专利名称：含6-羟基犬尿喹啉酸的银杏叶提取物的制作方法
技术领域：
本发明涉及天然植物提取物，具体涉及银杏叶(Ginkgo bilobaL.)的有效成分的 提取物，尤其涉及一种含6-羟基犬尿喹啉酸6-hydroxykynurenic acid(6-HKA)的新一代 银杏叶提取物。
背景技术：
从银杏叶提取物研发改善血液循环的药物，至今已有40多年，从上世纪90年代 起，中国对银杏叶提取物进行了研究，发展了它的应用范围，并为心血管疾病患者提供了能 够明显改善心脏冠状动脉血液流量的药物，极大地缓解了冠心病心绞痛病人的痛苦，同时 改善了生活质量。银杏叶提取物已广泛应用于药品和保健品。随着对银杏叶研究的深入，在银杏叶中发现了新的有效成分，如6-羟基犬尿喹啉 酸(6-HKA)，有文献报道它是一种N-甲基门冬氨酸(NMDA)拮抗剂(陈仲良，殷梦龙等，世界 药品信息，2-2001)属于神经免疫方面的有效成分，有缓解脑内缺氧的功能，其与银杏叶中 另一有效成分白果内酯的协同作用，可望成为预防脑内营养不良，防止脑神经凋亡等神经 免疫性疾患，并有用于治疗和改善早老性痴呆等神经损伤患者的认知缺陷的可能。经过调研后发现，至今，国内外的银杏叶提取物的有效成分质量标准仅针银杏黄 酮苷和银杏内酯设定含量指标，6-HKA还未被应用于银杏叶提取物的质量标准中。现有的银杏叶提取方法是经水、乙醇或者丙酮作提取剂，继而采用水或乙醇沉淀、 PH调节结合大孔树脂层析或者乙酸乙酯、2-丁酮、3-戊酮萃取并精制获得的。一般需要经 过8-10步以上的技术工序才能得以完成。这样的制备过程，所获得的银杏叶提取物中基本 流失了 6-HKA成分。由于6-HKA是同时含酸性和碱性盐基性团的有机化合物，分子中的阴 阳离子成盐性质决定了它的水溶性质，根据其类似氨基酸的性质推测，其只有在被充分游 离后才有可能以最高效率被获取；又因6-HKA是一种有机成分，所以它在某些有机溶剂中 应该具有很好的溶解度；再者就是6-HKA分子结构中的4位羟基在某些条件会转变成为4 位羰基从而影响到对6-HKA的富集。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提供新的含有6-羟基犬尿 喹啉酸(6-HKA)的银杏叶提取物。同时公开一种有利于节能环保、安全高效和简单经济的 含6-羟基犬尿喹啉酸(6-HKA)的银杏叶提取物制备方法。本发明提供了一种含6-羟基犬尿喹啉酸的银杏叶提取物。6-羟基犬尿喹啉酸 (6-HKA)是一种既含酸性官能团又含碱性官能团的盐基性有机化合物(陈仲良，殷梦龙.银 杏叶中抗老年痴呆的活性成分.世界药品信，2001,2(1))，经HPLC分析本发明提供的银杏 叶提取物中6-HKA的含量在3% 4. 5%。6-羟基犬尿喹啉酸(6-HKA)的结构式如下
本发明为获取6-HKA，并使制备银杏提取物的过程达到环保节能、安全高效、简单 经济的目的。采用了反常规的制备路线设计，创造性地将用于萃取的溶剂直接用作提取。本发明的另一目的是提供了上述含6-羟基犬尿喹啉酸(6-HKA)的银杏叶提取物 的制备方法，该方法包括下列步骤(1)银杏叶粉碎，用混合溶剂提取；(2)提取液浓缩成浸膏(浓缩的浸膏含水分10 15% )；(3)将浸膏用水加热捏溶，冷却捏溶物料；(4)冷却的捏溶物料澄清处理得到澄清液；(5)澄清液浓缩；(6)浓缩液干燥得到含6-羟基犬尿喹啉酸的银杏叶提取物。所述步骤(1)提取所用的银杏叶原料可以市售得到，优选GAP基地种植并烘干的 银杏叶，其中银杏黄酮含量在0. 8 1. 2%;提取用的混合溶剂用量为银杏叶重量的8 12 倍 kg/kg，优选 10 倍 kg/kg。所述混合溶剂由溶剂a)、溶剂b)和溶剂C)组成，其中溶剂a)可以是乙酸乙酯、 2-丁酮或3-戊酮，优选乙酸乙酯；溶剂b)可以是甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇，优选乙醇；溶 剂c)可以是pH 6. O的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液或柠 檬酸-柠檬酸钠缓冲液，优选磷酸盐缓冲液。所述混合溶剂a)、b)和c)各溶剂的用量为银 杏叶重量的倍数依次为a) 7 11倍kg/kg，优选9倍kg/kg、b) 0. 5 1. 5倍kg/kg，优选 0. 5倍kg/kg ；c)0. 5 1. 5倍kg/kg，优选0. 5倍kg/kg ；提取方法可以是静态回流、搅拌动 态回流或者超声波热提取，优选超声波热提取；提取2 3次，优选提取2次；提取时间每 次1 2小时，优选提取2小时；使用超声波热提取的温度35 50°C，优选35°C，提取时间 20 40分钟，优选35分钟。所述步骤( 浓缩方式可以是常压浓缩、真空浓缩、优选真空浓缩；真空浓缩温度 控制在35 60°C，优选50°C ；真空度为0. 09 0. 095MPa，优选0. 095MPa。蒸馏到无溶剂 味止，得到浸膏的水分含量在10 15%。所述步骤C3)加热捏溶的用水量是浸膏重量8 20倍量kg/kg，优选20倍量kg/ kg;所述水选自去离子水、反渗透纯水或蒸馏水，优选用反渗透纯水；捏溶是在60 100°C 加热下搅拌捏溶，加热温度优选85°C;捏溶操作0. 5 1小时，优选40分钟；将捏溶所得的 料液用冰箱冷却或者冷却槽冷却，优选冷却槽冷却；将料液冷却降温到4 10°C，优选降温 到4°C ；保持2-8小时，优选4小时。所述步骤(4)冷却液过滤澄清选择采用离心沉降结合布氏漏斗吸滤或者微孔膜 过滤，优选离心机结合微孔滤膜；所述微孔滤膜的孔径为10 2微米，优选2微米。
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所述步骤( 澄清液浓缩选用真空浓缩或反渗透浓缩结合真空浓缩，优选反渗透 结合真空浓缩；所述反渗透浓缩温度为32 38°C，压力为9 llMPa，优选为35°C，压力 9MPa，真空浓缩温度为35 60°C，优选50°C ；真空度为0. 09 0. 095MPa，优选0. 095MPa ； 浓缩至无液体蒸出为止。所述步骤(6)浓缩液干燥方法为将浓缩液取出进行冷冻干燥或浓缩液在原位继 续进一步加热真空干燥，优选加热真空干燥；所述加热真空干燥温度为85 90°C干燥采用 真空干燥或冷冻干燥，优选真空干燥；所述加热真空干燥温度为85 90°C，优选85°C，保持 真空度为0. 09 0. 095MPa，优选0. 095MPa ；干燥时间控制在3 4小时，优选4小时。本发明方法得到的银杏叶提取物经HPLC检测，含有6-羟基犬尿喹啉酸(6-HKA) 的含量为3% 4. 5%。本发明为进一步开发银杏叶的新用途提供基础，有较大的应用价值。
图1实施例1银杏叶提取物的HPLC分析图2实施例2银杏叶提取物的HPLC分析图3实施例3银杏叶提取物的HPLC分析
具体实施例方式以下实施例使用的银杏叶从中药材市场购得。实施例1取银杏黄酮含量0. 8%的粉碎银杏叶0. ^g，置入不锈钢桶中，加入4. 5kg新重蒸 的乙酸乙酯，0. 25kg药用无水乙醇和pH = 6. 0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0. 2mol/ L)0.25kg。加热到35°C，置于超声波清洗器中，开启超声电源恒温提取35分钟。用布氏漏 斗吸滤获得第一次提取液，重复第一次操作后获得第二次提取液。合并提取液用旋转蒸发 仪真空浓缩，条件分别为50°C和0. 095MPa,得到浸膏90g。趁热在浸膏瓶中加入ISOOg反渗 透纯水，加热并搅拌，待物料温度达85°C起计时，保持温度并搅拌30分钟后，停止加热改为 料液原位置于冰浴中降温冷却并伴随搅拌。待物料降温到4°C时停止搅拌和降温，物料在 4°C水浴中静置6小时。倾出冷却静置物料，用台式离心机离心以8000转/分钟离心12分 钟。收集料液，沉淀做三废处理。所得料液用布氏漏斗加滤纸真空过滤。滤液用小型反渗 透设备R0(NF)-4050/4100/4010型浓缩(35°C，9MPa)至白利度(Brix)IO时将料液转移 至旋转蒸发仪浓缩(50°C，0.095MPa)浓缩至无液体蒸出，然后在原位将物料加热到80°C， 并将真空度保持在0. 95MPa持续4小时得含6-HKA的银杏叶提取物固体Sg。提取物经HPLC分析6-HKA含量为4. 30 %。缓冲液配比0.2mol/L 的 Na2HPO412. 3ml 与 0. 2mol/L 的 NaH2P0487. 7ml。 Na2HPO4 · 2H20 分子量=178. 05 ；0. 2mol/L 溶液为 35. 61g/L。Na2HPO4 · 12H20 分子量= 358. 22 ；0. 2mol/L 溶液为 71. 64g/L。NaH2P04 · H2O 分子量=138. 01 ；0. 2mol/L 溶液为 27. 6g/L。NaH2PO4 · 2H20 分子量=156. 03 ；0. 2mol/L 溶液为 31. 21g/L。实施例2取银杏黄酮含量0. 8%的粉碎银杏叶0. 5kg,置入不锈钢桶中，加入4. 5kg新重蒸的2- 丁酮，0. 25kg药用异丙醇和pH = 6. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(0. 2mol/ L)0.25kg。加热到35°C，置于超声波清洗器中，开启超声电源恒温提取35分钟。用布氏漏 斗吸滤获得第一次提取液，重复第一次操作后获得第二次提取液。合并提取液用旋转蒸发 仪真空浓缩(50°C和0. 095Mpa)，得到浸膏78g。趁热在浸膏瓶中加入ISOOg反渗透纯水，加 热并搅拌，待物料温度达85°C起计时，保持温度并搅拌30分钟后，停止加热改为料液原位 置于冰浴中降温冷却并伴随搅拌。待物料降温到4°C时停止搅拌和降温，物料静置6小时。 倾出冷却静置物料，用台式离心机离心以8000转/分钟离心12分钟。处理所得料液用布氏 漏斗加滤纸吸滤。滤液用小型反渗透设备R0(NF)-4050/4100/4010型浓缩(35°C，9MPa) 至白利度(Brix)9时将料液转移至旋转蒸发仪浓缩(50°C，0.095MPa)浓缩至无液体蒸出， 然后在原位真空度干燥(80°C，0. 95MPa，4小时)得到含6-HKA的银杏叶提取物固体7. 6g。提取物经HPLC分析6-HKA含量为4. 50 %。缓冲液配比0.2mol/L 的 Na2HPO412. 63ml 与 0. lmol/L 的柠檬酸 7. 37ml。Na2HPO4 分子量=141. 98 ；0. 2mol/L 溶液为 28. 40g/L。Na2HPO4 · 2H20 分子量=178. 05 ；0. 2mol/L 溶液为 35. 61g/L。Na2HPO4 · Iffl2O 分子量=358. 22 ；0. 2mol/L 溶液为 71. 64g/L。柠檬酸 C6H8O7 · H2O 分子量=210. 14 ；0. lmol/L 溶液为 21. 01g/L。实施例3取银杏黄酮含量0. 8%的粉碎银杏叶0. ^g，置入不锈钢桶中，加入4. 5kg新重蒸 的3-戊酮，0. 25kg药用丙醇和pH = 6. 0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0. 2mol/L)0. 25kg。 加热到50°C，置于超声波清洗器中，开启超声电源恒温提取35分钟。用布氏漏斗吸滤获得 第一次提取液，重复第一次操作后获得第二次提取液。合并提取液用旋转蒸发仪真空浓缩， 浓缩(60°C和0. 095Mpa)，得到浸膏71g。趁热在浸膏瓶中加入ISOOg反渗透纯水，加热并搅 拌，待物料温度达85°C起计时，保持温度并搅拌30分钟后，停止加热改为料液原位置于冰 浴中降温冷却并伴随搅拌。待物料降温到4°C时停止搅拌和降温，物料静置6小时。倾出冷 却静置物料，用台式离心机离心以8000转/分钟离心12分钟。处理所得料液用布氏漏斗 加滤纸吸滤。滤液全部用旋转蒸发仪浓缩(60°C，0.095MPa)并原位干燥(80°C，0. 95MPa，4 小时)得到含6-HKA的银杏叶提取物固体7. 3g。 提取物经HPLC分析6-HKA含量为4. 20 %。缓冲液配比0. lmol/L柠檬酸3.8ml与0. lmol/L柠檬酸钠16. 2ml。柠檬酸 C6H8O7 · H2O 分子量=210. 14 ；0. lmol/L 溶液为 21. 01g/L。柠檬酸钠=Na3C6H5O7 · 2H20 分子 量=294. 12 ；0. lmol/L 溶液为 29. 41g/L。
权利要求
1.一种含6-羟基犬尿喹啉酸的银杏叶提取物，其特征在于，所述银杏叶提取物中6-羟 基犬尿喹啉酸的含量为3^-4.5 ^
2.一种如权利要求1所述含6-羟基犬尿喹啉酸的银杏叶提取物制备方法，其特征在于 该方法包括下列步骤(1)银杏叶粉碎，用混合溶剂提取；(2)提取液浓缩成浸膏；(3)浸膏用水加热捏溶，冷却捏溶物料；(4)冷却的捏溶物料澄清处理得到澄清液；(5)澄清液浓缩；(6)浓缩液干燥得到含6-羟基犬尿喹啉酸的银杏叶提取物。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(1)提取所用的银杏叶为银杏黄酮含量 在0. 8 1. 2%的银杏叶；提取用的混合溶剂用量为银杏叶重量的8 12倍kg/kg，优选10 倍kg/kg ；所述混合溶剂由溶剂a)、溶剂b)和溶剂c)组成，其中溶剂a)为乙酸乙酯、2- 丁 酮或3-戊酮，优选乙酸乙酯；溶剂b)为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇，优选乙醇；溶剂c) SpH 6. 0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓 冲液，优选磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；提取方法为静态回流、搅拌动态回流或超声波 热提取，优选超声波热提取；提取2 3次，优选提取2次；提取时间每次1 2小时，优选 提取2小时；使用超声波热提取的温度35 50°C，优选35°C，提取时间20 40分钟，优选 35分钟。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(1)所述混合溶剂a)、b)和c)中各溶 剂的用量为银杏叶重量的倍数依次为a) 7 11倍kg/kg，优选9倍kg/kg、b) 0. 5 1. 5倍 kg/kg,优选 0. 5 倍 kg/kg、c) 0. 5 1. 5 倍 kg/kg，优选 0. 5 倍 kg/kg。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤( 浓缩方式为常压浓缩或真空浓缩， 优选真空浓缩，真空浓缩温度控制在35°C 60°C，优选50°C，真空度为0. 09 0. 095MPa, 优选0. 095MPa，浓缩得到浸膏，其中水分含量在10 15%。
6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤C3)用水加热捏溶的加水量是浸膏重量 8 20倍量kg/kg，优选20倍量kg/kg ；所述水选自去离子水、反渗透纯水或蒸馏水，优选用 反渗透纯水；捏溶是在60 100°C加热下搅拌捏溶，加热温度优选85°C;捏溶操作0. 5 1 小时，优选40分钟；将捏溶所得的料液用冰箱冷却或者冷却槽冷却，优选冷却槽冷却；将料 液冷却降温到4 10°C，优选降温到4°C ；保持2-8小时，优选4小时。
7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(4)冷却液过滤澄清采用离心沉降结 合布氏漏斗吸滤或者微孔膜过滤，优选离心机结合微孔滤膜；所述微孔滤膜的孔径为10 2微米，优选2微米。
8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(5)澄清液浓缩选用真空浓缩或反渗透 浓缩结合真空浓缩，优选反渗透结合真空浓缩方式；所述反渗透浓缩温度为32 38°C，压 力为9 llMPa，优选为35°C，压力9MPa，真空浓缩温度为35°C 60°C，优选50°C ；真空度 为0. 09 0. 095MPa，优选0. 095Mpa，浓缩至无液体蒸出为止。
9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(6)浓缩液干燥方法为将浓缩液取出进 行冷冻干燥或浓缩液在原位继续进一步加热真空干燥，优选加热真空干燥；所述加热真空干燥温度为85 90°C干燥采用真空干燥或冷冻干燥，优选真空干燥；所述加热真空干燥温 度为85 90°C，优选85°C，保持真空度为0. 09 0. 095MPa,优选0. 095MPa ；干燥时间控制 在3 4小时，优选4小时。
全文摘要
本发明公开一种含6-羟基犬尿喹啉酸6-hydroxykynurenic acid(6-HKA)的银杏叶提取物，其与银杏叶中的白果内酯有协同作用，所述提取物中6-HKA含量在3～4.5％。本发明提供了含6-HKA的银杏叶提取物的制备方法，采用混合溶剂提取，经过浓缩、水沉、过滤、干燥等步骤得到提取物。本发明为进一步开发银杏叶的新用途提供基础，有较大的应用价值。
文档编号A61P25/28GK102133243SQ201110056540
公开日2011年7月27日 申请日期2011年3月9日 优先权日2011年3月9日
发明者张有发, 殷梦龙, 董惠燕, 龙伟岸 申请人:上海诺德生物实业有限公司