TritonX-100，用相同的缓冲液清洗后在室温孵育15min，之后提取外被蛋白。所显示的数据代表残余结合蛋白的百分比。图板B :纯化的重组TTFC (10 U g)与纯化的PY79孢子(2 X 109cfu)纯化的悬浮液混合于含有不同浓度NaCl (0-4M)的0.2ml PBS (pH4)中。所有的结合混合物于室温孵育I小时。离心孢子后，用含有相同NaCl浓度的PBS缓冲液清洗2次，抽提外被蛋白，表示为抽提蛋白总量/2X IO9个孢子。图9显示了炭疽毒素的中和作用。用预吸附有PA(2 u g)的HU58孢子经鼻内使小鼠免疫，滴定测定血清(IgG，IgGl, IgG2a)和粘膜抗体(slgA)。通过毒素中和试验(TNA)在体外测定炭疽脱酸抗体。对照组包括未实验处理的小鼠、仅用HU58孢子免疫的小鼠或仅用PA蛋白免疫的小鼠。其中数据通过算术平均值处理，误差线为标准差。

图10显示了结合饱和度。纯化的重组蛋白，TTFC( O)、GST-Cpa247.( ▲)或PA ( )与2 X 109PY79孢子(TTFC和GST-Cpa247.)或HU58 (PA)混合，在室温孵育I小时。离心孢子，并清洗两次，使用相应的抗体经蛋白免疫印迹检测抽提的外被蛋白和孢子相关蛋白。图11显示了抗原特异的IgG应答。利用ELISA反应测定来自每个小鼠血清中的抗原特异性IgG。图板A和B : 口服(A)或鼻内⑶免疫后的GST-Cpa247_37Q-特异的I gG应答。用菌株HT251 (cotB-GST-Cpa247_3ro ； ■ )、PY79 (非重组；A )、预吸附的 PY79 孢子和 GST_Cpa247_370 多肽混合物( ; 口服途径为3. 6 ii g/剂量，经鼻途径为0. 15 u g/剂量)，纯化的GST-Cpa247_37Q蛋白(口；口服途径为3.6 yg/剂量，经鼻途径为0.15 yg/剂量)免疫的小鼠(丨)，和实验对照组的未免疫小鼠(A)。
图板C :经鼻方式对小鼠进行免疫后的TTFC-特异性IgG应答。血清来自免疫的动物末端血。图板D :经鼻方式接种菌株HU58(〇)、预吸附的HU58和PA多肽混合物(■ ;2y g/剂量)、纯化的PA蛋白(A;2iig/剂量)的小鼠(丨)以及仅接受PBS缓冲液的实验对照组小鼠(*)的PA特异性IgG应答。图12显示了抗原特异性IgGl IgG2a比例。如下文所述的来自免疫试验的血清样品用于分析IgGl和IgG2a亚类，显示IgGl相对于IgG2a的比例。图板A : 口服免疫吸附有GST-Cpa247_37(l的孢子，图板B :经鼻免疫吸附有GST-Cpa247_37(l的孢子；图板C :经鼻免疫吸附有PA的孢子，图板D :来自经鼻免疫吸附有TTFC孢子的小鼠体内IgGl，IgG2a和IgG2b的抗体滴定率。图13显示了抗原特异性粘膜反应。测定来自本文中所描述的免疫试验中免疫小鼠体内的肺洗液、唾液和排泄物中的抗体特异性slgA。图板A和图板B显示了用药60天GST-Cpa247^70-特异性IgA分析。图板C显示了用药63天肺洗液中的TTFC-特异性slgA分析。图14显示了抗原特异性\干扰素(IFN-Y)产量。利用酶联免疫吸附(ELISA)反应测定孢子免疫小鼠的IFN-Y应答。从处死小鼠体内取出脾细胞，用TTFC(图板A)或PA蛋白(图板B) (5 u g/ml)重新刺激。孵育6天后测定上清中的IFN- y。图15显示了经鼻用药小鼠体内的IgGl比IgG2a的比例。a)H5Nl病毒颗粒，b)吸附有H5N1病毒颗粒的PY79孢子，c)吸附有H5N1病毒颗粒的高压灭菌失活的PY79孢子，d)经鼻用药明矾和H5N1悬浮液。在所有情况下，H5N1病毒预制剂(来自国家生物学标准和质控研究所(NIBSC)的NIBRG-14)都用甲醛失活。每个结合试验使用I X IO7个孢子。明矾+H5N1实验组中低比率与高比例比较显示出孢子明显能够诱导产生Thl型为主的免疫应答。由于绝大多数佐剂有利于促进Th2型为主的免疫应答，因此这里显示出明矾具有高的IgGl IgG2a的比例。非常需要一种能够促进Thl型为主的免疫应答的佐剂。图16显示了俄勒R紫杉醇经由枯草芽孢杆菌孢子传递而结合在HCT-116结肠癌细胞上。0 iil，50 ill和200 ill的10 ii M俄勒冈紫杉醇与生长在2ml细胞培养基(DMEM培养基)中的HCT-116孵育4小时，作为不同浓度的俄勒冈紫杉醇结合在HCT-116上的阴性和阳性对照。没有紫杉醇的阴性对照为左图板。0.25 和I 紫杉醇的结合分别如右上和左下图板所述。0. 25 y M的俄勒冈紫杉醇吸附在5X IO7个孢子上的结合如右下图板所述。
实施例I材料与方法芽孢杆菌孢子的准备枯草芽孢杆菌PY79和克劳氏芽孢杆菌0/C被用于通过在琼脂孢子形成培养基(DSM)上，通过耗竭法培养出孢子。收集孢子，并通过溶菌酶处理破碎残余细菌繁殖体来纯化，用NaCl 1M, KCl IM和无菌水清洗。然后，将孢子重悬于无菌水中，连续稀释法进行计数，在DSM平板上划线后于-20°C冰冻。这种方式处理的孢子与平行试验未处理孢子相比 具有更好的结合能力。其原因有可能是因为溶菌酶的处理能够去除所有的细菌繁殖体，KCl和NaCl的处理则去除了来自培养基(用于产生孢子)中所有的蛋白酶、其他的蛋白质、多肽和重金属，这些物质会非特异性地结合在孢子表面。这种处理有助于去除引起孢子外表面疏水结合位点空间位阻的分子，从而增加与抗原作用的结合位点。吸附与脱附实验在本研究中，发明者设计实验确定pH、盐浓度对经高压灭菌和未经高压灭菌孢子的最大吸收时间、结合强度和吸附特性的影响。结合缓冲液是具有不同PH值(4，7，10)和不同浓度(0.001M，0.01M，0. 1M)的磷酸盐缓冲液(PBS)，其中根据每个实验的需要含有浓度不同的NaCl。2父109个？￥79和0/(孢子(经高压灭菌和未经高压灭菌)，在使用前用无菌水清洗两次，然后重悬于200 Ul结合缓冲液；保留15分钟使孢子带电。向含有2 X IO9个PY79和0/C孢子的悬浮液中添加10 u I碱性磷酸酶(AP) (0. 4u g/u I),于室温连续轻晃45分钟。吸附孵育后，离心收集孢子，用结合缓冲液或洗脱缓冲液清洗3到5次。碱性磷酸酶活性分析该研究中使用磷酸盐分析法来测定AP出现在孢子上，这是本领域的技术人员所熟知的。P-硝基苯基磷酸盐(pNPP)底物溶于二乙醇胺缓冲液(IOOmM 二乙醇胺/HCl，0. 5mMMgC12，pH9.8)制成浓度为lmg/ml的溶液。见蛋白操作手册，约翰M.瓦尔克。孢子悬于含有pNPP (lmg/ml)的100 U I 二乙醇胺缓冲液中，于室温孵育45分钟。在该分析中，在AP的催化下产生了 P-硝基酚和磷酸基团，P-硝基酚是一种有色的化合物，能够吸收405nm波长的光。出现这种颜色后，离心收集上清，并在405nm处测定其0D。为了在酶活性的基础上定量孢子上吸附的AP的量，连续稀释AP，在孢子上吸附AP测试的平行实验组确定其活性，并绘制标准曲线。孢子上AP的量是通过比较标准AP溶液与孢子上吸附的AP，在标准曲线的基础上计算得出。确立定量孢子上吸附的AP的方法，并与蛋白免疫印迹比较。当AP结合到孢子上后，采用十二烷基磺酸钠(SDS)-二硫苏糖醇抽提缓冲液来提取孢子外被蛋白。通过SDS-PAGE和使用抗AP抗体的蛋白免疫印迹进行提取蛋白的电泳。结果芽孢杆菌孢子对碱性磷酸酶的吸附在该实验中，发明者检测了 pH值对芽孢杆菌孢子吸附AP的影响。结合与洗脱使用pH值不同(pH4，pH7和pHIO)的同一缓冲液。结果表明，pH4时，AP吸附在孢子上，而在pH7和pHIO时则大大降低，高压灭菌的孢子也依赖于pH，在pH4时吸附最多。见图I。通过使用含有不同浓度NaCl (0-1M)的结合缓冲液(PBS pH4，0.01M)的实验研究离子强度对芽孢杆菌孢子吸附AP的影响。如图2所示。结果显示，在低浓度的NaCl条件下，碱性磷酸酶较多地吸附到0/C孢子上，高浓度的NaCl则会大大降低吸附。然而,PY79在低浓度和高浓度的NaCl (0. 5M，1M)中都吸附有大量AP。这可以通过PY79孢子的疏水性增加来解释，0/C孢子没有这种现象。为了更好的了解吸附机制，使用不同的磷酸缓冲液(0. 001M，0. 01M, 0. 1M)进行吸附试验，结果显示，吸附随着磷酸盐缓冲液浓度的提高而增强(如图4)。碱性磷酸酶从芽孢杆菌孢子上的脱附为了找到更多的证据说明AP吸附在孢子上的机制，该实验转为考虑AP从孢子上 的脱附。在PBS中进行结合，并用含有IM NaCl或I % Triton-X的PBS缓冲液进行清洗。重要的是，在不同的洗脱缓冲液中测定AP活性，结果显示PA的活性相同(数据未示出)。数据显示高盐浓度(1M NaCl)可将少量的AP从孢子上脱离，而大量的AP被1%的Triton-X洗脱。有趣的是，IM NaCl与1% Triton-X的混合物几乎可将所有的AP从孢子上脱附。见图3。讨论蛋白质等电点(pi)是指使该蛋白质不带净电荷时的pH值。当pH低于pi时,蛋白质携带正电荷，高于pi时携带负电荷。此外，孢子外被和芽孢杆菌内生孢子的外壁由蛋白质复合层组成。因此，孢子必然具有蛋白质的带电特性(P.马腾.毕舒瓦等，2004;克里斯托弗J.道尼等，2000)。芽孢杆菌孢子具有零电荷点(ZPC)的特性。当pH高于ZPC时，由于羧基、磷酸盐和氨基等功能团的去质子化，孢子带负电荷。当pH低于ZPC时，由于孢子表面上的主要基团发生质子化而带正电荷(李M.河与布拉德利M.特博，1997)。0/C和PY79孢子的ZPC约为2 (ZPC 2) ,AP的等电点为4. 5。因此，在pH4的环境下，带负电荷的孢子能够通过离子相互作用吸附带正电荷的AP。然而，在pH7和pHIO时，有一些AP吸附在孢子上。这一矛盾暗示可能有其他机制的参与，例如蛋白吸附的疏水相互作用。疏水相互作用与pH值呈负相关。随着pH的增高，疏水相互作用降低(迪尔德利A.斯莫尔等，1986)。这可以利用电荷屏蔽作用来解释，例如，羧基(pK2:4-5)在pH4条件下不带电荷，因为它们在PH小于4时发生了质子化，从而提高孢子的疏水性(尼桑.易等，1999)。现有数据说明大多数蛋白质在pH4条件下发生吸附，在pH7和pHIO时，吸附大大降低。因此，孢子对蛋白质的吸附取决于离子相互作用和疏水相互作用这两者。在不同浓度的NaCl条件下的吸附数据表明，随着NaCl浓度的降低，AP吸附到0/C孢子上的数量增加，而AP在低浓度和高浓度的NaCl条件下均能吸附在PY79孢子上。AP吸附随NaCl的低浓度而增加说明离子相互作用占优势，可解释为含NaCl的结合缓冲液中的可自由移动的AP比例的增加(张Z.等，2003)。此外，疏水相互作用在PY79吸附中发挥作用。这些结果与0/C孢子的亲水性和PY79孢子的高度疏水性是一致的。因此，根据所使用的孢子，结合缓冲液的疏水性影响着治疗药剂的吸附。根据孢子/治疗药剂的结合，使用不同盐浓度可提高疏水相互作用的水平。为了确定最佳盐浓度，应根据上述方法测定不同的盐浓度。实施例2材料与方法菌株枯草芽孢杆菌PY79是一株标准的原养型实验菌株，与168型菌株等基因(杨曼等，1984)。HU58是一株枯草芽孢杆菌的非驯化单菌(塔姆等，2006)。HT251 (amyE ( a -淀粉酶):cotB-GST-Cpa247_370)与PY79等基因系，其基因组上携带有重组基因，表达与GST-Cpa247.混合的已修饰的孢子外被蛋白，CotB，(黄等，2008)。RH103(amyE::cotB-tetC)在孢子表面表达免疫原，来自破伤风梭状芽孢杆菌的TTFC(破伤风毒素片段C)，嵌合融于CotB蛋白(伊斯迪卡多等，2001)。孢子的准备所有实验中使用的孢子是在琼脂孢子形成培养基(DSM)上生长和形成的(尼克尔森等，1990)。每批孢子都经过热处理(68°C，45min)，以确保杀死所有的繁殖体细胞。将孢子重悬于无菌的PBS (pH7. 4)，等分试样(I X IO11个孢子/ml)并存放于_70°C待用。使用(i)血球计-相差显微镜直接计数和(ii)连续稀释法和平板计数来确定孢子数量。SDS-PAGE 电泳分离并分析孢子外被蛋白(尼克尔森等，1990)。Zeta电位测定用3000HS马尔文Zeta测定仪(马尔文仪器有限公司(Malvern Instrument Ltd),UK)在24°C测定两种孢子的Zeta电位。将30 以5X IO9个孢子/ml的密度悬于超纯水(Milli-Q水)中的等分孢子添加到3ml —定pH和离子强度的溶液中，如下所述。使用HCl或NaOH调节其pH值。从相同的样本中进行两次测定,确定其平均值。利用Smoluchowski方程，从电泳迁移率来计算zeta电位。孢子吸附碳氢化合物(SATH)试验利用n-正十六烧作为碳氢化合物的孢子吸附碳氢化合物(SATH)试验确定两种孢子的表面疏水性(希尔等，2008)。用Milli-Q水或溶于Milli-Q水的IM NaCl来清洗纯化的孢子，16000g离心10分钟，以I X IO8个孢子/ml的密度重悬于0. IM NaCl。将孢子悬浮液(2ml)添入Iml n-正十六烷(奥德里奇公司(Aldrich))，涡旋lmin，于37°C孵育10分钟，再涡旋30秒。在600nm处测定水相吸收值。测量两次取平均值。通过原始孢子悬浮液(Ai)和正十六烷孵育后的水相(Af)的吸收度，根据方程％ H = [(Ai-Af)Ai] X 100确定疏水百分数(％H)。重组蛋白在含有重组质粒的大肠杆菌菌株BL21中表达蛋白。除了 GST-Cpa247_37Q，所表达的蛋白在3’端携带有多聚组氨酸标签，并在表达后使用AKTA层析系统(法玛西亚公司(Pharmacia))纯化。⑴TTFC pET-28b-TTFC表达的破伤风梭状芽孢杆菌TTFC是一条分子量为52. 6kDa的多肽(杜克等，2003)。(ii)PA pET-28b-PA表达来自炭疽芽孢杆菌的分子量为83. 5kDa的保护性抗原(PA)。其中允许膜分泌的分泌信号序列被删除(杜克等，2007)。(iii)GST-Cpa247_37(l :已有报道将41kDa的Sj26GST杂合蛋白融于产气荚膜梭菌a毒素(GST-Cpa247_37(l)的C-端(威廉姆森等，1993)，并使用GST-结合柱进行纯化。(iv) GST pET-28b-GST表达来自日本血吸虫分子量为26. 3kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26GST)。下文用GST代表Sj26GST。通过PCR扩增Sj26GST基因，并在载体pGEX3X13(法玛西亚公司)中进行克隆。抗体
通过在第1、14和28天经腹膜(i.p.)对小鼠注射2iig纯化蛋白使之免疫，获得多克隆抗体。抗PA经I 1000稀释，抗TTFC和抗GST-Cpa247^370经I 2000稀释。结合分析
除特别说明外，均以如下方法将蛋白质吸附在孢子上。离心含有2X109个孢子的悬浮液，重悬于0. 2ml pH4、pH7或pHIO的PBS中。除特别说明外，所有反应均在0. 15M的PBS中进行。纯化的重组蛋白被添加到孢子悬浮液和结合溶液中，于室温孵育。离心(lmin，室温)，用与结合溶液中使用的PH值相同的PBS缓冲液清洗2次。清洗后的沉淀重悬于100 ill孢子外被抽提缓冲液(尼克尔森等，1990)，于68°C孵育lh，以溶解孢子被覆蛋白，取1/10 上样于 12% 的 SDS-PAGE 胶。动物本研究使用的动物是无病原体的BalbAHh^ (英国哈伦实验室(Harlan UK))，用于产生抗体、分析PA或GST-Cpa247_37(l的免疫应答。TTFC免疫研究则使用C57BL/6小鼠(查士睿华公司(Charles River))。在所有情况下,均使用6_8周的雌鼠。动物饲养于伦敦皇家霍洛威大学动物房，在内政部项目许可PPL70/6126的指导下实施。免疫经鼻内(轻度麻醉，使用20 U I的吸管)或灌胃法(经口 ；每次填喂0. 2ml)对小鼠用药。所有实验均包括未免疫的对照组动物。⑴TTFC研究各组动物(3-10)经鼻免疫⑴纯化的TTFC蛋白，ii)预吸附的 PY79 孢子(2X IO9Cfu)和 TTFC 蛋白(I u g)混合物(PBS, pH4)，或iii)已用PBS缓冲液(pH4)洗两次的预吸附的PY79孢子(2XlO9Cfu)和TTFC蛋白(5 u g)混合物(PBS，pH4)。另一组为预吸附有TTFC (Iiig)的经高压灭菌的PY79孢子(2 X IO9Cfu ；15p. s. i.，30min) (PBS, pH4)。对照组包括未经处理(PBS, pH4)和经鼻内途径接受PY79孢子(2X109cfu)的小鼠。给药方案包括在第1、15、29和43天免疫。另一组小鼠在第1、2、3、22、23、24、43、44 和 45 天口服 2X IOiciCfu RH103 孢子(PBS，pH7. 4)作为阳性对照。在第64天用破伤风梭状芽孢杆菌破伤风毒素感染小鼠。(ii)GST_Cpa247.研究在第1、21和42天经鼻内或口服免疫各组六只小鼠，然后在第63天进行攻击。口服免疫组包括接受PY79孢子(5X IOiciCfu)、GST-Cpa247_3ro蛋白(3. 6 u g)的动物，以及接受预吸附(室温，80min ；PBS pH7. 4)有 3. 6 y g GST-Cpa247^370蛋白的PY79孢子(5X IOiciCfu)混合物。阳性对照包括5X IOiciCfu个HT251孢子(amyE: :cotB-GST-Cpa247_370)。一组经鼻内接受 PY79 孢子(2XlO9Cfu)，另一组接受GST-Cpa247.蛋白(0. 15 ii g)，还有一组接受预吸附的PY79孢子(2 X 109cfu)与GST-Cpa247^370 蛋白(0. 15 u g)的混合物(室温，80min ；PBS pH7. 4)。(iii)PA研究各组六只小鼠在第1、22和43天经鼻内施药。各组接受HU58孢子(2 X IO9Cfu)或接受在PBS (pH4)中吸附I小时2 ii gPA蛋白(炭疽芽孢杆菌保护抗原)的等量HU58孢子。体液应答为了分析抗GST-Cpa247.应答，于_1、20、40和60天取血清、唾液和粪便。对于PA-特异性应答，于_1、21、42和63天取血清样本。而TTFC应答则取末端血用于IgG分析。从处死动物肺部取肺洗液用于提取sIgA(温等，2007)。利用ELISA法测定抗体滴定量(杜克等，2003 ;黄等，2008)。IFN-y ELISA将取自服用免疫原(蛋白质、孢子或蛋白质与孢子)的小鼠的脾细胞(5X105)，接种于含完全培养基的96孔板中,用5 ii g/ml TTFC或PA蛋白质刺激,I ii g/ml ConA用作阳性对照，或仅用培养基，在37°C，含5% CO2的环境下培养细胞。6天后收集悬浮液，用于分析IFN-Y (黄等，2008)。IFN-Y (BD生物科学公司(BD Bioscience))用作标准品。毒素中和分析(TNA)目前已有使用原生264.7细胞株检测炭疽毒素的中和活性的报道(杜克等，2008)。免疫攻毒用破伤风梭状芽孢杆菌破伤风毒素或产气荚膜梭菌a毒素对小鼠进行免疫攻毒(杜克等，2003 ;黄等，2008)。需要注意的是，免疫攻毒实验与免疫应答评估是独立进行的。统计t_检验用于比较不同组间的差异。P值大于0.05说明差异不显著。结果口服免疫预吸附免疫原的孢子，保护小鼠免受产气荚膜梭菌a毒素的威胁在之前研究中，重组的枯草芽孢杆菌HT251可在其孢子表面表达GST-Cpa247_37Q，与孢子外被蛋白CotB融合(黄等，2008)。Cpa247_37Q是产气荚膜梭菌a毒素(Cpa)的C-端片段，当融于GST时，可赋予其保护免疫性(威廉姆森等，1993)。口服或经鼻服用HT251孢子的小鼠可抵御12半致死剂量(LD5tl)的a毒素。使用相同剂量的重组HT251孢子，给小鼠施用GST-Cpa247_37(l蛋白和非重组PY79孢子的混合物。对于口服途径来说，每次剂量为3. 6 ii g GST-Cpa247^370与PBS缓冲液(pH7. 4)的混合物，相当于在单剂HT251孢子内表达的重组GST-Cpa247_37(l蛋白的 量。经鼻途径则需0.15 yg。发明者对经口和经鼻途径服用GST-Cpa247^370的特异性IgG滴定度的分析表明其抗体反应水平和动力学与重组HT251孢子无差别。相反，仅用PY79孢子与蛋白则不产生显著水平(P > 0. 05)的GST-Cpa247_37(l特异性应答。发明者评估了经孢子免疫混合物免疫的小鼠抵御a毒素的能力(表I)。经鼻免疫小鼠获得的保护仅能抵御较低剂量的毒素(6LD5CI)，而经口免疫的小鼠则能够存活于相同剂量的毒素(6LD5CI)。仅用孢子或蛋白质都不能诱导抗体反应，最简单的解释是孢子与抗原能够促进它们的相互作用，并被免疫细胞获得。孢子吸附蛋白质为了确定一种蛋白免疫原是否能够结合到孢子上，发明者设计了一个吸附试验，将GST-Cpa247^370蛋白(分子量(mwt. )，40. 4kDa ；pl,5. 7)与PY79孢子混合，然后分析孢子外被蛋白抽提物和上清液，通过免疫印迹法确定GST-Cpa247_37(l的存在(图5A)。数据显示在pH4和pH7时，GST-Cpa247,有效吸附在孢子外层，但在pHIO时的结合则较低。发明者利用免疫定量计算出每个孢子吸附有2. 6X 10_4pg蛋白(每个孢子 3. 7X IO3个分子)。发明者扩展了该研究，以确定其他蛋白抗原是否吸覆到孢子表面。使用破伤风梭状芽孢杆菌的破伤风毒素片段C (TTFC ；mwt.，52. 6kDa ;pl，6. 34)与炭疽芽孢杆菌的保护抗原(PA ；mwt. ,83. 5 ;pl，5. 87)，二者都能有效结合到孢子上(图5A)。在两种情况下，均在PH4检测到结合，每个孢子结合4. 9 X l(r4pg TTFC (每孢子5. 4 X IO3个分子)，或每个孢子结合4.6X10_4pg PA(每孢子3. 2X103个分子)。发明者利用2X IO9个PY79孢子悬浮液中蛋白吸附量的增加来测定结合的饱和度，研究发现可吸附到孢子上的TTFC或GST-Cpa247_37Q的最大量为每2 X IO9个孢子吸附 l.Oug TTFC或 0. 5 u g GST-Cpa247.(见图10)。由于GST-Cpa247_37Q是GST和Cpa的嵌合体，发明者想知道在pH7和pHIO条件下，这种减少但仍可测定的结合是否是由于其中一种构成多肽。不与GST嵌合的Cpa是不稳定的，因此可检测到只有GST的结合(图5A)。GST可在所有三种pH条件下结合，而我们不能确定基于GST-Cpa247_37(l多肽的GST是否可以在所有三种pH条件下结合。意外的是，这里研究的三种蛋白质都可如“活”孢子那样有效吸附到经高压灭菌的PY79孢子上(图5B显示了 TTFC的结合)。由于吸附有GST-Cpa247_37(l的孢子能够在口服施用后产生一定的免疫应答，发明者研究了这些孢子是否能够防护含有胃蛋白酶的模拟胃液(巴博萨等，2005)。在这些条件下，发明者未检测到所吸附的蛋白质被降解的孢子具有任何保护(数据未显示)。由于枯草芽孢杆菌孢子外被的最外面一层仅包括5种外被蛋白，CotA, CotB, CotC, CotG和GotF，发明者测定了缺乏每个Cot基因的无效突变体对蛋白质的吸附。在每个情况下均能显示蛋白质吸附低于野生型PY79孢子，但不是完全没有(数据未显示)。可推断出吸附主要是多价的、非特异性的。通过检测从吸附孢子解离结合免疫原(TTFC)来衡量结合的稳定性(图5C)。结果表明，pH4条件下TTFC与孢子的结合可稳定至少90分钟,无明显解离。当悬浮在更高pH值的缓冲液时，上层液体中只检测到少量蛋白，这说明蛋白质与孢子的吸附是稳定的。所有三种重组蛋白表现出与孢子快速结合，大约在10分钟内实现最大程度的结合(图6)。利用孢子吸附碳氢化合物(SATH)试验确定PY79孢子的表面疏水性(希尔等，2008)，利用zeta电位检测确定电动力学特性(阿莫等，2001)。在pH值在I和12之间的水中确定孢子的zeta电位(图7),在整个pH范围内显示zeta负电位。在pHl时,zeta电位明显表示出一个明显增大的波峰增宽，表明这一 pH值接近等电点。在补充试验中，在IMNaCl或5mM CaCl2中重悬孢子，并在pH3，5和7时测量zeta电位。Zeta电位高于在水中的检测值，但仍保持负电位(数据未显示)。在存在Na+和Ca2+离子时，Zeta电位带更少的负电，这是因为阳离子屏蔽作用施加在孢子负电荷上。使用SATH分析，PY79孢子呈现几乎恒定的疏水性，在PH3至8范围内接近95% (图7)。离子与疏水相互作用对于蛋白质吸附是非常重要的蛋白质吸附在pH值为4时最大，说明离子相互作用在结合中发挥主要作用。带净正电荷的蛋白质可有效结合在带有净负电荷的PY79孢子上。然而，发明者发现用IM NaCl清洗的吸附有TTFC的孢子仅移除大约30%的结合免疫原，这表明天然状态时，结合不仅仅是离子的(图8A)。尽管用Triton X-100清洗不能释放吸附的蛋白质,但联合使用TritonX-100和NaCl可去除大约70%的结合蛋白，这证明了疏水相互作用(图8A)。本发明还检测了在含有不同浓度NaCl的PBS缓冲液中TTFC的吸附(pH均为4)(图8B)。在很低盐浓度时，结合较强，而当浓度增加到IM以上时迅速降低。在NaCl浓度大 于IM时，TTFC的结合稳定增加，至4M NaCl时达到最高水平。图I所示的结合研究是在能促成高水平结合的0. 15M(pH4)PBS缓冲液中进行的，其中电荷在吸附中发挥主要作用。在较高盐浓度时蛋白质结合能力的提高表明这种特异的孢子/治疗药剂的结合中疏水作用是非常重要的(施尔兹等，1983)。
灭活孢子可用作疫苗输送载体TTFC是用于评估预防破伤风疫苗的保护抗原(菲尔威瑟等，1987)。它作为嵌合体在孢子外被上表达融合至孢子外被蛋白CotB，重组孢子的口服方法显示出其对破伤风毒素的保护作用(杜克等，2003)。发明者设计了一系列的实验在施药末期使用攻击试验来测定PY79孢子经鼻内输送TTFC的效率(表I)。一组小鼠施用与过量TTFC蛋白(5 y g)在PH4时混合的孢子，然后用PBS(pH4)清洗除去任何未结合的蛋白质。在这些条件下可结合的TTFC量计算近似为每剂量I U go经这些孢子给药的小鼠可防御50LD5(i剂量的破伤风毒素。其他组小鼠施以混有
1U g TTFC未经洗涤的PY79孢子，也显示出对50LD5(I剂量的抵御。施以含有相同TTFC蛋白量且无孢子的小鼠却不能抵御。另一组免疫组是服以吸附有TTFC蛋白(Iyg)的经高压灭菌的PY79孢子。这些动物显示出对破伤风毒素的同等保护(50LD5CI)。作为对照组，研究者还通过灌胃的方式用表面上表达有TTFC的重组RH103孢子免疫小鼠。每次免疫使用
2X 101°个孢子，每次施以约2 ii g的TTFC，发明者能够实现与早前研究工作一致的对20LD5Q剂量的保护(杜克等，2003)。这些实验首先证明预吸附有一种抗原的孢子可经粘膜的方式接种，预防系统的病原体。其次，非活化或灭活的孢子与活性孢子同样有效。炭疽疫苗通过经常接种表达炭疽芽孢杆菌保护抗原(PA)的重组枯草芽孢杆菌孢子可显示出对炭疽毒素的防御(杜克等，2007)。毒素中和抗体的产生依赖于PA (或PA片段)在孢子表面上的展示或其从萌发孢子的分泌。根据发明者对TTFC和GST-Cpa247_37(l的研究，确定了PA是否吸附到孢子上，能够用于免疫小鼠抵御炭疽病。在第一个示例中，发明者测定了作为指示剂的毒素中和抗体(TNA)，研究显示中和抗体的水平与保护相关(杜克等，2007 ;弗里克-史密斯等，2002 ;弗里克-史密斯等，2002)。为了确定结合现象是否是实验室PY79菌株所特有的，发明者将一种枯草芽孢杆菌非驯化菌株，即HU58用于结合(塔姆等，2006)。发明者首次证实了 PA在pH4条件下结合在HU58孢子上，每个孢子结合约9. 34 XlO^pg PA——几乎是PY79孢子结合的两倍。经鼻接种吸附有PA的HU58孢子的小鼠与仅接种HU58孢子或PA的小鼠相比能够产生高水平的PA特异性IgG和slgA (图9)，其量远高于可保护小鼠抵御经腹膜感染的> IO3MLD (大于IO3倍的最小致死量，为2000LD5(i)的炭疽芽孢杆菌STI孢子量(1000)(杜克等，2007 ;弗里克-史密斯等，2002)。接种预吸附孢子后产生的广谱免疫应答对免疫预吸附GST-Cpa247.(图IIA和11B)、TTFC(图11C)或PA (图11D)孢子的小鼠获得免疫应答的范围进行详细地检测。每个例子中接种预吸附孢子的小鼠血清产生高水平的抗原特异性IgG，明显高于对照组(p < 0. 05)，包括仅接种蛋白质的对照组。同型抗原分析与和IgGl IgG2的提高表明了 GST-Cpa247_37Q特异体液反应的TH2偏移(图12A和12B)。PA-吸附的孢子PA-特异性IgGl IgG2a比率减少，表示PA特异性IFN- y产生中的有效诱导对ThI偏移的支持(图12C)。对于TTFC来说，IgG2a和IgGb的水平与刺激脾细胞诱导的IFN-Y相等(图12D)(与先前对TTFC-特异性细胞应答研究一致(Mauriello 等，2007))，可表明Th1-Th2应答的平衡。肺部、唾液和粪便中也产生有抗体特异性分泌IgA(sIgA)(图13A至C)证明了粘膜和系统应答(例如，IgG)的诱导。最后，接种有吸附TTFC或PA蛋白的PY79孢子小鼠体内强烈地诱导出细胞应答、THl偏移、IFN-Y产生(图14)(免疫接种吸附有GST-Cpa247_37(l的孢子的小鼠体内未检测IFN-Y)。综上所述，预吸附有抗原的孢子可产生广泛的应答，体液(粘膜和系统)和细胞特别需要有效接种。讨论细菌孢子显示出作为重组疫苗载体的效用，其中抗原表达在孢子表面或萌发孢子内。如此，孢子具有其独特的热稳定性优势，并使其具有特定的应用，例如旅行者疫苗或用于发展中国家。对于所有的重组细菌疫苗还有关于遗传修饰微生物使用的担忧。本工作证明了细菌孢子的一种特有的新型应用，抗原可固定在孢子表面，产生广泛的免疫应答。不仅刺激免疫应答，该方法还可以利用两种攻击模型赋予保护，以及通过影响中和抗体水平的第三种。如是，孢子能够作为佐剂使用，且无需进行遗传改造。对佐剂研发最重要的忧虑是其安全性，出于此考虑，明矾仍然是仅有的被许可用于人类的佐剂。芽孢杆菌孢子，包括枯草芽孢杆菌，广泛用作食品添加剂(例如，益生菌)，其中有很多种已注册供人类使用，包括枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌和最近的凝结芽孢杆菌，已获得来自美国食品与药品监督局的GRAS(总体安全)状态。加上灭活孢子可与活孢子一样有效地用于预防接种的事实，强有力地支持了它们作为安全佐剂的考虑。发明者的证明研究已使用经鼻接种，还可以考虑经口服，尤其是当使用适当的保护性外膜/赋形剂来保护治疗药剂时。孢子的大小(根据种类长度为0.8-1. 5nm)以最紧密的限度与微粒佐剂排列，同时在表面结构上展示的外生抗原准确地模拟潜在病原体的大小和外形(理查德弗里等，1998)。这种微粒佐剂很容易被抗原呈递细胞(APCs)摄取，诱导潜在的免疫应答(辛格等，1999)。研究显示，与仅有可溶性抗原相比，以这种方式展示的外生抗原通过类型I和类型II途径由MHC(主要组织相容性复合体)能提高效用1000-10000倍(哈丁等，1994 ;科瓦索维克斯-班科夫斯基等，1993)。吸附孢子免疫体液、局部和细胞应答的广泛性是疫苗所需的。IgG2a的高滴定量和IFN-Y的产生代表ThI偏移免疫应答和抗原决定簇的构象识别(施耐普等，1987)。对共聚物佐剂的研究提出了有必要维持免疫原的天然构象来产生保护免疫(亨特，2002)。除了本工作中实现的保护水平，发明者有证据表明结合到孢子上的蛋白质能够维持他们的天然构象。研究显示他们已将碱性磷酸酶结合到孢子上(在PH4时)，这说明保持了全部的酶活性(未公开数据)。该现象明显可用于酶的运输。口服孢子被M细胞摄入，进入派伊尔氏淋巴集结，在那里被APCs吸收(杜克等，2003;李等，2004)。发明者预测吸附的孢子也将使用相同的路径传输抗原。重要的是重组孢子也促进与吸附孢子相同范围的免疫应答，只不过后者每个孢子上负载的抗体量更多。例如，利用TTFC，重组孢子的单一经鼻剂量将传递0. g免疫原，相比之下使用孢子吸附则传递I U go此外，吸附的孢子可使抗原吸附在通常不能在孢子表面上表达的抗原。例如，发明者已经成功在不能表达的孢子上吸附了来自伯氏疟原虫的CSP抗原(未公开数据)。
蛋白质吸附到孢子上的重要一点是其在低pH值条件下有所加强。随pH值降到等电点以下，携带净正电荷的蛋白质将利用静电相互作用结合到仍带负电荷的孢子上。当PH在等电点以上，蛋白质与孢子将带负电荷，从而可以解释为什么结合最小或不存在。当然，GST-Cpa247^370的结合是一个例外，将在后文讨论。在盐和高离子强度存在下可显著增加吸附。这些现象已有报道，脊髓灰质炎病毒在低PH值条件下吸附在滤膜上，其中静电与疏水相互作用在病毒结合中发挥作用(施尔兹等，1983)。在病毒研究中，盐(NaCl或MgCl2)可增强疏水相互作用，如果打破了疏水相互作用，高离子强度(> 0. 3M)的NaCl仅破坏静电相互作用。在本发明中，用盐和去污剂处理吸附的孢子能够最有效地去除结合蛋白。这说明静电与疏水相互作用与结合有关。重悬吸附孢子于更高pH值的缓冲液中后，发现结合后很少有解离。这种稳定性对于佐剂的作用是重要且明显的，因为孢子会遇到中性PH值的鼻咽粘液。相反，口服可进一步加强抗原在孢子上的吸附，但不能在缺少保护外壳的情况下保护其免受胃液内的酶作用。发明者论证了大 量的其他免疫原能够以依赖于pH的方式结合到孢子上，数据未显示，包括来自困难梭菌的毒素A，来自单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌溶胞素和伯氏疟原虫的CSP蛋白。GST-Cpa247_37(l是一个例外，在低pH值条件下展现出最强的结合，同时也在pH高于其等电点条件下结合(5.7)。嵌合蛋白的GST或Cpa部分不能吸附到天然形式的孢子上，这可以解释获得的Th2偏移免疫应答。枯草芽孢杆菌孢子的外被由40种不同的蛋白组成(亨里克斯等，2007)。绝大多数芽孢杆菌的孢子也具有一个发育良好的外壁，一个以囊样结构围绕孢子外被的松散装配的糖基化包被。有证据表明枯草芽孢杆菌具有一个原始外壁(瓦勒等，2004)，更多见于枯草芽孢杆菌的天然菌株，以及这里所述的HU58孢子中(洪等，2009)。由于在此pH值下羧基完全质子化，低PH值条件下带净负电荷的原因不明。孢子在低pH值的结合与高pH值时相等，高pH值时孢子可能带有更多的负电荷，能够结合带正电荷的分子。这种应用在重金属的吸附和回收上已经开发(何等，1998，道尼，2001 ;庞等2005)。本研究的其他应用来自于小肽、生物药分子，以及早期报道的酶类的吸附，。许多研究显示口服孢子可抑制产毒素细菌引起的症状，包括大肠杆菌070:K80，肠炎型肠道沙门菌，产气荚膜梭菌和柠檬酸杆菌(拉拉吉尼等，2003 ;拉拉吉尼等，2001 ;迪阿伦佐等，2006)。本发明的孢子可用作疫苗制剂，提供一种用于推进和控制免疫应答的简单有效工具。表I免疫小鼠对a毒素和破伤风毒素威胁的防御
a毒素攻击试验a_____
w a毒素的剂量平均致死分组途径幸存数____(LD50)___时间土 (h)
未处理组____-__2__0/4__4.5±0.权利要求
1.一种将治疗药剂吸附到细菌孢子上的方法，该方法包含 在PH小于或等于治疗药剂等电点的条件下混合孢子和治疗药剂。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，该孢子是ー种芽孢杆菌或梭状芽孢杆菌孢子。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，该孢子是ー种芽孢杆菌孢子。
4.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在干，该孢子是变性孢子，从而防止孢子萌发。
5.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，多种不同的治疗药剂被吸附到孢子上。
6.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，治疗药剂连接至ー种调节剂。
7.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在干，pH值小于7。
8.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在干，pH值小于5。
9.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在干，pH值约为4或更低。
10.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在干，PH值高于孢子的零电荷点。
11. 根据权利要求I至9中任意一项所述的方法，其特征在干，pH值大于2。
12.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，孢子和治疗药剂在增强孢子与治疗药剂间的疏水相互作用的条件下混合在一起。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，当混合孢子与治疗药剂时，通过使用低盐浓度提高孢子与治疗药剂之间的疏水相互作用。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，低盐浓度小于0.3M。
15.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，在结合溶液中将孢子与治疗药剂混合在一起，其中结合溶液的PH值低于或等于治疗药剂的等电点，其盐浓度小于0. 3M。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于，低盐浓度小于0.15M。
17.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，该方法还包括用吸附的治疗药剂作为制药组分的孢子，结合一种或多种药用的载体或媒介。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，制药组分是ー种免疫原组分或疫苗组分。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，该方法还包括添加ー种佐剂。
20.根据上述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，治疗药剂是ー种抗原。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，抗原源自下述的一个或多个传染源 HIV,甲型肝炎、こ型肝炎、流感病毒(正粘液病毒)、疱疹病毒、乳多空病毒、杆状病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、埃希氏菌，包括大肠杆菌和肠毒性大肠杆菌(产肠毒素大肠杆菌)、军团菌、芽孢杆菌、奈瑟氏菌、嗜血杆菌、螺旋杆菌、棒状杆菌、肺炎球菌、沙门氏菌、分支杆菌、衣原体以及包括痢疾志贺菌、宋内志贺菌和福氏志贺菌的志贺氏杆菌，隐孢子虫、弓形虫、利什曼虫、泰勒虫和疟原虫。
22.根据权利要求I至21任一所述方法获得ー种细菌孢子，其特征在于，孢子表面上吸附有ー种或多种治疗药剂。
23.根据权利要求18或权利要求19所述方法获得ー种免疫原性组分或疫苗组分。
24.根据权利要求23所述的免疫原组分或疫苗组分，其特征在干，其包含ー种或多种来自ー种或多种传染因子的抗原。
25.根据权利要求24所述的免疫原组分或疫苗组分，其特征在干，其用于增加对抗ー种或多种传染因子的预防免疫应答。
26.根据权利要求25所述的免疫原组分或疫苗组分，其特征在于，使用的免疫原组分或疫苗经肠胃外、粘膜或舌下途径施药。
27.根据权利要求24所述的免疫原组分或疫苗组分的一种提高个体对ー种或多种传染因子免疫应答的方法，其特征在于，该方法包含施用有效剂量的所述免疫原组分或疫苗组分，所述的ー种或多种抗原来自上述一种或多种传染因子。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，免疫原组分或疫苗经肠胃外、粘膜或舌下途径施用。
29.根据权利要求I至21任一所述方法获得ー种孢子，孢子表面吸附有ー种或多种治疗药剂，用于治疗。
30.根据权利要求I至21任一所述方法获得ー种孢子，孢子表面吸附有ー种或多种抗原，用于提高个体应对ー种或多种抗原的保护性免疫应答。
31.根据权利要求I至21中任一所述方法的一种提高个体应对ー种或多种抗原的保护性免疫应答的方法，其特征在于，该方法包含施用一定量的表面吸附有ー种或多种抗原的细菌孢子。
32.根据权利要求I至21任一所述方法获得的ー种表面吸附有ー种或多种抗原的细菌孢子，其特征在干，该细菌孢子用作疫苗。
33.根据权利要求I至21中任一所述方法获得的制药组分，其特征在于，该制药组分包含ー种表面吸附有ー种或多种治疗药剂的孢子，以及ー种可制药用的载体或媒介。
34.根据权利要求33所述的制药组分，其特征在于，该制药组分经肠胃外、粘膜或舌下施用。
全文摘要
本发明涉及一种在孢子上覆盖一种或多种治疗药剂的方法。本发明还涉及一种通过该方法获得的被覆孢子，以及被覆孢子作为疫苗的应用。
文档编号A61K39/02GK102630163SQ201080053702
公开日2012年8月8日 申请日期2010年9月21日 优先权日2009年9月21日
发明者西蒙·迈克尔·卡廷, 黄鸿英 申请人:皇家霍洛威和贝德福德新学院