阵发性夜间血红蛋白尿、溶血性贫血和涉及血管内和血管外溶血的疾病状态的治疗的制作方法

专利名称：阵发性夜间血红蛋白尿、溶血性贫血和涉及血管内和血管外溶血的疾病状态的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用补体旁路抑制剂和补体成分C3片段活性用于治疗遭受涉及红细胞异常溶解——包括血管内和血管外溶血——的疾病的对象的方法和物质。更具体地，本发明涉及用于治疗具有阵发性夜间血红蛋白尿、aHUS、溶血性贫血和涉及补体介导的溶血的其它疾病的对象的方法和物质，所述补体介导的溶血可能涉及未被末端补体抑制剂，如C5活性抑制剂充分治疗的血管外成分。
背景技术：
补体介导的溶血性贫血是重要的健康问题，并引起许多红细胞疾病，如阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)。PNH是一种血液疾病，其特征为由于磷脂酰肌醇多聚糖A类(phosphatidylinositol glycan class) (PIG-A)基因的获得性体细胞突变,不能进行糖基化磷脂酰肌醇(GPI)-锚定生物合成的一个或少数造血干细胞的克隆扩充。受影响的后代细胞缺少所有的GPI锚定的表面蛋白——包括补体调节子⑶55和⑶59。因此，PNH红细胞(RBCs)易受激活的补体的影响，特别是易受膜攻击复合物(MAC)的影响，导致具有反复恶化的慢性血管内溶血。影响红细胞的其它补体介导的病症包括非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS);慢性溶血性贫血；抗体介导的自身免疫性溶血性贫血；由血红蛋白病如镰状红细胞病引起的贫血；由感染如疟疾引起的贫血；由于输血反应引起的贫血；和冷凝集素病(CAD) ο用艾库珠单抗(eculizumab)-针对补体成分5(C5)的单克隆抗体(Mab)-
的治疗已在PNH和其它血液疾病中部分有效。然而，具有PNH的患者的重要亚群显示对用抗C5Mab治疗的欠佳血液反应。在该亚群中，几乎没有观察到贫血的改善,一些患者仍然需要输血，具有持续溶血的持续征兆(网状细胞增多、提高的非结合胆红素)。Risitano andRotoli，Biologies，2:205-222 (2008)。复发可被表征为“突破”，其中尽管用末端补体抑制剂治疗，但是溶血活性可持续。Hill et al. , Blood, 106:2559-65 (2005) 对于这些对象，需要对PNH有效治疗的另外的方法和物质。补体抑制剂在本领域是已知的，并且已研发了定向补体抑制剂的新种类，其允许以导致抑制剂在补体被激活的组织部位高度局部的浓度，同时最小化潜在的不利全身效应的方式治疗。该类抑制剂包括，例如，TT30 (SEQ ID N0:3)、TT31和TT32。TT30是一种免疫调节化合物，其抑制补体旁路。TT30包括H因子蛋白的补体旁路抑制部分，其通过与补体受体2蛋白(CR2或CD21)部分的融合而靶向补体激活和炎症的部位，已知该补体受体2蛋白(CR2或CD21)结合补体成分3 (C3)的固定组织/细胞的片段。TT31与TT30相似，但是含有H因子蛋白的补体旁路抑制部分的另外的拷贝。TT32包括补体受体I (CRl)的补体抑制部分，其通过与CR2蛋白的同一部分结合而被靶向。已知CRl是较H因子更宽的补体抑制齐IJ。TT32将因此不但抑制补体旁路，而且将局部地抑制补体经典途径和凝集素途径。合适的定向抑制剂在Gilkeson et al.，美国专利公开2008/0221011中有描述，其公开在此通过引用被特别地并入本文。发明概述补体系统的调节表示与补体激活相关的许多病理状态的治疗形式。然而，如上面所概述的，全部或部分由于血管外溶血，具有PNH和其它形式贫血的对象的重要亚群对用末端补体抑制剂，如抗C5Mab、艾库珠单抗的治疗没有最佳反应。
本发明人已发现遭受补体介导的影响红细胞的疾病，如PNH——不被末端补体抑制剂有效地或最佳地治疗——的对象令人惊讶地可用抑制补体旁路的组合物有效地治疗，并通过该活性阻断放大性C3转化酶在PNH红细胞表面上的形成和活性。在某些实施方式中，抑制补体成分C3激活的本发明的组合物因此不仅抑制补体旁路的放大环路，还可通过自发的C3 ‘空转(tickover)’部分地抑制旁路途径激活。在某些实施方式中，除了补体旁路的抑制，本发明的组合物可进一步显示对其它补体途径，如经典和凝集素激活途径的抑制作用。本发明人已发现具有对末端补体抑制剂，如艾库珠单抗具有欠佳血液应答的对象可显示由除MAC外的补体效应机理介导的血管外溶血。基于RBCs上补体部分3 (C3)的流式细胞计数分析，我们提供GPI阴性红细胞的选择性C3调理作用的证据。该现象的程度趋于与对艾库珠单抗的临床应答相关，并可以是PNH病理生理学中新的现象的表示。虽然不被任何一个理论束缚，但是在C5水平靶向末端补体可能不保护红细胞抵御通过可导致血管外溶血的早期补体成分(即，C3)的损伤。据信，用末端补体抑制剂，如艾库珠单抗的治疗可允许低水平的血管内溶血继续进行，可能通过涉及C5转化酶积累的机制足以使LDH保持在高的正常范围和使HgB保持低的正常范围，该C5转化酶在单克隆抗体的正常开关循环期间最终可胜出针对C5的末端补体抑制剂。这得到溶血的药物代谢动力学‘突破’的发生的支持，已报道这在艾库珠单抗的血液水平降到‘低谷(trough) ’ 35ug/mL浓度以下的患者中发生。本发明人认为突破还可由其它危险情况，如病毒感染或增加的补体激活的其它原因——其可导致干扰艾库珠单抗、C5和C5转化酶之间的平衡——引起。本发明人认为，PNH红细胞上C3片段的积累通过网状内皮系统中细胞的激活促成病毒相关的突破。此外，然而，通过在细胞表面界面结合C5，用末端补体抑制剂对溶血性贫血如PNH的治疗可有助于C3、C3转化酶、C3片段和C5转化酶的积累，其可促使对象不能实现和稳定地保持完全正常的血清LDH和HgB水平。因此，本发明提供用于治疗具有补体介导的溶血的对象如遭受PNH的那些对象的方法。这样的方法靶向早期的补体激活，并能控制血管内溶血，以及减少或避免由未控制的C3激活和调理作用产生的可能的血管外溶血。本发明的方法和组合物可因此更有效地治疗遭受PNH或其它溶血性贫血的患者，可有效地获得和保持正常的血清LDH和HgB水平并减少或消除已在用末端补体抑制剂治疗的患者中观察到的‘突破’溶血危机的发生。因此，本发明的方法和组合物还更有效地治疗遭受PNH的患者，同时减少或避免这种‘突破’溶血危机的发生。在某些实施方式中，本发明包括治疗具有阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)或其它补体介导的影响红细胞的溶血疾病的方法，该方法包括给予有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路活性的组合物，其中所述组合物抑制补体成分C3(C3)的局部激活，例如通过起始C3转化酶而抑制旁路途径激活和/或通过抑制放大性C3转化酶的形成和/或活性和通过C3片段的红细胞调理作用。在其它实施方式中，本发明包括治疗显示血管外溶血的对象的方法，该血管外溶血可由于补体介导的影响红细胞的溶血疾病，如PNH引起，该方法包括给予有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路活性的组合物，其中所述组合物抑制补体成分C3(C3)的局部激活，例如通过起始C3转化酶而抑制旁路途径激活和/或通过抑制放大性C3转化酶的形成和/或活性和通过C3片段的红细胞调理作用。
末端补体抑制剂选择性地抑制补体蛋白C5的切割，并可以是例如，人源化抗C5抗体或其抗原结合片段，如艾库珠单抗或培克珠单抗(pexelizumab)。因此,在某些实施方式中，本发明包括对具有阵发性夜间血红蛋白尿的对象的治疗，其中所述对象先前已用抗C5抗体，如艾库珠单抗或培克珠单抗治疗，但是他们的PNH疾病状态和/或症状持续。在某些实施方式中，本发明的方法包括治疗具有补体介导的影响红细胞的溶血疾病，如阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS);慢性溶血性贫血；和冷凝集素疾病(CAD)的对象，其中所述对象显示以下特征中的至少一个，该特征可以是残余贫血和/或补体介导的血管外溶血和/或血管内溶血没有完全控制的症状对象显示进行的或间歇的血管内溶血和/或血管外溶血引起的连续红细胞丧失的征兆或症状；对象具有受C3片段调理的红细胞；对象需要定期输血；对象具有低的正常水平血红蛋白或低于正常水平的血红蛋白；对象具有低的正常水平血小板或低于正常水平的血小板；对象具有高的正常网状细胞或高于正常的网状细胞；对象具有高的正常胆红素或高于正常的胆红素；或对象具有铁超负荷或面临铁超负荷的危险。以上特征还可用于监测对象对用根据本发明的补体旁路抑制剂治疗的应答的进展，和如果认为在临床上合适，用于修改剂量方案。在某些实施方式中，具有补体介导的影响红细胞的溶血疾病，如PNH的对象先前已用末端补体抑制剂治疗，但是持续显示以上特征中的至少一个。在这种情况下，本发明提供用于避免或减少以上特征中的至少一个的发生和/或严重性的方法和组合物。在另一方面，本发明包括给予不依赖具有补体介导的影响红细胞的溶血疾病，如PNH的对象的输血的方法，其中该对象显示对用末端补体抑制剂的治疗欠佳的应答。这样的欠佳的应答可包括显示残余贫血和/或补体介导的血管外溶血的以上特征中的至少一个的对象。该方法包括给予有效量的抑制补体旁路活性的组合物，其中所述组合物抑制补体成分C3 (C3)的激活，例如通过起始C3转化酶而抑制旁路途径激活和/或通过抑制放大性C3转化酶的形成和/或活性和通过C3片段的红细胞调理作用。在另一方面，本发明包括减少具有PNH的对象的溶血的方法，该方法包括给予有效量的抑制补体成分C3(C3)的激活的组合物，例如通过起始C3转化酶而抑制旁路途径激活和/或通过抑制放大性C3转化酶的形成和/或活性和通过C3片段的PNH红细胞调理作用。在再一方面，本发明包括减少具有PNH的对象的残余贫血的方法，该方法包括给予有效量的抑制补体旁路活性的组合物，其中所述组合物抑制补体成分C3(C3)的激活，例如通过起始C3转化酶而抑制旁路途径激活和/或通过抑制放大性C3转化酶的形成和/或活性和通过C3片段的红细胞调理作用。在再一方面，本发明提供增加能幸存于补体攻击的PNH红细胞比例的方法，该方法包括给予有效量的抑制补体成分C3 (C3)的激活的组合物，例如通过起始C3转化酶而抑制旁路途径激活和/或通过抑制放大性C3转化酶的形成和/或活性和通过C3片段的PNH红细胞调理作用。在本发明的某些方面，除了抑制补体旁路，该组合物还可抑制经典补体途径和凝集素补体途径中的一个或多个。例如，补体受体I(CRl)被期望对所有三个补体途径具有抑制效应。虽然不直接是补体旁路抑制剂，但是MASP-I的抗体在本发明中也是有用的。这·是因为从系统中去除MASP-I可减少通过经典途径和凝集素途径产生的C3b的量。获得较少的C3b，补体旁路的放大环路可至少被部分抑制。因此，为了本发明的目的，认为MAPI和MASP-I的抗体是可在本发明的某些实施方式中有用的补体旁路抑制剂。参见，Skjodtet al. , Molecular Immunology, 47:2229-30(2010);and Petersen et al. , MolecularImmunology 38:133-149(2001)。在再一方面，本发明提供减少或避免用末端补体抑制剂治疗溶血的对象中‘突破’溶血危机发生的方法。作为对实现以上方法有用的优选实施方式，本发明提供抑制补体旁路活性的药剂和组合物。这样的药剂和组合物可包括有含补体受体2 (CR2)蛋白或其生物学活性片段的融合蛋白；和补体活性的调节剂，其通过调节补体成分C3或其切割片段，和/或C3转化酶的存在，例如通过起始C3转化酶而抑制旁路途径激活和/或通过抑制放大性C3转化酶的形成和/或活性，停止补体级联的进一步进行以形成膜攻击复合物，和阻止或减少这样的C3分子或其片段结合红细胞，并特别地阻止或减少C3片段对PNH红细胞的调理作用而起作用。在优选实施方式中，补体旁路抑制剂可包括CR2蛋白的融合物，或包括CR2至少前两个氨基末端短共有重复序列(short consensus repeat) (SCR)结构域的片段,其与H因子(FH)蛋白或其生物学活性片段融合。FH蛋白的生物学活性片段可包括的至少前四个氨基末端SCR结构域。一个这样的补体抑制剂是TT30 (SEQ IDNO: 3)——包括融合到!7H的前五个氨基末端SCR结构域的CR2的前四个氨基末端短共有重复序列(SCR)结构域的融合蛋白。另一个这样的补体抑制剂包括融合到FH的前四个氨基末端SCR结构域的CR2的前两个氨基末端SCR结构域。连接可以在结构域的任何一端，以至于融合蛋白可被从氨基末端到羧基端描述为CR2-FH或FH-CR2。在其它优选实施方式中，补体旁路抑制剂可包括CR2蛋白的融合物，或其靶向片段，其包括融合到选自Crry、DAF、MCP、补体因子I、compstatin或CR1、或其生物学活性片段的补体抑制剂的CR2的至少前两个氨基末端短共有重复序列(SCR)结构域。在其它优选实施方式中，融合蛋白的抑制部分可包括针对选自B因子、D因子或备解素的因子的抗体；或其抗原结合片段。如上所述，虽然没有指向补体旁路抑制剂，但是MASP-I的抑制剂可有效地减少存在的C3b的量，由此至少部分抑制补体旁路的放大环路。因此，MASPl蛋白的抑制剂，如MASPl的抗体和内源性MASPl抑制剂MAPI在本发明的某些实施方式中可以是有用的。在优选实施方式中，补体旁路抑制剂包括CR2蛋白的融合物，或其靶向片段，其包括在第三SCR结构域内融合到因子B抗体的CR2的至少前两个氨基末端短共有重复序列(SCR)结构域，并阻止C3bBb复合物或其抗原结合片段的形成。合适的抗体，例如，在Holerset al.,美国专利公开2005/0260198和在Emblen et al.，美国专利公开2008/0299114中有描述。这些文件的公开在此通过引用被特别地并入本文。连接可以在结构域的任何一端，以至于融合蛋白可从氨基末端到羧基端被描述为CR2-补体抑制剂或补体抑制剂-CR2。在另外的实施方式中，补体旁路抑制剂可包括融合到补体抑制部分的单克隆抗体部分的融合物。单克隆抗体部分包括单克隆抗体，或其结合片段，其针对补体成分3 (C3)或其将结合包括选自C3b、iC3b、C3dg和C3d的一个或多个结合结构域的C3片段。补体抑制部分包括补体抑制剂，或其生物学活性片段，其选自H因子蛋白、Crry、DAF、MCP、补体因子I、compstatin或CR1、或其生物学活性片段。在其它优选实施方式中，融合蛋白的抑制部分可包括针对选自B因子、D因子、MASPl或内源性MASPl抑制剂MAPI的因子的抗体；或其抗原结合片段。连接可以在结构域的任何一端，以至于融合蛋白可从氨基末端到羧基端被描述为抗C3-补体抑制剂或补体抑制剂-抗C3。在进一步的实施方式中，本发明包括用于治疗具有补体介导的影响红细胞的溶血疾病，如PNH的对象的方法和物质，其中所述方法包括给予遭受这样的疾病痛苦的对象末端补体抑制剂和补体旁路抑制剂。在该方法中，补体抑制剂可以任何顺序同时或相继给予。末端补体抑制剂可包括抗C5单克隆抗体，如艾库珠单抗或培克珠单抗，或另一个末端补体抑制剂，其抑制C5或包括C6至C9的膜攻击复合物(MAC)的其它成分。例如，⑶59或TT33——其为定向CD59融合蛋白——可用作末端补体抑制剂。在某些实施方式中，补体旁路抑制剂可抑制补体旁路活性，其中所述组合物抑制补体成分C3 (C3)、C3片段和/或C3转化酶的激活，例如通过起始C3转化酶而抑制旁路途径激活和/或通过抑制放大性C3转化酶的形成和/或活性和通过C3片段的PNH红细胞调理作用。在其它实施方式中，补体旁路抑制剂可另外抑制其它补体途径，如经典途径和凝集素介导的途径。在另一方面，本发明提供用于PNH，或涉及补体介导的血管外溶血成分的其它疾病治疗的组合物，该组合物包括以下的组合a)末端补体抑制剂；和b)补体旁路抑制剂。末端补体抑制剂可优选包括抗C5抗体，如艾库珠单抗或培克珠单抗。补体旁路抑制剂可优选包括含有补体受体2 (CR2)蛋白或其生物学活性片段的融合蛋白；和补体活性的调节剂，其通过调节补体成分C3、其切割片段、和/或C3转化酶的存在，和阻止或减少这样的C3分子或其片段结合红细胞，并特别地阻止或减少C3片段对PNH红细胞的调理作用而起作用。在特别优选的实施方式中，补体旁路抑制剂可包括CR2蛋白的融合物、或包括CR2的至少前两个氨基末端SCR结构域的片段，其融合到H因子蛋白或FH的生物学活性片段。一个这样的补体旁路抑制剂包括融合到H因子补体抑制部分一包括人H因子前四个N端SCR结构域——的CR2靶向结构域部分。在特别优选的实施方式中，补体旁路抑制剂是TT30 (SEQ ID NO: 3),其包括融合到!7H的前五个N端SCR结构域的CR2的前四个N端SCR结构域。在另一个优选实施方式中，补体旁路抑制剂是TT31，其包括融合到两个拷贝的FH的前五个N端SCR结构域的CR2的前四个N端SCR结构域。在其它优选实施方式中，补体旁路抑制剂可包括CR2蛋白、或片段，其包括融合到选自抗B因子抗体、抗备解素抗体、抗D因子抗体、I因子蛋白、compstatin、Crry、DAF、MCP或CR1、或其生物学活性片段的补体抑制部分的CR2的至少前两个氨基末端短共有重复序列(SCR)结构域。一个这样的优选实施方式是TT32，其包括融合到CRl的前十个SCR结构域的CR2的前四个SCR结构域。由于CRl不但抑制补体旁路，而且抑制经典途径和凝集素介导的补体途径的能力，抑制剂如TT32在涉及溶血的血管内和血管外成分的其它疾病状态中以及在自身免疫性疾病或相关状态中可找到更大范围的应用。 在其它优选实施方式中，补体旁路抑制剂可包括融合到补体抑制部分的单克隆抗体部分的融合物。单克隆抗体部分包括单克隆抗体，或其结合片段，其针对补体成分3 (C3)或其将结合包括选自C3b、iC3b、C3dg和C3d的一个或多个结合结构域的C3片段。补体抑制部分包括补体抑制剂，或其生物学活性片段，其选自H因子蛋白、抗B因子抗体、抗备解素抗体、抗D因子抗体、I因子蛋白、compstatin、抗MASPl抗体、抗MAPI抗体、Crry、DAF、MCP或CRl或其生物学活性片段。在优选实施方式中，补体抑制部分包括(a)人H因子蛋白的前四个SCR结构域；(b) Crry的前五个N端SCR结构域；或(c) CRl的前十个SCR结构域；或(d)包括前三个N端SCR结构域的MCP ;包括SCR结构域2_4的可溶性DAF，其具有或没有富含丝氨酸-苏氨酸的区域，但是没有糖基化磷脂酰锚。—方面本发明提供治疗具有影响血细胞的补体介导的溶血疾病的对象的方法，该方法包括给予有效量的抑制补体旁路激活的组合物，其中所述组合物抑制补体成分C3 (C3)的激活和通过C3片段的红细胞调理作用。另一方面本文提供治疗对象中补体介导的溶血的方法，该方法包括给予有效量的抑制补体旁路激活的组合物，其中所述组合物维持血清乳酸脱氢酶和血红蛋白的正常水平。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，组合物选择性地抑制补体旁路。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，抑制补体旁路活性的组合物包括含有补体受体2(CR2)蛋白或其生物学活性片段的融合蛋白jPH因子(fH)蛋白或其生物学活性片段。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，融合蛋白包括融合到fH的前五个氨基末端SCR结构域的CR2的前四个氨基末端短共有重复序列(SCR)结构域。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，该方法进一步包括给予对象末端补体抑制剂。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，末端补体抑制剂抑制补体蛋白C5(C5)的切割。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，末端补体抑制剂是人源化抗C5抗体或其抗原结合片段。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，末端补体抑制剂是艾库珠单抗。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，对象具有阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)，且在缺少组合物的情况下，对象的红细胞受到C3片段的调理作用。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，对象先前已用末端补体抑制剂治疗。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，对象对末端补体抑制剂的治疗不起反应、部分起反应、或有进展。
在本文描述的任何方法的某些实施方式中，对象具有以下特征中的一个或多个对象显示进行的或间歇的血管内溶血和/或血管外溶血引起的连续红细胞丧失的征兆或症状；对象具有受C3片段调理的红细胞；对象需要定期输血；对象具有低的正常水平的血红蛋白或低于正常水平的血红蛋白；对象具有低的正常水平的血小板或低于正常水平的血小板；对象具有高的正常网状细胞或高于正常的网状细胞； 对象具有高的正常胆红素或高于正常的胆红素；或对象具有铁超负荷或面临铁超负荷的危险，其中所述方法包括给予有效量的抑制补体旁路活性的组合物。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，对象需要定期输血。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，对象因此被给予独立的输血。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，对象具有低于正常水平的血红蛋白。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，组合物增加对象中红细胞的存活。在本文描述的任何方法的某些实施方式中，补体介导的溶血疾病是镰状细胞贫血。应当理解，本发明本文描述的方面和实施方式包括“由方面和实施方式组成”和/或“基本上由方面和实施方式组成”。本文提到“约”的值或参数包括(和描述)涉及值或参数自身的变化。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。如本文和所附权利要求所用，单数形式“一 (a) ”、“或”和“所述(the) ”包括复数的指示物，除非上下文另外明确指出。术语“对象”指包括人类在内的哺乳动物。对象包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类。附图简述图I显示测量C3在PNH对象红细胞上的结合的单色流式细胞术的结果。沿着Y轴绘制红细胞计数；沿着X轴绘制抗C3荧光异硫氰酸盐(FITC)计数。图Ia显示正常对照对象的结果；图Ib显示具有冷凝集素疾病(CAD)的对象的结果；图Ic显示未用末端补体抑制剂治疗的PNH对象的结果；图Id显示已用末端补体抑制剂艾库珠单抗——C5的抗体——治疗的两个PNH对象的结果。图2显示测量C3在先前已用艾库珠单抗治疗的PNH对象RBC上的结合的双色流式细胞术结果。沿着Y轴绘制⑶59+[正常]或⑶59-[PNH]红细胞的数。沿着X轴绘制C3+[包被有C3]或C3-[未包被]细胞的数。左上象限代表⑶59+/C3-细胞，S卩，正常红细胞。右上象限代表⑶59+/C3+细胞，S卩，由C3包被的正常红细胞。左下象限代表⑶59-/C3-细胞，S卩，未由C3包被的PNH红细胞。右下象限代表⑶59-/C3+细胞；即，由C3包被的PNH红细胞。图2a显示正常对照对象的结果；图2b显示具有冷凝集素疾病(CAD)的对象的结果；图2c显示未用末端补体抑制剂治疗的PNH对象的结果；图2(1显示显示已用末端补体抑制剂艾库珠单抗——C5的抗体——治疗的四个PNH对象的结果。图3显示C3在PNH对象红细胞上的结合(Y轴)与全部PNH (⑶59_) RBC百分数(X轴)的相互关系。可注意到，包被有C3的RBCs的存在与PNH RBC群体大小相关。图4显示未用或先前已用Ecu治疗的患者的PNH群体内C3+RBCs的百分数。可注意到，C3只在接受末端补体抑制剂艾库珠单抗一C5的抗体一的那些对象中结合到PNHRBCs上，在这样的对象中具有宽的异质性。图5显示PNH RBCs上的C3结合的动力学。图5a显示用艾库珠单抗治疗之后C3结合的出现。可注意到，C3结合在开始抗C5抗体治疗之后几周出现。图5b显示长期(两年)的时间里C3的结合。 可注意到，在该时期内C3结合保持非常稳定。图6显示PNH RBCs上的C3结合与先前已用末端补体抑制剂艾库珠单抗——C5的抗体——治疗的PNH对象的血液反应的相互关系。可注意到，获得对艾库珠单抗最好的血液反应的对象具有较少的结合C3的RBCs。图7显示PNH RBCs上的C3结合(Y轴)与绝对的网状细胞计数(ARC) (X轴)的相关性。可注意到，C3结合与持续溶血的测量结果，如ARC相关，但不与LDH相关。因此，在理论上推测持续的溶血主要部分地由于补体介导的血管外溶血，因此很大程度上不受末端补体抑制剂的影响。图8显示来自两个对象的51Cr标记的红细胞的体内存活以及它们在脾(实线)和肝(虚线)中的摄取。在第一个对象(图8a)中，持续七天获取测量结果。在第二个对象中，持续二十天获取测量结果(图Sb)。过度计数指超过对照的过量。还应当注意，脾和肝中增加的RBCs捕获在所有研究的对象中都检测到。图9显示来自先前未治疗的对象的补体介导的PNH RBCs溶血，特别是用各种浓度的TT30——C3转化酶的有效抑制剂——治疗的PNH RBCs的存活。数据代表在各个时间点存活的RBCs的百分比对给予的TT30的浓度。可注意到，TT30剂量较高时，PNH RBCs存活较大。

图10显示来自先前未治疗的对象的PNH RBCs的存活，在五天过程里有各种治疗。数据代表用酸化血清+镁(AcS+Mg)治疗的细胞中存活的PNH RBCs百分比，(a)没有抑制剂；(b)具有 3000nM 的 TT30 (TT);和(c)具有 4500nM 的 TT30 (TT)。图11显示来自先前未治疗的对象的PNH RBCs的存活，在5天里用各种浓度的TT30治疗。数据代表用各种浓度的TT30的存活PNH RBCs百分比对治疗时间。可注意到TT30剂量较高时，存活的PNH RBCs百分比增加。图12显示来自先前未治疗的对象的补体介导的PNH RBCs溶血，特别是用TT30——C3转化酶的有效抑制剂——治疗的PNH RBCs的存活。数据代表与用酸化血清溶解的RBCs相比在各个时间点溶解的RBCs的百分比对给予的TT30的浓度。可注意到，TT30剂量较高时，溶解的PNH RBCs的百分比降低。图13显示来自先前已用艾库珠单抗治疗的对象的PNH RBCs存活，在五天过程里进行各种治疗。数据代表用酸化血清+镁(AcS+Mg)治疗的细胞中PNH RBCs存活的百分比，(a)没有抑制剂；(b)具有 3000nM 的 TT30 (TT);和(c)具有 4500nM 的 TT30 (TT)。图14显示来自先前已用艾库珠单抗治疗的对象的PNH RBCs存活，在5天里用各种浓度的TT30治疗。数据代表用各种TT30浓度的存活PNH RBCs的百分比对治疗时间。可注意到TT30剂量较高时，存活PNH RBCs的百分比增加。图15显示来自先前已用艾库珠单抗治疗的对象的补体介导的PNH RBCs溶血，特别是用TT30——C3转化酶的有效抑制剂——治疗的PNH RBCs的存活。数据代表与用酸化血清溶解的RBCs相比在各个时间点溶解的RBCs的百分比对给予的TT30的浓度。可注意到TT30剂量较高时，溶解的PNH RBCs的百分比降低。图16显示在用不同浓度的TT30治疗之后24小时PNH RBCs的溶血抑制百分比。将来自总共四个对象的七个独立实验的结果集合。图17显示各个时间点之后来自先前未治疗的对象的PNH RBCs的命运。在24小时的时期里进行测量。治疗是(图17a):酸化血清(AcS);(图17b) :AcS+3000nMTT30。表征细胞的溶解(红色)和存活；进一步表征存活细胞的C3-包被；C3-阳性(黄色)和C3-阴性(绿色)。图18显示各个时间点之后来自第二个先前未治疗的对象的PNH RBCs的命运。在24小时的时期里进行测量。治疗是(图18a):酸化血清(AcS)；(图18b) AcS+3000 nMTT30。表征细胞的溶解(红色)和存活；进一步表征存活细胞的C3-包被；C3-阳性(黄色)和C3-阴性(绿色)。·图19显示各个时间点之后来自先前未用艾库珠单抗治疗的对象的PNH RBCs的命运。在24小时的时期里进行测量。治疗是(图19a):酸化血清(AcS)；(图19b) AcS+3000nMTT30。表征细胞的溶解(红色)和存活；进一步表征存活细胞的C3-包被；C3-阳性(黄色)和C3-阴性(绿色)。图20显示缺少保护的情况下红细胞上补体旁路激活的顺序。图21显示来自补体旁路激活的红细胞的正常保护的顺序。图22显示利用抗C5单克隆抗体的红细胞的保护的顺序。图23显示如通过本发明的定向CAP抑制剂获得的红细胞上的补体旁路激活的抑制顺序。图24显示TT30与针对哮喘的人和食蟹猴的抗C3b单克隆抗体的结合。图25显示在兔红细胞溶血试验中TT30引起的RBC溶解的浓度依赖性抑制。图26显示缺少EDTA的情况下人血清有效地溶解兔RBCs。细胞计数显示对于缺少EDTA的情况下兔RBCs中C3d片段的存在，大约95%的检测细胞阳性染色。图27显示随着递增浓度的TT30的加入，在O. 46uM的TT30浓度时，TT30结合大约70%的检测细胞(右上象限)。图28至30显示在T=O时TT30存在于70%的检测RBCs的表面上，24小时之后显著数量的RBCs针对TT30继续阳性染色。图31显示在体外溶血试验中用艾库珠单抗或TTT30温育的CD59-PNH RBCs的C3片段积累和存活的比较。描述了当在来自用艾库珠单抗(左；估计的浓度lOOyg/mL)治疗的患者的血清或加入TT30的血清(右；195 μ g/mL)中温育时⑶59-PNH RBCs存活和变成包被有C3片段(C3frag+)的百分比。图32显示体外溶血试验中TT30对⑶59-PNH RBC存活或溶血的作用。描述了在O. 195至195 μ g/mL的TT30浓度温育不同时间之后⑶59-PNH RBCs存活(左)或遭受溶血(右)的百分比。数据来自单个个体但是代表多个个体的结果。图33显示预测的TT30氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)。每个SCR在单独的行。限定来自CR2和H因子的SCRs并将SCRs之间的连接序列加下划线。共有序列糖基化位点是AsnlOl、Asnl07 和 Asn454。发明详述本申请涉及补体介导的溶血疾病如阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)的治疗。本申请基于这样的发现在阻止PNH红细胞(RBCs)的溶血方面，补体旁路(CAP)的调节，特别是用包括CR2和H因子的定向构建物(TT30 ;SEQ ID NO:3)，较用末端补体抑制剂，S卩，抗C5抗体(艾库珠单抗)的抑制更有效。不受理论的束缚，不管保护性浓度的抗体存在与否，假设关于抗C5抗体，来自PNH患者的RBCs的体外溶血可能与对C3片段包被的RBCs溶解易感性增加相关。
因此，本申请一方面提供在对象中，特别是在具有溶血性贫血，或显示以下症状中的一个或多个的对象中治疗补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，这些症状是残余贫血和/或补体介导的血管外溶血和/或血管内溶血的不完全控制的症状。这些特征在本文中被共同地称作“溶血标志”。在另一方面，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，其中所述对象先前已用末端补体抑制剂(如抗C5抗体)治疗。该方法通过给予有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物来进行。特别适合的补体激活途径抑制剂是靶向构建物(如本文描述的定向构建物)，其包括使构建物导向补体激活位点的靶向部分和具有补体抑制活性的活性部分。在另一方面，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象a)有效量的末端补体抑制剂(如抗C5抗体)和b)有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物。“末端补体抑制剂”指一个或多个补体途径的抑制剂，其抑制C3转化酶下游成分的活性。这些包括，例如，C3转化酶的抑制剂、C5(例如抗C5抗体)的阻断、或阻断MAC (膜攻击复合物)形成的抑制剂。因此，在一些实施方式中，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物，其中所述对象具有溶血性贫血或显示以下症状中的一个或多个残余贫血和/或补体介导的血管外溶血和/或血管内溶血的不完全控制的症状。在一些实施方式中，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物，其中所述对象显示进行的或间歇的血管内溶血和/或血管外溶血引起的连续红细胞丧失的征兆或症状。在一些实施方式中，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物，其中所述对象具有受C3片段调理的红细胞。在一些实施方式中，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物，其中所述对象需要定期输血。在一些实施方式中，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物，其中所述对象具有低的正常水平的血红蛋白或低于正常水平的血红蛋白。在一些实施方式中，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物，其中所述对象具有低的正常水平的血小板或低于正常水平的血小板。在一些实施方式中，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物，其中所述对象具有高的正常网状细胞或高于正常的网状细胞。在一些实施方式中，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物，其中所述对象具有高的正常胆红素或高于正常的胆红素。在一些实施方式中，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物，其中所述对象具有铁超负荷或面临铁超负荷的危险。在一些实施方式中，组合物抑制补体成分C3(C3)的激活和由C3片段引起的红细胞的调理作用。在一些实施方式中，组合物维持乳酸脱氢酶和血红蛋白的正常血清水平。在一些实施方式中，补体激活途径抑制剂是定向构建物(如本文描述的定向构建物)，其包括使构建物导向补体激活位点的靶向部分和具有补体抑制活性的活性部分。在一些实施方式中，定向构建物包括CR2或其片段和H因子或其片段。在一些实施方式中，定向构建物包括CR2的前四个SCR结构域和H因子的前五个SCR结构域(如TT30)。在一些实施方式中，定向构建物选自TT30、TT31和ΤΤ32。
在一些实施方式中，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物，其中所述对象先前已用末端补体抑制剂(如抗C5抗体)治疗。在一些实施方式中，对象对末端补体抑制剂(如抗C5抗体)的治疗没有应答。在一些实施方式中，对象对末端补体抑制剂(如抗C5抗体)的治疗有部分应答。在一些实施方式中，对象前对末端补体抑制剂(如抗C5抗体)开始时有应答，但是用抗C5抗体治疗一定时期(如一个月、两个月、三个月、四个月、六个月)之后变得没有应答。在一些实施方式中，用末端补体抑制剂(如抗C5抗体)治疗之后，个体显示上面描述的溶血标志中的一个或多个。在一些实施方式中，组合物抑制补体成分C3(C3)的激活和C3片段引起的红细胞的调理作用。在一些实施方式中，组合物维持乳酸脱氢酶和血红蛋白的正常血清水平。在一些实施方式中，补体激活途径抑制剂是定向构建物(如本文描述的定向构建物)，其包括使构建物导向补体激活位点的靶向部分和具有补体抑制活性的活性部分。在一些实施方式中，定向构建物包括CR2或其片段和H因子或其片段。在一些实施方式中，定向构建物包括CR2的前四个SCR结构域和H因子的前五个SCR结构域(如TT30)。在一些实施方式中，定向构建物选自TT30、TT31和ΤΤ32。在一些实施方式中，在用旁路补体途径的抑制剂治疗之前，对象用末端补体抑制剂治疗至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 周。在一些实施方式中，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象a)有效量的末端补体抑制剂(如抗C5抗体)和b)有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物。在一些实施方式中，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象a)有效量的抗C5抗体(如艾库珠单抗)和b)有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物。在一些实施方式中，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象a)有效量的阻止MAC形成的抑制剂(如CD59)和b)有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物。在一些实施方式中，组合物抑制补体成分C3(C3)的激活和C3片段引起的红细胞的调理作用。在一些实施方式中，组合物维持乳酸脱氢酶和血红蛋白的正常血清水平。在一些实施方式中，补体激活途径抑制剂是定向构建物(如本文描述的定向构建物)，其包括使构建物导向补体激活位点的靶向部分和具有补体抑制活性的活性部分。在一些实施方式中，定向构建物包括CR2或其片段和H因子或其片段。在一些实施方式中，定向构建物包括CR2的前四个SCR结构域和H因子的前五个SCR结构域(如TT30)。在一些实施方式中，定向构建物选自TT30、TT31和TT32。TT30包括H因子蛋白的补体旁路抑制部分，其通过与补体受体2蛋白(CR2或CD21)部分的结合而靶向补体激活和炎症的部位，已知该补体受体2蛋白(CR2或CD21)结合补体成分3(C3)的固定组织/细胞的片段。TT31与TT30相似，但是含有H因子蛋白的补体旁路抑制部分的另外的拷贝。TT32包括补体受体I (CRl)的补体抑制部分，其通过与CR2蛋白的同一部分结合而被靶向。已知CRl是较H因子更宽的补体抑制剂。TT32将因此不但抑制补体旁路，而且将局部地抑制补体经典途径和凝集素途径。其它合适的定向抑制剂在Gilkeson et al.，美国专利公开2008/0221011中有描述，其公开在此通过引用被特别地并入本文。本发明提供用于治疗具有许多补体介导的影响红细胞的疾病状态中任意的对象 的方法和组合物。在这些对象之中是具有阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS);慢性溶血性贫血；抗体介导的组自身免疫溶血性贫血；由血红蛋白病如镰状细胞病引起的贫血；由感染如疟疾引起的贫血；缘于输血反应的贫血；和冷凝集素疾病(CAD)的对象。在具体的实施方式中，本发明提供用于治疗具有溶血性贫血的对象的方法和组合物，该贫血可由以上疾病状态引起，或该对象显示至少一个特征，该特征可以是残余贫血和/或补体介导的血管外溶血和/或血管内溶血不完全控制的症状对象显示进行的或间歇的血管内溶血和/或血管外溶血引起的连续红细胞丧失的征兆或症状；对象具有受C3片段调理的红细胞；对象需要定期输血；对象具有低的正常水平的血红蛋白或低于正常水平的血红蛋白；对象具有低的正常水平的血小板或低于正常水平的血小板；对象具有高的正常网状细胞或高于正常的网状细胞；对象具有高的正常胆红素或高于正常的胆红素；或对象具有铁超负荷或面临铁超负荷的危险。以上讨论的指征(也被称作“溶血标志”)还可用于评价对治疗的应答性，预测对治疗的应答性，监测治疗进展，决定对象对治疗适合与否，决定对象对治疗不适合，选择用于治疗的对象，和/或选择用于连续治疗的对象。因此，例如，在一些实施方式中，提供用于评价应答性、鉴定对象和/或选择具有阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)或其它补体介导的影响红细胞的溶血疾病的对象用于治疗的方法，所述治疗包括给予有效量的抑制补体旁路活性的组合物。在一些实施方式中，提供评价是否具有阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)或其它补体介导的影响红细胞的溶血疾病的对象将可能对包括给予有效量的抑制补体旁路活性的组合物的治疗有应答的方法，该方法包括评价至少一个本文描述的溶血标志，其中这些特征中的一个或多个的存在表示对象将可能对治疗有应答。在一些实施方式中，该方法进一步包括给予可能对治疗有应答的对象有效量的抑制补体旁路活性的组合物。在一些实施方式中，提供鉴定适合治疗的对象的方法，该治疗包括给予有效量的抑制补体旁路活性的组合物，其中所述对象具有阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)或其它补体介导的影响红细胞的溶血疾病，该方法包括评价至少一个本文描述的溶血标志，其中这些特征中的一个或多个的存在鉴定适合治疗的对象。在一些实施方式中，该方法进一步包括给予可适合治疗的对象有效量的抑制补体旁路活性的组合物。“可适合”的对象一包括“适合”本文描述的治疗(或多个)的对象一是更可能从所述治疗的给予获益而不是不从所述治疗的给予获益的对象。相反，“可不适合”的对象——包括“不适合”本文描述的治疗(或多个)的对象——是更可能未能从所述治疗的给予获益而不是能从所述治疗的给予获益的对象。 此外，本文提供选择或不选择更可能适合或更不可能适合包括给予有效量抑制补体旁路活性组合物的治疗的对象的方法，该对象具有阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)或其它影响红细胞的补体介导的溶血疾病，该方法包括(A)评价至少一个本文描述的溶血标志；和(B)选择具有这些特征中的一个或多个的对象。在一些实施方式中，该方法进一步包括给予可适合治疗的对象有效量的抑制补体旁路活性的组合物。本文还提供针对这样的用途将本文描述的治疗推向市场的方法，其包括告诉目标听众本文描述的组合物的用途。本发明还提供监测具有阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)或其它补体介导的影响红细胞的溶血疾病的对象对包括给予有效量抑制补体旁路活性的组合物的治疗应答性的方法，该方法包括评价至少一个本文描述的溶血标志。在某些实施方式中，对象具有阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)。PNH是一种或多种具有突变体PIG的造血干细胞克隆扩充的结果。PIG-A突变体克隆扩充的程度在患者中变化很大。在一些实施方式中，对象中超过90%的外周血细胞缺少GPI-AP (GPI-AP缺陷的)。在某些实施方式中，对象中超过80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%或10%中任一个的外周血细胞缺少GPI-AP。在某些实施方式中，对象中小于10%的外周血细胞缺少GPI-AP。PNH的另一个特征是其基于PIG-基因型的表型镶嵌现象，其决定GPI-AP缺乏的程度。例如，PNHIII细胞完全缺少GPI-APs，PNHII细胞部分Γ90%)缺少，而PNH I细胞——残留的正常干细胞的后代——以正常密度表达GPI-AP。在某些实施方式中，对象只具有I型和III型细胞。在某些实施方式中，对象具有I型、II型和III型细胞。在某些实施方式中，对象具有I型和II型细胞。在某些实施方式中，对象具有典型的ΡΝΗ。典型的PNH被表征为大量的GPI-AP缺乏的PMNs，具有红细胞增生和正常或接近正常形态学和常见的或持续的鲜红宏观血红蛋白尿的细胞骨髓。在某些实施方式中，对象具有另一骨髓衰竭综合征背景中的PNH。另一骨髓衰竭背景中的PNH被表征为相对小百分比(〈30%)的GPI-AP缺乏的PMNs，相伴的骨髓衰竭综合征和间歇的或缺少的轻至中等宏观血红蛋白尿的证据。在某些实施方式中，对象具有亚临床的PNH。亚临床或潜在的PNH被表征为少量的(〈1%)GPI-AP缺乏的PMNs，相伴的骨髓衰竭综合征的证据和没有血管内溶血的临床或生物化学证据。在某些实施方式中，对象具有非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS)。在某些实施方式中，对象具有慢性溶血性贫血。在一些实施方式中，对象具有冷凝集素疾病(CAD)。在某些实施方式中，对象显示进行的或间歇的血管内溶血和/或血管外溶血引起的连续红细胞丧失的征兆或症状。在某些实施方式中，对象具有受C3片段调理的PNH红细胞。在某些实施方式中，对象需要定期输血。在一些实施方式中，对象具有以下疾病中的任何一个阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS);慢性溶血性贫血；抗体介导的自身免疫溶血性贫血；由血红蛋白病如镰状细胞病引起的贫血；由感染如疟疾引起的贫血；缘于输血反应的贫血；和冷凝集素疾病(CAD)。本文描述的方法还有益于治疗对象中补体介导的溶血、减少血管内溶血、减少血管外溶血和增加红细胞存活。在本发明的具体实施方式
中，对象显示铁超负荷。输注和贫血的其它治疗可促成或加重铁超负荷。此外，用末端补体抑制剂如艾库珠单抗或培克珠单抗或另一个末端补体抑制剂——抑制C5或包括C6至C9的膜攻击复合物(MAC)的其它成分——的PNH的治疗导致C3片段在PNH RBC表面上积累，以及以后的EVH和肝脏引起的铁积累。因此，具有PNH
或另一种补体介导的红细胞病症的对象显不铁超负荷的症状或正临近铁超负荷
进一步的溶血治疗可能不是最佳的。在这种情况下，根据本发明的方法和组合物的治疗可尤其有益于减少或控制贫血，不促成或加重铁超负荷。可选地，根据本发明的方法和组合物的治疗可尤其有益于治疗具有补体介导的溶血疾病，如PNH的对象，同时阻止可在用末端补体抑制剂的治疗中观察到的铁超负荷，或阻止铁超负荷和因此允许末端补体抑制剂的连续给予。为了本发明的目的，如果对象的血清铁水平超过约350ug/dL (轻的铁毒性)；优选超过约500ug/dL (严重的铁毒性)，则认为他们遭受铁超负荷。如果对象的血清铁水平是高的正常范围或超过正常范围，则认为他们面临铁超负荷的危险。正常的铁范围被认为是约40至约220ug/dL ;对于成年男性更优选大约50至约160ug/dL。成年女性的正常铁范围低于成年男性大约百分之5至百分之10。‘高的正常’铁浓度被认为是正常范围的四分之一(25%)以上；优选处于正常范围较高的十分之一(10%)。参见,Jacobs & DeMott, LaboratoryTest Handbook,第五版，(LexiComp Inc, Hudson, OH) (2001) atp. 203-205)。如本领域技术人员所已知的，铁和铁结合能力的‘正常范围’可取决于特定的实验室和测试而变化。在一些实施方式中，成年男性对象的血清铁水平高于约220ug/dL。在一些实施方式中，成年男性对象的血清铁水平高于约160ug/dL。在一些实施方式中，成年男性对象的血清铁水平位于约175ug/dL和约220ug/dL之间。在一些实施方式中，成年男性对象的血清铁水平位于约130ug/dL和约160ug/dL之间。在一些实施方式中，成年男性对象的血清铁水平位于约200ug/dL和约220ug/dL之间。在一些实施方式中，成年男性对象的血清铁水平位于约150ug/dL和约160ug/dL之间。在一些实施方式中，成年女性对象的血清铁水平高于约200ug/dL。在一些实施方式中，成年女性对象的血清铁水平高于约145ug/dL。在一些实施方式中，成年女性对象的血清铁水平位于约160ug/dL和约200ug/dL之间。在一些实施方式中，成年女性对象的血清铁水平位于约120ug/dL和约145ug/dL之间。在一些实施方式中，成年女性对象的血清铁水平位于约185ug/dL和约200ug/dL之间。在一些实施方式中，成年女性对象的血清铁水平位于约135ug/dL和约145ug/dL之间。此外，本发明的方法和组合物可用于涉及补体介导的血管外溶血的其它疾病和涉及以上特征中的一个或多个的补体相关疾病的治疗。这些疾病特征在于高血清乳酸脱氢酶(LDH)水平和/或低血清血红蛋白(HgB)水平。这样的疾病可包括，例如，非典型的溶血性尿毒性综合征(aHUS);慢性溶血性贫血；和冷凝集素疾病(CAD)。Jacobson et al. , AmericanJ. Medicine, 54:514—21(1973)。因为末端补体抑制剂如艾库珠单抗——结合C5的单克隆抗体——必须竞争地结合C5和阻止C5转化酶对C5的酶促切割，所以如果不是不可能的话，末端补体抑制剂可能难以治疗经历红细胞溶解的对象以有效地获得和稳定地保持这种溶血性溶解标记，如LDH和HgB的正常范围，具有降低的突破溶血性溶解发生的危险。这种抑制剂的作用依赖C5的抗体完全阻断C5转化酶对C5切割的能力。然而，因为抗体通常达到与它们的抗原结合的平衡水平，在这种情况下C5，血液中和红细胞表面将周期性地或间歇地存在一些水平的未结合的C5。未结合的C5可不可逆地被存在于红细胞表面上的C5转化酶切割。如果(a)血清抑制剂浓度降低；或(b)血液中血清C5浓度增加，存 在的未结合的C5的量将增加。另夕卜，因为末端补体抑制剂与C5转化酶——C5的天然配体，其将不可逆地切割C5——竞争，所以末端补体抑制剂保持溶血的控制和阻止突破的有效性受血清C5转化酶浓度的增加的影响。如先前所指出的，接受末端补体抑制剂的对象血清中C3片段和C3转化酶的积累将自然地趋向于增加C5转化酶的血清水平，限制抑制剂的效力。LDH和HgB :用本发明的定向抑制剂，以上导致‘突破’溶解的情形可被减少或避免，因为在红细胞表面上定向抑制剂与C3d片段栓在一起，而融合蛋白的补体抑制剂末端能在红细胞表面局部地起作用以抑制补体旁路激活。因此，可实现更稳定的补体抑制。因此，在本发明的某些实施方式中，预期遭受PNH、aHUS、CAD或其它溶血性贫血的对象可被有效地治疗以至于乳酸脱氢酶(LDH)和血红蛋白(HgB)的血清浓度水平可保持在正常浓度范围内。一般而言，血清中的LDH是红细胞溶解的指征，高水平则指示溶血。参见，Kato et al. ,Blood, 107:2279-85(2006)。HgB是血清中血红蛋白的测量，低水平则指不贫血。参见 Crosby and Ackroyd, Am. J. Medicine, 13:273-83 (1952) ；Dameshek, Am.J. Medicine, 18:315—25(1955)。高血清水平LDH伴随低血清水平HgB可指示溶血性贫血的存在。对于本发明的目的，LDH血清浓度的‘正常范围’被认为达到大约350IU/1 ;优选从约105至333IU/1，优选从大约140至280IU/L ;在其它实施方式中，达到约190U/L。‘高的正常’ LDH浓度将是正常范围的较高的一半(50%)，优选正常范围的较高的四分之一(25%)，最优选正常范围的较高的十分之一(10%)。对于本发明的目的，对于成年男性血清HgB浓度的‘正常范围’被认为是大约13. 5至18. Ogm/dL的范围内；优选从约13. 8至18. O ;对于男性更优选从约14. O至约17. O ;对于女性大约11. O至16. 2gm/dL ;对于成年女性更优选约12. O至16. Ogm/dL。‘低的正常’ HgB浓度将是正常范围的较低的一半(50%)，优选正常范围的较低的四分之一(25%)，最优选，正常范围的较低的十分之一(10%)。如本领域技术人员所已知的，LDH和HgB的‘正常范围’可取决于特定的实验室和测试而变化。[参见，万维网nlm. nih.gov; Jacobs&DeMott, Laboratory Test Handbook,第五版，(LexiComp Inc, Hudson, OH)(2001)at p.206-208;319-422]。在某些实施方式中，对象具有低的正常水平或低于正常水平的血红蛋白。在一些实施方式中，在成年男性对象中血红蛋白水平低于约13.5gm/dL。在一些实施方式中，在成年男性对象中血红蛋白水平低于约13. 8gm/dL。在一些实施方式中，在成年男性对象中血红蛋白水平低于约14gm/dL。在一些实施方式中，在成年男性对象中血红蛋白水平位于约13. 5gm/dL和约15. 75gm/dL之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血红蛋白水平位于约13. 5gm/dL和约14. 6gm/dL之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血红蛋白水平位于约13. 5gm/dL和约13. 9gm/dL之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血红蛋白水平位于约13. 8gm/dL和约15. 9gm/dL之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血红蛋白水平位于约13. 8gm/dL和约14. 9gm/dL之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血红蛋白水平位于约13. 8gm/dL和约14. 2gm/dL之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血红蛋白水平位于约14gm/dL和约15. 5gm/dL之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血红蛋白水平位于约14gm/dL和约14. 75gm/dL之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血红蛋白水平位于约14gm/dL和约14. 3gm/dL之间。在一些实施方式中，在成年女性对象中血红蛋白水平低于约11. Ogm/dL。在一些实施方式中，在成年女性对象中血红蛋白水平低于约12. Ogm/dL。在一些实施方式中，在成年女性对象中血红蛋白水平位于约11. Ogm/dL和约13. 6gm/dL之间。在一些实施方式中，在成年女性对象中血红蛋白水平位于约11. Ogm/dL和约12. 3gm/dL之间。在一些实施方式 中，在成年女性中血红蛋白水平位于约11. Ogm/dL和约11.5gm/dL之间。在一些实施方式中，在成年女性对象中血红蛋白水平位于约12. Ogm/dL和约14. Ogm/dL之间。在一些实施方式中，在成年女性对象中血红蛋白水平位于约12. Ogm/dL和约13. Ogm/dL之间。在一些实施方式中，在成年女性对象中血红蛋白水平位于约12. Ogm/dL和约12. 2gm/dL之间。在一些实施方式中，对象进一步具有高于约350IU/1的LDH水平。在一些实施方式中，对象进一步具有高于约280IU/1的LDH水平。在一些实施方式中，对象进一步具有约219IU/1和333IU/1之间的LDH水平。在一些实施方式中，对象进一步具有约276IU/1和333IU/1之间的LDH水平。在一些实施方式中，对象进一步具有约310IU/1和333IU/1之间的LDH水平。在一些实施方式中，对象进一步具有约210IU/1和280IU/1之间的LDH水平。在一些实施方式中，对象进一步具有约245IU/1和280IU/1之间的LDH水平。在一些实施方式中，对象进一步具有约266IU/1和280IU/1之间的LDH水平。血小板可指示溶血性贫血的另一个特征是低于正常范围的血清血小板水平。对于本发明的目的，对于成年男性血清血小板浓度的‘正常范围’被认为是在大约130至约410 (X109/L)的范围内；优选大约150至约400(X 109/L)的范围内；更优选从约210至约330 (XlOVL)0对于成年女性，血清血小板浓度的‘正常范围’可被认为是高于成年男性大约5至10%。‘低的正常’血小板浓度将是正常范围的较低的一半(50%)，优选正常范围的较低的四分之一(25%)，最优选，正常范围的较低的十分之一(10%)。[参见，万维网nlm.nih. gov 和 questdiagnostics. com;Jacobs&DeMott, Laboratory Test Handbook,第五版，(Lex i Comp Inc, Hudson, OH) (2001),第471-472页]。如本领域技术人员所已知的,血小板的‘正常范围’可取决于特定的实验室和测试而变化。在某些实施方式中，对象具有低的正常水平或低于正常水平的血小板。在一些实施方式中，在成年男性对象中血清血小板水平低于约130(X 109/L)。在一些实施方式中，在成年男性对象中血清血小板水平低于约150(X 109/L)。在一些实施方式中，在成年男性对象中血清血小板水平低于约210(X109/L)。在一些实施方式中，在成年男性对象中血清血小板水平位于约130(X 109/L)和约270(X 109/L)之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血清血小板水平位于约130(X 109/L)和约200(X 109/L)之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血清血小板水平位于约130(X 109/L)和约158(X 109/L)之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血清血小板水平位于约150(X 109/L)和约275(X 109/L)之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血清血小板水平位于约150(X 109/L)和约112.5(X109/L)之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血清血小板水平位于约150 (X 109/L)和约175(X 109/L)之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血清血小板水平位于约210(X109/L)和约260(X 109/L)之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血清血小板水平位于约210(X109/L)和约240(X 109/L)之间。在一些实施方式中，在成年男性对象中血清血小板水平位于约210 (X109/L)和约222(X 109/L)之间。在一些实施方式中，在成年女性对象中血清血小板水平低于约140(X 109/L)。在一些实施方式中，在成年女性对象中血清血小板水平低于约165(X 109/L)。在一些实施方式中，在成年女性对象中血清血小板水平低于约230 (X 109/L)。在一些实施方式中，在成年女性对象中血清血小板水平位于约140 (X 109/L)和约295(X 109/L)之间。在一些实施方式中，在成年女性对象中血清血小板水平位于约140(X 109/L)和约220(X 109/L)之间。在·一些实施方式中，在成年女性对象中血清血小板水平位于约140(X 109/L)和约170(X 109/L)之间。在一些实施方式中，在成年女性对象中血清血小板水平位于约165(X 109/L)和约300(X 109/L)之间。在一些实施方式中，在成年女性对象中血清血小板水平位于约165(X 109/L)和约235(X 109/L)之间。在一些实施方式中，血清血小板水平位于约165 (X 109/L)和约195(X 109/L)之间。在一些实施方式中，在成年女性对象中血清血小板水平位于约230(X 109/L)和约295(X 109/L)之间。在一些实施方式中，在成年女性对象中血清血小板水平位于约230(X 109/L)和约265(X 109/L)之间。在一些实施方式中，在成年女性对象中血清血小板水平位于约230 (X IO9ZD和约245(X 109/L)之间。网状细胞可指示溶血性贫血的另一个特征是高于正常范围的血清网状细胞水平。网状细胞是年轻的红细胞，细胞核已从中被挤出，但是其保留核糖体RNA的一些残留部分。当存在显著的红细胞丧失或红细胞被过早地破坏，例如，由于溶解的缘故时，网状细胞计数升高。对于本发明的目的，血清网状细胞浓度的‘正常范围’被认为在全部红细胞计数的约百分之O. 5至约百分之2. O的范围内；优选从约O. 5至约I. 5% ;最优选从约I. 0%至约1.5%。当血红蛋白水平低的时侯，作为红细胞百分数的网状细胞计数可较高。‘高的正常’HgB浓度将是正常范围的较高的一半(50%)，优选正常范围的较高的四分之一(25%)，最优选正常范围的较高的十分之一(10%)。[参见,万维网nlm. nih. gov和questdiagnostics.com; Jacobs&DeMott, Laboratory Test Handbook,第五版，(LexiComp Inc, Hudson, OH)(2001)，第481-482页]。如本领域技术人员所已知的，网状细胞的‘正常范围’可根据特定的实验室和测试而变化。在一些实施方式中，对象具有增加的网状细胞。在一些实施方式中，对象具有高于全部红细胞计数的约I. 5%的血清网状细胞浓度。在一些实施方式中，对象具有高于全部红细胞计数的约2. 00%的血清网状细胞浓度。在一些实施方式中，对象具有全部红细胞计数的约I. 0%至I. 5%之间的血清网状细胞浓度。在一些实施方式中，对象具有全部红细胞计数的约I. 25%至I. 5%之间的血清网状细胞浓度。在一些实施方式中，对象具有全部红细胞计数的约I. 375%至I. 5%之间的血清网状细胞浓度。在一些实施方式中，对象具有全部红细胞计数的约I. 4%至I. 5%之间的血清网状细胞浓度。在一些实施方式中，对象具有全部红细胞计数的约I. 45%至I. 5%之间的血清网状细胞浓度。在一些实施方式中，对象具有全部红细胞计数的约I. 25%至2. 0%之间的血清网状细胞浓度。在一些实施方式中，对象具有全部红细胞计数的约I. 625%至2.0%之间的血清网状细胞浓度。在一些实施方式中，对象具有全部红细胞计数的约I. 85%至2. 0%之间的血清网状细胞浓度。胆红素可指示溶血性贫血的另一个特征是高于正常范围的血清胆红素水平。对于本发明的目的，血清胆红 素浓度的‘正常范围’被认为是在大约0.3至I. 9mg/dL的范围内；优选大约O. 3至1.0mg/dL的范围内。‘高的正常’胆红素浓度将是正常范围的较高的一半(50%)，优选正常范围的较高的四分之一(25%)，最优选，正常范围的较高的十分之一 (10%) ο [参见，万维网 nlm. nih. gov 和 questdiagnostics. com; Jacobs& DeMott, Laboratory Test Handbook,第五版，(LexiComp Inc, Hudson, OH) (2001),第471-472页]。如本领域技术人员所已知的，胆红素的‘正常范围’可根据特定的实验室和测试而变化。在某些实施方式中，对象具有增加的胆红素。在一些实施方式中，对象具有高于约I. 9mg/dL的血清胆红素水平。在一些实施方式中，对象具有高于约I. 0mg/dL的血清胆红素水平。在一些实施方式中，对象具有约I. lmg/dL和I. 9mg. dL之间的血清胆红素水平。在一些实施方式中，对象具有约I. 5mg/dL和I. 9mg. dL之间的血清胆红素水平。在一些实施方式中，对象具有约I. 75mg/dL和I. 9mg. dL之间的血清胆红素水平。在一些实施方式中，对象具有约0. 65mg/dL和I. Omg. dL之间的血清胆红素水平。在一些实施方式中，对象具有约0. 825mg/dL和I. Omg. dL之间的血清胆红素水平。在一些实施方式中，对象具有约0. 93mg/dL和I. Omg. dL之间的血清胆红素水平。在某些实施方式中，具有补体介导的影响红细胞的溶血疾病，如PNH的对象先前已用末端补体抑制剂治疗，但是持续显示以上残余贫血和/或补体介导的血管外溶血特征中的至少一个。在这种情况下，本发明提供用于避免或减少以上特征中至少一个的发生和/或严重性的方法和组合物。在某些实施方式中，具有补体介导的影响红细胞的溶血疾病，如PNH的对象显示对用末端补体抑制剂治疗的欠佳的应答。这种欠佳的应答可包括显示以上残余贫血和/或补体介导的血管外溶血特征中至少一个的对象。该方法包括给予有效量的抑制补体旁路活性的组合物，其中所述组合物抑制补体成分C3 (C3)的激活，例如通过起始C3转化酶而抑制旁路途径激活和/或通过抑制放大性C3转化酶的形成和/或活性和C3片段引起的红细胞的调理作用。在一些实施方式中，具有补体介导的影响红细胞的溶血疾病，如PNH的对象先前已用末端补体抑制剂治疗，开始时对这种治疗有应答，然后经历复发。在一些实施方式中，提供治疗对象中补体介导的溶血疾病(如影响红细胞的溶血疾病，例如PNH)的方法，包括给予对象有效量的抑制(如选择性地抑制)补体旁路激活的组合物，其中所述对象先前已用末端补体抑制剂(如抗C5抗体)治疗。在一些实施方式中，对象对末端补体抑制剂(如抗C5抗体)的治疗没有应答。在一些实施方式中，对象对末端补体抑制剂(如抗C5抗体)的治疗部分有应答。在一些实施方式中，对象开始时对末端补体抑制剂(如抗C5抗体)的治疗有应答，但是用抗C5抗体治疗一定时期(如一个月、两个月、三个月、四个月、六个月)之后变得没有应答。在一些实施方式中，用末端补体抑制剂(如抗C5抗体)治疗之后，个体显示上面描述的溶血标志中的一个或多个。在一些实施方式中，补体激活途径抑制剂是定向构建物(如本文描述的定向构建物)，其包括使构建物导向补体激活位点的靶向部分和具有补体抑制活性的活性部分。在一些实施方式中，定向构建物包括CR2或其片段和H因子或其片段。在一些实施方式中，定向构建物包括CR2的前四个SCR结构域和H因子的前五个SCR结构域(如TT30)。在一些实施方式中，在用旁路补体途径的抑制剂治疗之前，对象用末端补体抑制剂治疗至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周而终止。在一些实施方式中，对象对先前的治疗有进展(例如在开始先前治疗约3、6、9或12个月任一之后有进展)。在另一方面，本发明提供治疗具有阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)或涉及补体介导的血管外溶血成分的另一种疾病的对象的方法，该方法包括给予包括含有如下组合的组合物(i)有效量的补体旁路抑制剂和(ii)有效量的末端补体抑制剂。还可给予另外的补体 抑制剂(如补体芳路抑制剂)。包括补体旁路抑制剂的组合物和末端补体抑制剂可同时给予。如本文所用，术语“同时给予”指联合治疗中给予包括补体旁路抑制剂的组合物和末端补体抑制剂时具有不超过约15分钟，如不超过约10、5或I分钟中任一个的时间间隔。当同时给予药物时，包括补体旁路抑制剂的组合物和末端补体抑制剂可包含在同一个组合物中(例如，包括补体旁路抑制剂和末端补体抑制剂的组合物)或在单独的组合物中(例如，包括补体旁路抑制剂的组合物包含在一个组合物中，而末端补体抑制剂包含在另一个组合物中)。可选地,相继给予补体旁路抑制剂和末端补体抑制剂，即，在给予末端补体抑制剂之前或之后给予包括补体旁路抑制剂的组合物。如本文所用，术语“相继给予”指给予包括补体旁路抑制剂的组合物和末端补体抑制剂时具有超过约15分钟，如超过约20、30、40、50、60或更多分钟中任一个的时间间隔。可首先给予包括补体旁路抑制剂的组合物或末端补体抑制剂。包括补体旁路抑制剂的组合物和末端补体抑制剂包含在独立的组合物中，其可包含在相同或不同的包装或试剂盒中。在一些实施方式中，在给予末端补体抑制剂之前给予包括补体旁路抑制剂的组合物。在一些实施方式中，在给予末端补体抑制剂之后给予包括补体旁路抑制剂的组合物。在一些实施方式中，包括补体旁路抑制剂的组合物和补体抑制剂的给予同时发生，即，包括补体旁路抑制剂的组合物的给予时期与末端补体抑制剂的给予时期相互重叠。在一些实施方式中，在给予末端补体抑制剂之前给予包括补体旁路抑制剂的组合物至少一个周期(例如，2、3或4个周期中至少任何一个)。在一些实施方式中，给予末端补体抑制剂一、二、三或四周中至少任何一个。在一些实施方式中，包括补体旁路抑制剂的组合物和末端补体抑制剂的给予不是同时发生的。例如，在一些实施方式中，在给予末端补体抑制剂之前结束包括补体旁路抑制剂的组合物的给予。在一些实施方式中，在给予包括补体旁路抑制剂的组合物之前结束末端补体抑制剂的给予。在一些实施方式中，这两个不同时发生的给予之间的时期可以是约一天至约八周。在一些实施方式中，这两个不同时发生的给予之间的时期是约一天。在一些实施方式中，这两个不同时发生的给予之间的时期是约一天以上，如约二、三、四、五、六天。在一些实施方式中，这两个不同时发生的给予之间的时期是至少约一周。在一些实施方式中，这两个不同时发生的给予之间的时期是至少约两周。在一些实施方式中，这两个不同时发生的给予之间的时期是至少约四周。在一些实施方式中，这两个不同时发生的给予之间的时期是至少约八周。基于给药医师的判断，在治疗过程中可调整包括补体旁路抑制剂的组合物和末端补体抑制剂的给药频率。当分开给予时，包括补体旁路抑制剂的组合物和末端补体抑制剂可以不同的给药频率或间隔给予。例如，包括补体旁路抑制剂的组合物可每周给予一次，而末端补体抑制剂可更频繁或更不频繁地给予。在一些实施方式中，可利用包括补体旁路抑制剂的组合物和/或末端补体抑制剂的持续的连续的释放制剂。获得持续释放的各种制剂和装置在本领域是已知的。可利用相同的给药途径或不同的给药途径给予包括补体旁路抑制剂的组合物和末端补体抑制剂。在一些实施方式(对于同时给予和相继给予)中，以预设的比率给予包括补体芳路抑制剂的组合物和末端补体抑制剂。
靶向补体激活的组织本文描述的组合物优选被靶向以增加与组织的结合，该组织已受伤、损坏或变得由物理、化学或其它损伤或伤害引起的发炎。靶向可通过将活性剂栓系、融合或另外方式结合到靶向部分来实现。在一些实施方式中，靶向部分结合与补体激活相关的结合伴侣。“与补体结合相关的结合伴侣”指存在于补体激活位点的分子或表位。在一些实施方式中，分子或表位只是当补体途径激活时而存在。在一些实施方式中，只有当补体途径激活时，分子或表位可用于结合靶向部分。在一些实施方式中，靶向部分结合组织相关的补体成分3(C3)或C3的一个或多个片段，包括，但不限于C3b、iC3b、C3d和C3dg。在优选实施方式中，靶向部分将结合补体成分3 (C3)或C3的一个或多个片段，包括，但不限于C3b、iC3b、C3d和C3dg。优选的靶向部分包括，例如，补体受体2 (CR2)或其保持结合C3的一个或多个片段能力的片段<3、0313、^313、03(1、03(^或03其它片段的单克隆抗体。还可能利用H因子的一些非调节片段，其保持结合C3的一个或多个片段——包括C3b、iC3b和C3d或C3的其它片段——的能力。这些片段潜在地包括含有SCR结构域5-8和SCR结构域19-20的片段。应当指出，术语“CR2-靶向的”可用于本发明以指将以与CR2的天然结合类似的方式特异地结合〇3的一个或多个片段，如03、0315、^313、03(1和03(^的分子。因此，例如，包括(a)来自CR2的靶向部分或(b)C3d抗体的融合蛋白——融合到补体H因子——可被称作“CR2-靶向的H因子”。在一些实施方式中，构建物是包括靶向部分和活性部分的融合蛋白。在一些实施方式中，靶向部分和活性部分通过肽连接体连接。在一些实施方式中，靶向部分和活性部分通过非肽连接体连接。在一些实施方式中，靶向部分融合到活性部分的N端。在一些实施方式中，靶向部分融合到活性部分的C端。在一些实施方式中，靶向部分插入到活性部分中间。示例性的融合蛋白包括，但不限于，多肽，其中靶向部分的C端部分融合到活性部分的N端部分，靶向部分的N端部分融合到活性部分的C端部分，两个或多个靶向部分融合到活性部分的N端和C端部分，靶向部分插入到活性部分中间，等等。在一些实施方式中，分子包括两个或多个(如二、三、四、五或多个中任一个)CR2部分(或任何其它靶向部分部分，或其组合)。这些CR2部分(或其它靶向部分的部分)可以是相同或不同的，例如在氨基酸序列、结构和/或功能方面。
在一些实施方式中，分子包括两个或多个(如二、三、四、五或多个中任一个)活性部分的部分。这些活性部分的部分可以是相同或不同的，例如在氨基酸序列、结构和/或功能方面。在一些实施方式中，分子(如融合蛋白)包括1)两个或多个CR2部分，该CR2部分包括CR2或其片段，和2)两个或多个活性部分。在一些实施方式中,祀向部分显示对其结合伴侣高的亲合力(avidity)。在一些实施方式中，祀向部分显示对其结合伴侣高的亲合力但是低的亲和性(affinity)。结合亲合力是起始过程的强度的量度，通过该起始过程，靶向部分，如抗体或配体，将寻找、定位和与其结合伴侣结合，并且结合亲合力是涉及结合亲和性的起始过程。另一方面，结合亲和性是较宽的量度，其不但考虑亲合力，而且还考虑结合的其它特征如相互作用的强度和解离系数。已经开发了测量和修改结合属性，如亲合力和亲和性的方法。例如， 参见 Lee et al. , Molecular Immunology, 47:816-24 (2010) ；Kaymakcalan etal·，Clinical Immunology, 131:308-16 (2009) ；Konstandin et al. , J Immunol.Methods, 310:67-77(2006);和 Odet al. , Molecular Immunology, 37:1111-22 (2000)。因此，本发明可包括评价靶向部分的结合亲合力和亲和性的方法；突变或修饰靶向部分和评价该突变或修饰的效果的方法，以获得具有改进的靶向特征，例如，结合亲合力的靶向部分。虽然本文的某些部分讨论CR2-定向构建物，但是应当理解同样适用于本文描述的其它靶向部分。本文更详细地描述不同的靶向部分。CR2 和 CR2 片段。补体受体2(CR2)，或其功能片段使补体调节剂靶向到显示或表达C3或C3片段——CR2能与之结合，包括C3b、iC3b、C3d和C3dg——的组织的用途在US2008/0267980, Tomlinson and Holers中有描述，其在此通过引用被并入本文。这样的CR2分子，和其功能片段可在本发明中用作靶向部分。在特别优选的实施方式中，包括C3dg的活性结合位点的前两个N端短共有重复序列结构域(SCRs)可在本发明中用作靶向部分。本发明人已发现虽然红细胞被给予特权避免补体攻击，但是可由本发明治疗的补体介导的血液病症可导致C3和/或C3片段对RBC表面的异常包被，使受影响的RBCs易受补体攻击和调理作用的影响。人补体受体2，也被称作 CD21(CR2/CD21) (SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2)，是 C3 结合蛋白家族的 145kD跨膜蛋白，包括15或16个短共有重复序列(SCR)结构域，具有这种蛋白特性的结构单元。CR2表达在成熟B细胞和滤泡树突细胞上，并在体液免疫中发挥重要作用。J. Hannan et al. , Biochem. Soc. Trans. (2002) 30:983-989; K. A. Young et al. , J.Biol.Chem. (2007) 282 (50) : 36614-36625。CR2蛋白不结合完整的C3蛋白，但是通过位于CR2蛋白的前两个氨基末端短共有重复序列(“SCRs 1-2”)内的结合位点，结合它的分解产物，包括C3b、iC3b和C3d切割片段。结果，CR2的SCR1-2结构域在C3的切割的(即，激活的)形式和完整的循环C3之间辨别。作为靶向基团，CR2的SCRs 1-2因此能在循环C3和补体激活期间产生的C3片段之间辨别。虽然CR2对C3d的亲和性只有620_658nM(JHannan et al. , Biochem. Soc. Trans. (2002) 30:983-989 ；J. M. Guthridge et al. , Biochem.(2001) 40:5931-5941)，但是CR2对聚集的C3d的亲合力使它成为使分子靶向补体激活位点的有效方法。CR2含有细胞外部分，其具有15或16个被称作短共有重复序列(SCR结构域)的重复单位。SCR结构域通常具有高度保守的残基的框架，包括四个半胱氨酸、两个脯氨酸、一个色氨酸和几个其它部分保守的甘氨酸和疏水残基。SEQ ID顯:1代表具有1530 结构域的全长人CR2蛋白序列。SEQ ID NO: I的氨基酸1_20包括前导肽，SEQ ID NO: I的氨基酸23-82 包括 SCRl，SEQ ID NO: I 的氨基酸 91-146 包括 SCR2，SEQ ID NO: I 的氨基酸 154-210包括SCR3，SEQ ID NO: I的氨基酸215-271包括SCR4。活性部位(C3d结合部位)位于SCRl-2(前两个N端SCR结构域)(SEQ IDNO: 2)中。这些SCR结构域由充当间隔区的可变长度的短序列分开。应当理解，对于公开的肽、多肽和蛋白质，存在物种和品系变化，本文描述的CR2或其片段包括所有的物种和品系变化。在某些实施方式中，CR2部分包括含有CR2蛋白的一些或所有配体结合部位的多 肽，包括，但不限于，如下面详细描述的全长CR2蛋白(如SEQ ID N0:1所示的人CR2)、可溶的CR2蛋白(如包括CR2细胞外结构域的CR2片段)、CR2的其它生物学活性片段、包括SCR1-2 (SEQ ID NO: 2)的CR2片段、或天然存在的CR2或其片段的任何同系物。在一些实施方式中，CR2部分具有以下CR2性质中的至少一个(I)结合C3d的能力，(2)结合iC3b的能力，(3)结合C3dg的能力，(4)结合C3d的能力，和(5)结合一个或多个C3b的细胞结合片段的能力，该C3b的细胞结合片段结合CR2的两个N端SCR结构域。在某些实施方式中，CR2部分包括CR2的前两个N端SCR结构域(SEQ IDNO: 2) 0在某些实施方式中，CR2部分包括CR2的前三个N端SCR结构域。在某些实施方式中，CR2部分包括CR2的前四个N端SCR结构域。在某些实施方式中，CR2部分包括CR2的至少前两个N端SCR结构域(在一些实施方式，由或基本上由CR2的至少前两个N端SCR结构域组成)，包括例如CR2的前3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个SCR结构域中的至少任何一个。C3的切割首先导致C3b在激活的细胞表面上产生和沉积。C3b片段涉及放大补体级联的酶促复合物的产生。在细胞表面上，C3b被快速地转变成无活性的iC3b，特别是当沉积在含有补体激活调节剂的宿主表面上(即，大部分宿主组织)时。即使在缺少膜结合的补体调节剂的情况下，由于血清H因子和血清I因子的作用，形成大量水平的iC3b。iC3b随后被I因子和其它蛋白酶和辅因子消化成膜结合的片段C3dg，然后消化成C3d，但是该过程相对缓慢。因此，一但CR2的C3配体产生，它们相对长时间地存活并以高浓度存在于补体激活的部位。C3和C3片段的抗体。C3和C3片段的抗体。代替来自CR2的靶向部分，靶向部分可包括结合C3或C3片段如C3b、iC3b、C3d和C3dg的抗体或其抗原结合片段。结合C3的抗体和结合C3b和C3d的切割片段的抗体是已知的。例如，参见美国专利6，572，856，Taylor ；Tosic et al.,J. Immunological Methods, 120:241-249 (1989) ；Sokoloff etal. , Cancer Immunology and Immunotherapy, 49:551-562 (2000) ；MastelIos etal. , Molecular Immunology, 40:1213-1221 (2004) ；DiIiIIo et al. , MolecularImmunology, 43:1010-1019(2006) ；Campagne, US 2009/0081211 ；Etemad-Gilbertson etal. ,US 2009/0175875 ；Aguado et al.，J. Clin. Invest.，76:1418-1426 (1985)。这些文献的公开内容在此通过引用被并入本文。这样的抗体和其功能片段可在本发明中用作靶向部分，该靶向部分将治疗片段引导到经历激活的补体活性并因此表达C3或其片段的组织。抗体的功能片段可包括，例如，单链可变区片段(scFvs)，其优选包括Vh和\结构域，任选地由柔性肽连接体连接。这样的scFvs通常保留亲本抗体的特异性和以单价方式结合靶抗原。抗体转变成scFvs是众所周知的方法(参见Nat. Biotechnol. 23:1126 (2005) ；BiomolEng. 24:201 (2007);JImmunol Methods.，168:149(1994) ；Arch Virol.148:497(2003)。ScFvs可由新基因合成、重叠延伸聚合酶链反应(PCR)或单个重链可变区(Vh)和轻链可变区(')基因区段的相继连接而构建。还可进行单个V1^P'基因相继克隆进含有合成连接体序列(例如，(Gly4Ser) 3)的载体。序列可以是Vh-连接体-Vlj或连接体-Vh。在特别优选的实施方式中，靶向部分可包括结合C3d的抗体，如由以下产生的那些抗体(I)杂交瘤细胞系3d-9a/25，其于2010年5月26日保藏并被命名为ATCC专利保藏PTA-10998 ; (2)杂交瘤细胞系3d_8b/2，其于2010年5月26日保藏并被命名为ATCC专
利保藏PTA-10999 ； (3)杂交瘤细胞系3d_29/5/2，其于2010年5月26日保藏并被命名为ATCC专利保藏PTA-11000 ; (4)杂交瘤细胞系3d_10/14/l，其于2010年6月3日保藏并被命名为ATCC专利保藏PTA-11010 ; (5)杂交瘤细胞系3d_l 1/14，其于2010年6月3日保藏并被命名为ATCC专利保藏PTA-11011 ； (6)杂交瘤细胞系3d_15A9，其于2010年6月2日保藏并被命名为ATCC专利保藏PTA-11012 ; (7)杂交瘤细胞系3d_3/28/4，其于2010年6月9日保藏并被命名为ATCC专利保藏PTA-11025 ; (8)杂交瘤细胞系3d_16/3/3，其于2010年6月9日保藏并被命名为ATCC专利保藏PTA-11026 ;和(9)杂交瘤细胞系3d_31/A6/9，其于2010年6月9日保藏并被命名为ATCC专利保藏PTA-11027。那些抗体在2010年6月22日提交的名称为“补体成分3的C3d片段的抗体”的美国临时专利申请序列号61/357，499中被更详细地描述，该申请在此以其全部通过引用被并入本文。那些杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的完整的核苷酸和氨基酸序列可容易地用标准方法如，例如，聚合酶链反应(PCR)和自动化测序来确定。抗C3d单克隆抗体向单链可变区片段的转变(scFvs) ο抗体转变成scFvs是众所周知的方法(参见Nat.Biotechnol. 23:1126 (2005) ； B i omoI Eng. 24:201 (2007) ； J Immuno IMethods.，168:149(1994) ；Arch Virol. 148:497 (2003)。ScFvs 可由新基因合成、重叠延伸聚合酶链反应(PCR)或单个重链可变区(Vh)和轻链可变区基因区段的相继连接而构建。还可进行单个Vh和'基因相继克隆进含有合成连接体序列(例如，(Gly4Ser)3)的载体。序列可以是Vh-连接体-V1j或V1j-连接体_Vh。可将工程化抗C3d-scFvs连接到补体抑制剂如CFI。本发明的单链Fvs优选包括通过阻止分解的柔性肽连接体连接的Vh和\结构域。如上面所描述的，抗C3d单克隆抗体可以相等的方式转变成单链可变区片段。scFvs通常保留亲本抗体的特异性和以单价方式结合靶抗原。一系列连接体可用于鉴定抗C3d-scFV和CFI相关的靶向部分之间的最佳距离，从没有连接体到40个氨基酸的连接体,选择的连接体序列可以是例如(GlyGlyGlyGlySer)η,其中η=0-8。连接到CFI相关部分的抗C3d-scFv的构建可通过新基因合成、重叠PCR、连续的克隆或连接而进行。最终构建物的N端部分可以是CFI相关的部分或抗C3d-scFV。
H因子和ra片段H因子具有至少三个不同的C3b结合结构域，该结合结构域位于SCRs 1-4 ；SCRs5-8和SCRs 19-20内。H因子的每个位点结合C3b蛋白内的不同区域N末端位点结合天然的C3b ;位于H因子中间区域的第二位点结合C3c片段；位于SCR19-20内的位点结合C3d区域。H因子还含有肝素的结合位点，该位点位于H因子的SCR 7、SCRs 5_12和SCRs19-20内并与C3b结合位点的那些位点重叠。在一些实施方式中，靶向部分包括H因子的非补体调节片段，其保留结合C3片段——包括C3b、iC3b和C3d或C3的其它组织相关片段——中的一个或多个的能力。在一 些实施方式中，靶向部分包括H因子的SCR结构域5-8和SCR结构域19-20。如本文所用，术语“补体H因子”、“H因子”或“ΠΓ指补体H因子、单个多肽链血浆糖蛋白，包括其同系物。该蛋白由20个保守的大约60个氨基酸的短共有重复序列(SCR)结构域组成，其以象串珠一样的连续方式排列，每个由2-6个氨基酸的短连接体序列分开。H因子结合C3b，加速旁路途径C3转化酶(C3bBb)的衰变，并充当C3b的蛋白水解失活的辅因子。在存在H因子的情况下，I因子进行的蛋白水解导致C3b的切割和失活。H因子具有至少三个不同的C3b结合结构域，该结合结构域位于SCRs 1-4 ；SCRs 5-8和SCRs 19-20内。H因子的每个位点结合C3b蛋白内的不同区域N末端位点结合天然的C3b;位于H因子中间区域的第二位点结合C3c片段和位于SCR19和20内的位点结合C3d区域。此外，H因子还含有肝素的结合位点，该位点位于H因子的SCR 7,SCRs 5-12和SCRs 19-20内并与C3b结合位点的那些位点重叠。结构和功能分析已显示，H因子的补体抑制活性的结构域位于前四个N端SCR结构域内。炎症新表位(Neoepitopes)的抗体。在其它优选的实施方式中，靶向部分可包括抗体，该抗体结合炎症新表位(inflammatory neoepitope),如I丐磷脂结合蛋白IV、隹丐磷脂结合蛋白A2、磷脂，如心磷脂，和瓜氨酸修饰的蛋白。适合的抗体可包括，例如，结合钙磷脂结合蛋白IV的抗体B4 ;结合心磷脂的抗体C2 ;和结合瓜氨酸修饰的蛋白的抗体D5(参见Holers etal. ,WO 2007/112403 ； Thurman and Holers, WO 2010/034015);还参见，Allison,美国专利 6，962，903 ;7，407，475 (钙磷脂结合蛋白 V) ;7，635，676 ;7，635，678 ;7，635，679 ；7,635,680 ;和 7，645，739 ;近端小管靶向部分，参见 Quigg et al. , US 2005/0265995。如上所述，抗体的功能片段如ScFvs可用作靶向部分。那些杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的完整核苷酸和氨基酸序列可容易地用标准方法如，例如，聚合酶链反应(PCR)和自动化测序来确定。其它靶向部分。本发明还考虑可利用其它靶向部分。靶向部分应理想地在补体激活区域中结合一个或多个结合细胞的C3片段。这还包括在补体激活区域中结合表达在细胞上的一个或多个新表位的祀向部分。补体旁路的抑制在一些实施方式中，本文描述的组合物包括显著或选择性地抑制补体旁路的活性剂部分。“显著地抑制补体旁路”指活性剂具有能力或百分比抑制——测量到在缺少所述活性剂部分的情况下旁路补体活性的至少10%，优选20%、30%或40%、更优选至少约50%、60%、80%或90%——抑制补体旁路。“选择性地抑制补体旁路”指活性剂具有能力或百分比抑制一测量到比经典或凝集素补体途径大至少二、三、四、五或十倍一地抑制补体旁路。更优选，活性剂将以比经典或凝集素补体途径大至少一、二或三个数量级的能力或百分比抑制来选择性地抑制补体芳路。在优选实施方式中，活性剂部分包括补体旁路抑制剂，或其生物学活性片段，其选自H因子蛋白、Crry、衰变加速因子(DAF)、MCP、CR1或其生物学活性片段。在一些实施方式中，活性部分是旁路补体途径的放大环路的抑制剂并将阻止放大C3转化酶以及下游C5转化酶的形成和活性。在一些实施方式中，一旦起始C3转化酶在红细胞表面上形成，活性部分将能灭活起始C3转化酶，并可部分地阻止流体相中起始C3转化酶的形成。在特别优选的实施方式中，活性剂部分包括H因子蛋白或其生物学活性片段，其保留抑制补体旁路的能力。适合的H因子蛋白和其生物学活性片段包括前四个N端短共有序列(H因子的SCRs，并在US 2008/0221011, Gilkeson et al中有描述，其公开在此特别通过引用被并入本文)。在，例如，Tomlinsonand Holers, US 2008/0267980 中描述了在本发明中可用作活性剂部分的其它补体抑制剂和其片段。适合的补体抑制剂，例如，可包括补体受体I (CRl) ;MCP ;Crry ;或DAF。Tomlinson and Holers的公开在此特别通过引用被并入本文。可用作活性剂部分的其它补体抑制剂包括compstatin,参见Janssen et al.，J. Biol.Chem. 282:29241-7(2007)。在优选实施方式中，补体抑制剂是旁路补体途径的放大环路的 抑制剂。在某些实施方式中，活性部分包括两个或多个补体抑制剂，例如，TT31中H因子的两个或多个生物学活性片段；或H因子的活性片段联合补体受体I的活性片段，MCP ；Crry ；补体I因子；CD59或DAF。在这样的实施方式中，可以以多种形式提供活性部分，例如，当活性部分包括H因子和⑶59的组合时，该组合物可包括下面的两个或多个CR2-FH-⑶59 ；CR2-CD59-FH ;抗 C3d-FH_CD59 和抗 C3d-CD59_ra。如本文所用，术语补体抑制剂的“生物学活性”片段指补体抑制剂的片段，其保留全长补体抑制蛋白的一些或所有的抑制活性。例如，H因子的“生物学上有活性的”片段包括，但不限于，如下面详细描述的，包括SCRs 1-4、SCRs 1-5、SCRs 1-8、SCRsl-18、SCRs19-20的H因子片段，或天然存在的H因子的任何同系物或其片段。在某些实施方式中，H因子的生物学活性片段具有以下性质中的一个或多个(I)结合C-re活性蛋白(CRP)、(2)结合C3b、(3)结合肝素、(4)结合唾液酸、(5)结合内皮细胞表面、(6)结合细胞整合素受体、(7)结合病原体、(8)C3b辅因子活性、(9)C3b衰变加速活性和(10)抑制旁路补体途径。应当考虑以上描述的补体抑制剂的变体和修饰在本发明的某些实施方式中可用作活性剂部分。例如，通过缺失分析，可能鉴定上述一些补体抑制剂的较小片段，其包括补体抑制需要的最小序列元件。在其它实施方式中，补体抑制剂，或补体抑制需要的其最小序列元件，可被修饰以增加作为抑制剂的活性剂部分的半衰期、稳定性或潜能。例如，活性剂部分可包括补体抑制剂，或其活性片段，其栓系到蛋白或非蛋白支架——预期保持以能进行补体抑制的构象的活性剂部分，同时减少对蛋白酶的易感性或另外延长活性剂部分的半衰期、稳定性或潜能。以下描述涉及方法和组合物，其中定向治疗剂是包括来自CR2的靶向部分和来自FH的活性剂的融合蛋白(CR2-H1融合蛋白)。该描述是非限制的，而且就本发明的其它实施方式一包括本文提到的可选的靶向部分和可选的活性部分一而论，本领域技术人员将能实施本发明。还考虑间接抑制补体旁路的抑制剂。例如，在一些实施方式中，抑制剂抑制两个或多个补体途径。在一些实施方式中，抑制剂抑制凝集素补体途径(例如，在一些实施方式中，抑制剂是抗MASP抗体)。在一些实施方式中，抑制剂抑制经典途径(例如，在一些实施方式中，抑制剂是CRl)。还考虑其它补体抑制剂。在一些实施方式中，本文描述的定向构建物包括两个或多个补体抑制剂或其片段。每个构建物中这些两个或多个补体抑制剂或其片段可以相同或不同。每个构建物中的两个或多个补体抑制剂或其片段可抑制相同或不同的补体途径。组合物本文描述的组合物可以任何途径给予个体，该途径包括，但不限于，静脉内(例·如，通过输注泵)、腹膜内、眼内、动脉内、肺内、口腔、吸入、膀胱内、肌肉内、气管内、皮下、眼内、鞘内、经皮、经胸膜、动脉内、局部、吸入(例如，作为喷雾剂的雾)、粘膜(如通过鼻粘膜)、皮下、经皮、胃肠道、关节内、脑池内、心室内、直肠(即，通过栓剂)、阴道(即，通过阴道环)、颅内、尿道内、肝内和瘤内途径。在一些实施方式中，全身给予组合物(例如通过静脉内注射)。在一些实施方式中，局部给予组合物(例如通过动脉内或眼内注射)。在一些实施方式中，血管内，如静脉内或动脉内给予组合物。在一些实施方式(例如对于肾脏病的治疗)中，将组合物直接给予到动脉(如肾动脉)。在优选实施方式中，皮下给予组合物。最佳有效量的组合物可以以经验确定并将取决于疾病的类型和严重性、给药途径、疾病进展和健康状态、个体的质量和身体面积。这样的确定处于本领域技术人员的技术内。有效量还可基于体外补体激活测定来确定。可用于本文描述的方法的CR2-FH分子的剂量的例子包括，但不限于，约O. 01ug/kg至约300mg/kg、或约O. lug/kg至约40mg/kg内、或具有约 lug/kg 至约 20mg/kg、或约 lug/kg 至约 10mg/kg 内、或约 O. lmg/kg 至约 100mg/kg内、或约 O. lmg/kg 至 50mg/kg 内或约 O. lmg/kg 至约 25mg/kg 内、或约 O. lmg/kg 至约 IOmg/kg内中任一个的剂量范围内的有效量。在一些实施方式中，有效量是约O. lmg/kg至约10mg/kg。在一些实施方式中，有效量是约0. lmg/kg至约20mg/kg。在一些实施方式中，有效量是约0. 1、0· 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20mg/kg 中任一个。例如，当皮下给予时，组合
物可以以低微克范围-包括例如约0. lug/kg或更少、约0. 05ug/kg或更少、或0. Olug/
kg或更少——给予。在一些实施方式中，给予个体的CR2-FH的量是每个剂量约IOug至约500mg per dose,包括例如每个剂量约IOug至约50ug、约50ug至约100ug、约IOOug至约200ug、约 200ug 至约 300ug、约 300ug 至约 500ug、约 500ug 至约 lmg、约 Img 至约 10mg、约IOmg 至约 50mg、约 50mg 至约 100mg、约 IOOmg 至约 200mg、约 200mg 至约 300mg、约 300mg至约 400mg、约 400mg 至约 500mg、约 500mg 至约 600mg、约 600mg 至约 700mg、约 700mg 至约800mg、约800mg至约900mg或约900mg至约IOOOmg中任一个。CR2-H1组合物可以以单个日剂量给予，或总日剂量可以以每天二、三或四次的分开的剂量给予。组合物还可以以比每天一次更小的频率给予，例如，每周六次、每周五次、每周四次、每周三次、每周二次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次。组合物还可以以持续释放制剂给予，如以逐渐释放组合物用于一段时期的植入剂，其允许组合物较不频繁地给予，如一个月一次、每2-6个月一次、每年一次或甚至单次给予。持续释放装置(如片剂、纳米颗粒、微粒、纳米球、微球和类似物等)可通过注射给予或手术植入身体的各种位置。在一些实施方式中，组合物(如TT30)以约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/ml的浓度在水或生理盐水中被提供。在本发明的某些实施方式中，滴定CR2-FH融合蛋白的配量以至于剂量足以减少或阻止红细胞溶解，可完全或部分地抑制或阻断放大C3转化酶(C3bBb)在红细胞表面上的形成和活性；但以足够低的浓度以至于异常细胞的C3包被仍然在全身被观察到，以至于C3能形成流体相的起始C3转化酶(C3iBb)。基因治疗CR2-FH分子还可通过体内CR2-FH融合蛋白的表达来输送，这常常被称作“基因治疗”。例如，可将细胞用编码融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)进行离体工程改造，然后将工程改造的红细胞提供给将用融合蛋白治疗的个体。这样的方法在本领域是众所周知的。例如，可通过本领域已知的操作，通过利用含有为本发明的编码融合蛋白的RNA的反转录病毒颗粒使细胞工程改造。利用基因治疗局部输送本发明的融合蛋白可向局部的靶区提供治疗剂。基因输送的方法在本领域是已知的。这些方法包括，但不限于，直接的DNA转移，参见,例如，Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468 ;2)脂质体介导的 DNA 转移，参见，例如，Caplen et al. (1995)Nature Med. 3:39-46 ；Crystal (1995)Nature Med. 1:15-17 ；Gao and Huang(1991)Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-285 ；3)反转录病毒介导的DNA 转移，参见，例如，Kay et al. (1993) Science 262:117-119 ;Anderson (1992) Science256:808-813 ；4)DNA病毒介导的DNA转移。这样的DNA病毒包括腺病毒(优选基于Ad2或Ad5的载体)、疱疹病毒(优选基于单纯疱疹病毒的载体)和细小病毒(优选基于“缺陷的”或非自治的细小病毒的载体，更优选基于腺相关病毒的载体，最优选基于AAV-2的载体)。参见，例如，Ali et al. (1994)基因治疗1:367-384 ;通过引用并入本文的美国专利号4，797，368，和美国专利号5，139，941。反转录病毒——可从其获得上文提到的反转录病毒质粒载体——包括，但不限于，莫洛尼小鼠白血病病毒、脾坏死病毒、反转录病毒如Rotis肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿类人猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺瘤病毒。在一个实施方式中，反转录病毒质粒载体来自莫洛尼小鼠白血病病毒。腺病毒具有以下优点具有广泛宿主范围，可感染静止的或末期分化的细胞，如神经元或肝细胞，并且基本上呈现非致瘤的。参见，例如，Ali et al. (1994)，supra,第367页。腺病毒似乎不整合进宿主基因组。因为它们存在于染色体外，所以插入诱变的危险大大降低。Ali et al. (1994), supra,第 373 页。腺相关病毒显示与基于腺病毒的载体相似的优点。然而，AAVs显示在人19号染 色体上的位点特异性整合(Ali et al. (1994)，supra,第377页)。基因治疗载体可包括一个或多个启动子。在一些实施方式中，载体具有在多个细胞类型中驱动表达的启动子。在一些实施方式中，载体具有在特定细胞类型(如视网膜细胞或肾脏中的细胞)中驱动表达的启动子。可利用的适合的启动子包括，但不限于，反转录病毒LTR ;SV40 启动子；和Miller et al. (1989) Biotechniques 7 (9) : 980-990 中描述的人巨细胞病毒(CVM)启动子,或任何其它启动子(例如，细胞启动子如真核细胞启动子，包括，但不限于，组蛋白、pol III和β肌动蛋白启动子)。可利用的其它的病毒启动子包括，但不限于，腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和Β19细小病毒启动子。从本文包含的教导选择适合的启动子对本领域技术人员来说将是明显的。编码CR2-FH融合蛋白的核酸序列优选在适合的启动子的控制下。可利用的适合的启动子包括，但不限于，腺病毒启动子，如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；可诱导启动子，如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ΑροΑ1启动子；人球蛋白启动子；病毒的胸昔激酶启动子，如单纯疱疹胸腺激酶启动子；反转录病毒LTRs (包括上文描述的修饰的反转 录病毒LTRs) ； β肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。反转录病毒质粒载体可用于转导包装细胞系以形成生产细胞系。可被转染的包装细胞的例子被描述在Miller(1990)Human Gene Therapy 1:5-14中。载体可通过本领域已知的任何方法转导包装细胞。这样的方法包括，但不限于，电穿孔、脂质体的利用、和CaPO4沉淀。在一个可选方案中，反转录病毒质粒载体可被包入脂质体，或与脂质结合，然后给予宿主。生产细胞系产生感染的反转录病毒载体颗粒，其包括编码多肽的核酸序列(或多个)。这样的反转录病毒载体颗粒可用于体外或体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码多肽的核酸序列(或多个)。可被转导的真核细胞包括，但不限于，胚胎干细胞、胚胎癌细胞、以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质化细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。在一些实施方式中，在允许CR2-FH分子起作用以抑制补体激活的条件下，通过离体使体液与包括CR2-H1分子的组合物接触而抑制补体激活。适合的体液包括可返回到个体的那些体液，如血液、血浆或淋巴。亲和吸附血浆分离置换法(apheresis)在 Nilsson et al. (1988)Blood 58(I) :38-44 ;Christie et al. (1993)Transfusion33:234-242 ；Richter et al. (1997)ASAI0 J. 43(1):53-59 ；Suzuki et al. (1994)Autoimmunity 19:105-112 ;美国专利号5，733，254 ;Richter et al. (1993)Metabol. Clin.Exp. 42:888-894 和 Wallukat et al. (1996) Int’I J. Card. 54:1910195 中被一般性描述。因此，本发明包括在个体中治疗本文描述的一个或多个疾病的方法，包括在允许CR2-FH分子起作用以抑制补体激活的条件下，用包括CR2-FH分子的组合物体外地(extracoporeally)(即，身体外或离体)治疗个体的血液，并将血液返回到个体。单似剂量、制品和试剂盒还提供CR2-FH分子组合物的单位剂型，每个剂量含有约O. Olmg至约50mg，包括例如约O. Img至约50mg、约Img至约50mg、约5mg至约40mg、约IOmg至约20mg、或约15mg中任一个的CR2-H1分子。在一些实施方式中，CR2-H1分子组合物的单位剂型包括约O. Olmg-O. lmg、0. lmg-0. 2mg、0. 2mg-0. 25mg、0. 25mg-0. 3mg、0. 3mg-0. 35mg、0. 35mg-0. 4mg、
0.4mg-0. 5mg、0. 5mg-l. 0mg、5. 0mg_15mg、10mg-20mg、20mg-50mg、50mg-80mg、80mg-100mg、100mg_150mg、150mg-200mg、200mg-250mg、250mg-300mg、300mg-400mg、或 400mg_500mg 中任一个的CR2-ra分子。在一些实施方式中，单位剂型包括约O. 25mg CH2-H1分子。在其它实施方式中，单位剂型包括约IOmg CH2-H1分子。术语“单位剂型”指适合用作个体的单一
剂量(unitatry dosages)的物理上分离的单位,每个单位含有预设量的活性物质-其被
计算以产生期望的疗效——结合适合的制药载体、稀释剂或赋形剂。这些单位剂型可以以单个或多个单位剂量储存于适合的包装中，并还可被进一步灭菌和密封。在一些实施方式中，组合物(如TT30)以约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/ml的浓度在水或生理盐水中被提供。还提供在适合的包装中的制品，其包括本文描述的组合物。用于本文描述的组合物(如眼组合物)的适合的包装在本领域已知，并包括，例如，小瓶(如密封的小瓶)、管、安 瓿、瓶子、罐、软包装(例如，密封的聚脂薄膜或塑料袋)和类似的包装等。这些制品可进一步被灭菌和/或密封。本发明还提供试剂盒，其包括本文描述的组合物(或单位剂型和/或制品)，并可另外包括关于使用该组合物——如本文描述的用途——的方法的说明书(一个或多个)。本文描述的该试剂盒可另外包括商业和使用者立场期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有进行本文描述的任何方法的指示的包装插件。本发明的组合物和制剂可用于与补体激活相关的状况的治疗，优选涉及补体旁路的那些状况，该治疗主要不受末端补体抑制剂[例如，C 3激活以后的补体途径的步骤的抑制剂]的影响。在前述的说明和在下面的实施例中，本发明已用其具体地实施方式进行描述。然而，对本领域技术人员将是明显的是，可对其进行各种修改和变化，而不背离本发明较宽的范围。本文引用的所有出版物在此通过参考它们被引用的教导的公开被特别地并入本文。
实施例实施例I.证明保护红细胞抵御阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)中溶血性溶解的可能机制。该实施例使用TT30 (SEQ ID NO: 3)和PNH作为实例来证明TT30可保护红细胞抵御溶血性溶解的可能机制。PNH RBCs缺乏通过CD55控制C3转化酶和通过CD59控制C5转化酶介导的膜攻击复合物(MAC)形成的能力。在缺少局部补体旁路(CAP)控制的情况下(参见图20)，自发的空转(tichover)产生液相C3 (H2O),其在存在因子D(fD)的情况下与因子B(fB)和备解素(P)结合以形成液相起始C3转化酶，该起始C3转化酶切割C3以释放C3和在RBC表面上沉积共价结合的C3b。在存在fD的情况下C3b与fB和P的结合产生表面结合的放大性(amplifying) C3转化酶。CAP放大环路产生另外的C3b和C3转化酶，并通过将C3b加入到C3转化酶，形成表面结合的C5转化酶。C5转化酶切割C5以释放C5并沉积C5b，导致迅速加入C6、C7、C8和聚C9以形成MAC，导致血红蛋白(Hgb)和乳酸脱氢酶(LDH)的溶解和释放。自发的CAP启动的主要负调节剂是fH。在液相中，fH阻断C3(H2O)与fB的结合。在细胞表面上，fH还破裂放大性C3转化酶，联合蛋白酶I因子(fl)，在细胞表面上将C3b转化成灭活的iC3b，iC3b随后被Π和补体受体I(CRl)转化成C3dg，然后被具有差的特征性的血清蛋白酶转化成C3d。fH还破裂C5转化酶。这些fH活性存在于正常的RBCs和PNH RBCs上，但只部分促成RBCs上必需的补体激活的完全控制。最重要的是，在正常RBCs上(参见图21)，由于CD55 (DAF)，C3转化酶经历加速的衰变，而MAC形成在C9结合步骤被⑶59破坏。因此，在存在正常的保护机制的情况下，自发的CAP激活被控制。虽然fH活性在PNH未被损害，但是在缺少⑶55和⑶59作用的情况下，fH不能充分地控制RBC表面上CAP激活(参见图20)，和溶血后果。保护PNH RBCs抵御血管内溶血(IVH)的一 个方法是阻止MAC的形成，这可通过用抗C5单克隆抗体,如艾库珠单抗阻断C5参与来实现(参见图22)。在该方案(setting)中，不改变fH功能。然而，fH单独不能阻止所有放大性C3转化酶功能，以使PNH RBCs逐渐地变得“包被”有 C3 片段。Risitano et al.，Blood, 113:4094-100 (2009)。这导致这些包被 C3片段的PNH RBCs在肝和脾内的去除一这是称作血管外溶血(EVH)的过程。除了积累C3片段，放大性C3转化酶的连续活性将可能导致PNH RBC表面上C3和C5转化酶的增加的形成。如果未阻断的C5将变的可获得，那么该状况将使PNH RBCs易于溶解，并可解释为什么艾库珠单抗不能体外阻止 PNHRBCs 溶血。Risitano et al. , Blood, 114:71 (2009; AbstractNo. 158;Accessed at: http://ash, confex. com/ash/2009/webprogram/Paper19102.
html)o不被理论束缚，假设TT30 (定向fH)将通过自发的空转来结合沉积在RBC表面上的C3片段，并将阻止C3和C5转化酶和MAC的形成，因此阻止IVH。阻止溶血将导致血清LDH浓度的降低和血细胞比容的增加。此外，TT30可阻止与EVH相关的C3片段的积累(图23)。实施例2. PNH RBCs的补体介导的溶血的体外模型；不同补体抑制剂的作用PNH是一种血液病症，其特征在于由于受影响的红细胞(RBCs)上缺少C抑制剂⑶55和⑶59而引起的补体(C)介导的血管内溶血(IVH)。当不受⑶55控制时，正常的、自发的补体旁路激活可导致C3沉积到PNH RBCs上——这在未治疗的PNH中未检测到，C3和C5转化酶的产生和由于缺少CD59而形成膜攻击复合物(MAC)和溶解。TT30是本发明的65kD重组嵌合人融合蛋白。TT30包括C2受体的iC3b/C3d_结合区和CAP调节剂H因子(fH)的功能结构域，其象CD55 —样起作用以阻断CAPC3转化酶在RBCs表面上的形成和活性。从5个PNH对象(2个是未治疗的，3个是用Ecu治疗的)获得RBCs。从相同的对象和从ABO匹配的健康对象获得血清。Ecu输注之后在估计的 200 μ g/mL峰浓度立即收集用Ecu治疗的PNH对象的血清。汉姆酸溶血试验是体外评价在酸化血清中短暂温育之后补体激活后PNH RBCs对IVH 增加的易感性的诊断方法。Ham and Dingle, J. Clin. Invest. , 18:657 (1939)。汉姆试验的主要原理是在酸化作用引起的补体级联的体外激活之后攻击在新鲜正常人血清中的PNH RBCs (通过定义，由于缺少⑶55和⑶59，其对补体激活敏感)。作为本发明的部分，本发明人发展了汉姆试验，将其改良以延迟溶血和允许连续的评价以评价PNH RBCs对随后溶血(由末端补体激活产生的)的易感性和对溶血前补体激活的易感性(如通过在双色[C3-FITC对⑶59-PE]流式细胞术中由初始C3沉积所评价的)。溶血通过上清液的经典光谱测定法来测量，还通过RBCs的流式细胞术来定量(Ferreirand Pangburn, Blood 2007)。因此，改良的汉姆试验允许评价各种C调节剂对PNH RBCs溶血的作用，以及对初始C3激活和通过CAP的沉积的作用。C3结合的RBCs已显示在PNH中在用末端补体抑制剂艾库珠单抗(Ecu)治疗期间形成，并是这些对象中血管外溶血(EVH)的可能的原因(Risitano et al, Blood2009);在该改良的汉姆试验中，C3沉积通过双色流式细胞术来定量。评价补体抑制剂TT30 (TaligenTherapeutics, Cambridge, MA)。TT30是定向C3转化酶抑制剂,包括从CR2分离的祀向部分和从H因子分离的补体抑制部分。从未治疗的和用艾库珠单抗治疗的PNH对象获得RBCs。从ABO匹配的健康个体获 得血清。简言之，给新鲜的正常血清添加MgCl，并与补体抑制剂(TT30) —起温育。15分钟之后，加入HCl以酸化血清和激活补体级联。将PNH加入(50%悬浮液的1:20)到血清中，并于37°C温育。在不同的时间间隔测量溶血和C3沉积，以评价补体抑制剂的作用。下面描述了材料和实验方法的详细内容。在该改良的汉姆试验中，观察到RBCs的延迟溶解，其来自未治疗的PNH对象；lh之后溶解是部分的(50-70%)，并在72h变得几乎完全溶解。将结果表达为初始PNHRBCs :在
I、6、24和72h之后的存活，存活分别是 65、40、20和〈10%。当与ABO匹配的血清温育时，在来自接受Ecu的对象的PNH RBCs中观察到相同比率的溶血。TT30能显著地抑制未治疗的PNH对象的RBCs溶血。TT30显示浓度和时间依赖的溶血抑制。3_100ηΜ (1000ηΜ=65 μ g/ml)的TT30浓度在甚至Ih时不改善PNH RBC存活。相比之下，300nM TT30导致在Ih时的暂时抑制(存活的PNH RBCs 70%)，这没有持续(在6和24h时存活的PNH RBCs是 50和20%)。TT30的较高浓度(3000nM，等于195 μ g/mL)只在24h导致溶血的完全抑制，虽然具有较长的温育时溶血是明显的(存活的PNH RBCs在1、6、24和72h分别是 90、90、90和50%)。当利用用Ecu治疗的PNH对象的洗过的RBCs时，TT30导致未治疗的PNH RBCs的溶血抑制。最后，改良的汉姆试验研究补体抑制剂对PNH RBCs上C3激活和沉积的作用。与C3转化酶活性的局部RBC表面抑制的机制一致，在120h温育自始至终，TT30暴露没有导致PNH RBCs上任何C3沉积。此外，当利用用Ecu治疗的PNH对象的PNH RBCs时，TT30不允许PNH RBCs上进一步的C3结合，即使预存在的C3+RBCs保持不变。在该模型中，TT30证明浓度和时间依赖性的溶血抑制。3-100ηΜ(1000ηΜ=65μ g/ml)的TT30浓度在甚至Ih时不改善PNH RBC存活。相比之下，300nM TT30导致在Ih时大量的抑制(存活的PNH RBCs 70%)，这没有持续较长时间(在6和24h时存活的PNH RBCs是 50和20%)。TT30的较高浓度(3000nM，等于195 μ g/mL)只在24h导致溶血的完全抑制，虽然具有较长的温育时溶血是明显的(存活的PNH RBCs在1、6、24和72h分别是 90、90,90和50%)。进行改良的汉姆试验以研究C抑制剂对PNH RBCs上C3激活和沉积的作用。与C3转化酶活性的局部RBC表面抑制的机制一致，在120h温育自始至终，暴露于TT30没有导致PNH RBCs上任何C3沉积。我们的数据显示，利用TT30的CAP调节体外抑制PNHRBCs溶血。TT30还抑制存活的PNH RBCs上的C3激活和沉积，这最近已被描述为接受末端补体抑制剂艾库珠单抗的PNH对象中残留溶血和贫血的主要原因。这些发现为通过靶向和抑制CAP而治疗与PNH相关的IVH和EVH的潜在新机制提供理论。
总之，发展了本文描述的“改良的汉姆试验”以体外评价C抑制剂对PNH RBCs的有效性。来自该试验的数据显示，利用TT30的CAP调节体外抑制PNH RBCs溶血。然而，与Ecu不同，TT30还抑制存活的PNH RBCs上的C3激活和沉积。这些发现为通过靶向和抑制CAP而治疗与PNH相关的IVH和EVH的潜在新机制提供有效性的证据。材料和实验方法从ABO匹配的供体获得新鲜血清。通过用NaCl O. 9%洗涤三次从PNH对象获制备的新鲜红细胞；利用50%或25%重悬浮液用于实验(分别为与血清比1:20和1:10)。50%RBC重悬浮液应是约5 X IO6RBCs/ μ L0制备以下溶液和试剂MgCl2 (六水合物(hexahydratate), MW 203)制备 IOOmM 忙存液(IOmL 蒸懼水中 2.03g);制备30mM工作溶液(由贮存液，1:3. 3)，在最后的实验中与血清以1:20比使用。HCl从可利用的37%溶液(=12M)开始；制备IM=IN溶液(IOOmL蒸馏水中8. ImL)；制备O. 4或O. 2工作溶液(分别与血清以1:20和1:10比使用)。TT30 (MW 65kDa)-从118 μ M溶液(7. 71mg/mL)开始；制备两个工作溶液；6 μ M (由贮存液，1:20) ;0. 6 μ M(由工作溶液A，1:10)。根据稀释曲线使用合适的量(最终的范围3-3000ηΜ)。根据表I进行制备。将500 μ L(10份；I份等于50 μ L)血清(或适当的水)加入到所有的管中。将25yL(0. 5份)30mM MgCl溶液加入到适当的管中。加入适当浓度的抑制剂，如表I中所示，并温育15分钟。加入HCl以酸化血清。表I管和内含物
蘇抑制剂
1S.....pnh'rbcs......
2NaCl 0.9% PNH RBCs
"3ISPNH RBCsMgCl
IKIfciLttPNHRBCs.........MgCl
5酸化血淸PNH RBCsMgCl TT30 3000 nM (120 μΜ 的 15 μ )
___PNHRBCsMgCl^ ^TT30 1000 ηΜ(120 μΜ fl<J 5 μ )
~7酸化血清PNH RBCsMgClTT30 300 nM (6 μΜ 的 30 μ )
:8........................酸化血淸PNH RBCsMgCl^ ^TT30 100 nM (6 μΜ 的 10 μ )
"9酸化血淸PNH RBCsMgClΤΤ30 30 nM (0.6 μΜ 的 30 μ )
10酸化血淸PNH RBCsMgCl ΤΤ30 10 nM (0.6 μΜ 的 10 μ )
11酸化血清PNH RBCsMgCl ΤΤ30 3 nM (0.6 μΜ 的 3 μ )将50yL(l份)0. 2Μ HCl加入到每个管中。将RBC重悬浮夜加入到所有的管中，作为25 μ L (O. 5份)50%RBC悬浮液，约5 X 106/uL ;每管使用25uL 50%RBC悬浮液。将管于37°C温育(持续至少72h)。(于lh、6h、24h和72h)检查溶血和C3包被通过CD59/C3流式细胞术染色对RBC沉淀(pellet)进行。将I μ L RBC 沉淀(约 IO7RBCs)以 1:1000 稀释；将 NaCl 中 50uL 104/uL*RBC 重悬浮液与IuL抗C3多克隆抗体和5uL抗⑶59单克隆抗体一起温育。将样品于室温温育Ih ；加入250-500uLNaCl之后，无需另外冲洗,通过流式细胞术分析(Risitano et al, Blood113:4094-4100(2009))。如下计算PNH RBCs 的存活(Ferreirand Pangburn, Blood, 110:2190-2192 (2007)):存活％=(之后的PNH%/之后的N%) X (之前的N%/之前的PNH%)
如下计算PNH RBCs的溶解％溶解=100- (%存活)。实施例2A :补体介导的PNH RBCs溶血的体外模型；不同补体抑制剂的作用发展了体外模型以允许评价TT30和艾库珠单抗的比较有效性。该体外模型是改良的汉姆试验，其中将PNH RBCs暴露于ABO匹配的酸化的正常血清(ANS)，这导致自发的CAP激活(Pascariello et al. , European Hematologic Association (EHA), Barcelona, June10-13，(2010)) o当将来自未治疗的患者的PNH RBCs与ANS温育24小时时，74± 16%的PNHRBCs溶解，具有针对C3片段(C3frag)存在的RBC鬼影染色。相比之下，与I或3 μ M(65或195 μ g/ml)TT30温育导致只有14±26%或5±7%的PNH RBCs溶血，存活的PNH RBCs是在它们表面上C3片段阴性的。人fH的等摩尔浓度产生少得多的溶血抑制(约50%溶解)，支持TT30是细胞靶向的观点。利用抗fH mAb通过流式细胞术，TT30的靶向的fH补充被PNHRBC表面上显示结合的TT30所证实。因此，TT30阻止溶血，代表艾库珠单抗治疗的PNH患者中IVH以及C3frag积累发生时EVH观察到的溶血。已将TT30的有效性直接与该模型中艾库珠单抗的有效性进行了比较(Risitanoet al. ,Biologies:Targets & Therapy, 2:205-22 (2008), Risitano et al. , Blood,113:4094-100(2009)) o PNH RBCs从5个PNH患者(2个未治疗，3个用艾库珠单抗治疗)获得；血清从相同的患者和从ABO匹配的健康对象获得。艾库珠单抗输注之后，在估计的"200 μ g/mL峰浓度立即收集用艾库珠单抗治疗的PNH患者的血清。将TT30加入到血清中至终浓度范围从0. 195至195μ g/mL(0. 003至3μΜ)。将PNH RBCs在血清中与或不与艾库珠单抗或ΤΤ30温育，并在各个时间点评价。I小时之后，直到 70%的PNH RBCs被ABO匹配的血清溶解。艾库珠单抗显著地减少溶血(在I小时时至只有 25%)，但不能提供完全的保护，并与递增的C3frag+PNH RBCs积累相关(图31)。在PNH患者中，推荐的将保持的用于阻止溶血的最小血浆艾库珠单抗浓度是 35 μ g/mL (Risitano et al. , Biologies: Targets & Therapy, 2:205-22 (2008))。因此，该体外溶血试验可能过高评价在PNH中阻止溶血的有效浓度。TT30以浓度依赖的方式阻止PNH RBCs溶血。在65 μ g/mL达到溶血的完全Γ 00%)抑制。在195 μ g/mL,TT30在24小时里完全阻止C3片段积累和溶血(图31)。在每个时间点评价在整个浓度范围TT30对PNH RBC存活的作用(图32)，并计算ICltl和IC9tl值(表1A)。温育I小时之后，抑制CAP介导的PNH RBCs溶血的ICltl和IC9tl值分别为4. 3和87. 9 μ g/mL。表IA体外溶血试验中TT30抑制CAP介导的CD59-PNH RBCs溶血的ICltl和IC9tl值
权利要求
1.治疗具有补体介导的影响血细胞的溶血疾病的对象的方法，所述方法包括给予有效量的抑制补体旁路激活的组合物， 其中所述组合物抑制补体成分C3(C3)的激活和C3的片段引起的红细胞的调理作用。
2.治疗对象中补体介导的溶血的方法，所述方法包括 给予有效量的抑制补体旁路激活的组合物， 其中所述组合物维持乳酸脱氢酶和血红蛋白的正常血清水平。
3.权利要求I或2所述的方法，其中所述组合物选择性地抑制补体旁路。
4.权利要求2所述的方法，进一步包括给予所述对象末端补体抑制剂。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述对象具有阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)，并且在缺少所述组合物的情况下所述对象的红细胞受C3片段的调理。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述抑制所述补体旁路活性的组合物包括融合蛋白，所述融合蛋白包括 补体受体2(CR2)蛋白或其生物学活性片段；和 H因子(fH)蛋白或其生物学活性片段。
7.权利要求6所述的方法，其中所述融合蛋白包括融合到fH的前五个氨基末端SCR结构域的CR2的前四个氨基末端短共有重复序列(SCR)结构域。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述个体先前已用末端补体抑制剂治疗。
9.权利要求8所述的方法，其中所述个体对所述末端补体抑制剂的治疗无应答、部分应答或有进展。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述末端补体抑制剂抑制补体蛋白C5 (C5)的切割。
11.权利要求10所述的方法，其中所述末端补体抑制剂是人源化抗C5抗体或其抗原结合片段。
12.权利要求11所述的方法，其中所述末端补体抑制剂是艾库珠单抗。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述对象具有以下特征中的一个或多个 i.所述对象显示进行的或间歇的血管内溶血和/或血管外溶血引起的连续红细胞丧失的征兆或症状； j.所述对象具有受C3片段调理的红细胞； k.所述对象需要定期输血； I.所述对象具有低的正常水平血红蛋白或低于正常水平的血红蛋白； m.所述对象具有低的正常水平血小板或低于正常水平的血小板； η.所述对象具有高的正常网状细胞或高于正常的网状细胞； ο.所述对象具有高的正常胆红素或高于正常的胆红素；或 P.所述对象具有铁超负荷或面临铁超负荷的危险。
14.权利要求13所述的方法，其中所述对象需要定期输血。
15.权利要求13所述的方法，其中所述对象因此被给予独立的输血。
16.权利要求13所述的方法，其中所述对象具有低于正常水平的血红蛋白。
17.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述组合物增加所述对象中红细胞的存活。
18.权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述补体介导的溶血疾病是镰状细胞贫血。
全文摘要
治疗具有补体介导的溶血疾病，如阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)和其它溶血性贫血的对象的方法，该方法包括给予有效量的抑制补体旁路活性的组合物。
文档编号A61K39/395GK102958535SQ201080060629
公开日2013年3月6日 申请日期2010年11月5日 优先权日2009年11月5日
发明者V·M·郝勒斯, A·M·里西塔诺 申请人:亚力史剑桥公司