专利名称：一种降血脂益生菌剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及降血脂功能食品或药物，具体涉及一种降血脂益生菌剂的制备方法。
背景技术：
随着人们生活水平的不断提高，亚健康人群越来越多，尤其血液三高现象人数大量增多。血脂是心血管病变的重要指标，血脂升高会使动脉粥样硬化和心血管系统疾病的爆发可能性增高，可引起心血管等脏器的各种并发症，如并发动脉硬化、并发心脏病、出现脑子供血不足等问题，出现肝功能异常、尿毒症、高脂血症胰腺炎等也可以并发高脂血症的症状。胆固醇跟甘油三酯都有两部分，一部分是外面吃进来的，这部分不是人体胆固醇增高的主要部分，还有一大部分是自身合成为内源性胆固醇、内源性甘油三酯。有关降血脂的药物或功能食品多种多样，药物主要有中成药和西药；功能食品也是以各种中药与食物配制而成，如公告号为CN1099293发明专利，就公开了由各种中药材配伍(莱服子、山楂、谷芽、 无花果、绿豆、山药等)、水煮成水煮液，再用酵母菌发酵，得到菌泥组合物成为降血脂制剂。 但由于中药材的价格不断提高，各种以中药材为主料的降血脂中成药和保健品的成本也不断提高。虽然公告号为CN101919875发明专利申请，公开了浒苔多糖和香菇多糖复合物可以提高机体免疫力和抗肿瘤等作用，但有关浒苔具有降血脂作用未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种原料成本较低、制备方法简单、对胃肠功能有促进作用，可降低血脂的的降血脂益生菌剂的制备方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种降血脂益生菌剂的制备方法，包括下述步骤
a种子培养按重量百分份5 8 %的碳源、2 4 %的氮源、0. 3 0. 6 %的NaCl、 0. 001 0. 003 %&MnS04，余量为水，混合后搅拌均勻配成种子培养基，所述碳源为蔗糖、麦芽糖、β-环糊精、葡萄糖或可溶性淀粉，所述氮源为酪蛋白、酵母浸膏、大豆蛋白、明胶或牛肉膏，然后在所述种子培养基中接入地衣芽孢杆菌BLc株，该地衣芽孢杆菌BLc株的保藏号为CGMCC No :4324，37°C下培养8 10小时得到地衣芽孢杆菌BLc株菌液；种子培养后该地衣芽孢杆菌BLc株活化并大量繁殖，满足发酵所需的菌落数；该地衣芽孢杆菌BLc株的保藏单位为位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2010年11月12日，拉丁文名称为feciB^s Iicheniformis ； 其中NaCl和MnSO4都为化学纯；
b发酵培养基按重量百分份4 10 %的浒苔干粉、1 4 %的酵母浸膏，0. 1 0. 5 % 的 NaCl, 0. 2 0. 6 % 的 K2HPO4 · 3H2 0、0. 01 0. 03 % 的 NaH2PO4,余量为水，混合后用 Na2CO3调pH值为6 7，搅拌均勻配成发酵培养基；其中NaCl、K2HP04 · 3H2 0、和NaH2PO4都为化学纯；酵母浸膏作为菌种发酵的营养液，NaCUK2HPO4 · 3H2 0、和NaH2PO4能促进地衣芽胞杆菌BLc株分泌酶和提高酶活性的作用，pH 6 7酶活性较高，有利于将浒苔中浒苔多糖、萜类和留体等游离出来；
c接种在所述发酵培养基中接入所述地衣芽孢杆菌BLc株菌液，所述地衣芽孢杆菌 BLc株
菌液的接入重量是所述发酵培养基重量的8 12 %，每毫升所述地衣芽孢杆菌BLc株菌液的活菌数为5X IO5 5X IO7个；所述地衣芽孢杆菌BLc株菌液接入前需活菌数检测， 并稀释至接种标准的活菌数；
d发酵37°C室温，120 r/min摇床或发酵罐上培养36 40h，静置沉淀、离心得到沉淀
物；
e喷雾干燥在所述沉淀物加入脱脂奶粉均质，用无菌水稀释成固形物含量为10 25% (W/V)，再添加β -环糊精均勻混合，在进风温度为100 120°C，出风温度为80 100°C， 进料速度8 lOmL/min条件下喷雾干燥，得到降血脂益生菌剂，所述脱脂奶粉加入重量是所述沉淀物重量的1 5%，所述β -环糊精添加重量是所述沉淀物重量的5 8%。所述种子培养基由6 %的蔗糖、3 %的酪蛋白、0. 5 %的NaCl、0. 002 %的MnSO4,余量为水配制而成。所述发酵培养基由8 %的浒苔干粉、3 %的酵母浸膏，0.3%的NaCl，0.4 %Κ2ΗΡ04 · 3Η2 0、0· 02 %的NaH2PO4,余量为水配制而成。所述地衣芽孢杆菌BLc株菌液的接入重量是所述发酵培养基重量的10 %。菌种保藏方法按重量百分份的蛋白胨1%、牛肉膏0. 3%, NaCl 0. 05 %，琼脂粉2%， 余量为水，搅拌均勻配成菌种保藏培养基，在菌种保藏培养基中接入地衣芽孢杆菌BLc株， 于4°C下保存，可保藏半年左右。具有长期保存的作用。与现有技术相比，本发明的优点在于一种降血脂益生菌剂的制备方法，通过种子培养将地衣芽孢杆菌BLc株活化和扩大培养，再将扩大培养的地衣芽孢杆菌BLc株接入发酵培养基中发酵，发酵培养基中NaCl、K2HP04 · 3H2 O、和NaH2PO4具有促进BLc株的蛋白酶、 脂肪酶、淀粉酶等各种酶的分泌和提高酶活性的作用，将培养基的PH控制在6 7，可提高酶的活性，使浒苔降解，得到的沉淀物不但含有浒苔降解产物如浒苔多糖、萜类、留体和短纤维等，还含有大量的地衣芽孢杆菌BLc株孢子体，喷雾干燥孢子体暂时失活，食用后进入胃肠复活并分泌各种酶，促进胃肠食物分解，将胆固醇、脂肪等分解，同时能拮抗肠道致病菌，而浒苔降解产物具有降血脂、抗脂质过氧化及预防脂肪肝的作用，可降低血清TC、TG，促进HDL-C的生成，减少脂质在血管内膜的沉积，增加自由基清除及增加机体抗氧化能力；因此本发明一种原料成本较低、制备方法简单、对胃肠功能有促进作用，可降低血脂的的降血脂益生菌剂的制备方法。上述地衣芽孢杆菌BLc株(ZicAmifbiTffi1S)的保藏日期为2010年11月12日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No 4324。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1
一种降血脂益生菌剂的制备方法，首先对地衣芽孢杆菌BLc株(保藏号为CGMCC No 43 )扩大培养，种子培养基由600克蔗糖、300克酪蛋白、50克NaCl、2克MnSO4混合后，加水至总重10000克，搅拌均勻配成种子培养基，接入地衣芽孢杆菌BLc株，37°C下培养8 10小时，镜检活菌数，若过多，需稀释成每毫升菌液活菌数为5 X IO5 5 X IO7个，得到地衣芽孢杆菌BLc株菌液保存备用；再配制发酵培养基将8公斤浒苔干粉、3公斤酵母浸膏、 0. 3公斤NaCUO. 4公斤K2HPO4 · 3Η2 0、0· 02公斤NaH2PO4混合后，加水至总重100公斤，搅拌均勻配成发酵培养基，再用Na2CO3调ρΗ为6 7 ；在发酵培养基接入10公斤地衣芽孢杆菌BLc株菌液，37°C室温下，在120 r/min摇床上培养36 40h，静置沉淀、离心得到沉淀物；在沉淀物加入脱脂奶粉均质；脱脂奶粉加入量是沉淀物重量的3 4%，用无菌水稀释成固形物含量为15 20% (W/V),再添加β -环糊精均勻混合，β -环糊精添加量是沉淀物重量的6 7%，在进风温度为100 120°C，出风温度为80 100°C，进料速度8 10mL/min 条件下喷雾干燥，得到降血脂益生菌剂。实施例2
与实施例1基本相同，所不同的只是种子培养基由500克麦芽糖、200克酵母浸膏、30 克NaCl、l克MnSO4混合后，加水至总重10000克配制而成；发酵培养基由4公斤浒苔干粉、 1公斤酵母浸膏、0. 1公斤NaCUO. 2公斤K2HPO4 · 3Η2 0、0· Ol公斤NaH2PO4混合后，加水至总重100公斤配制而成；在发酵培养基接入8公斤地衣芽孢杆菌BLc株菌液，脱脂奶粉加入量是沉淀物重量的1%，固形物含量为10 15%，β -环糊精添加量是沉淀物重量的5%。实施例3
与实施例1基本相同，所不同的只是种子培养基由800克可溶性淀粉、400克明胶、60 克NaCl、3克MnSCV混合后，加水至总重10000克配制而成；发酵培养基由10公斤浒苔干粉、 4公斤酵母浸膏、0. 5公斤NaCUO. 6公斤K2HPO4 · 3H2 O、O. 03公斤NaH2PO4混合后，加水至总重100公斤配制而成；在发酵培养基接入12公斤地衣芽孢杆菌BLc株菌液，脱脂奶粉加入量是沉淀物重量的5%，固形物含量为20 25%，β -环糊精添加量是沉淀物重量的8%。实施例4
与实施例1基本相同，所不同的只是种子培养基中600克蔗糖由550克葡萄糖替代， 300克酪蛋白由250克大豆蛋白替代。实施例5
与实放例1基本相同，所不同的只是种子培养基中600克蔗糖由700克β-环糊精替代，300克酪蛋白由350克牛肉膏替代，摇床培养由发酵罐培养替代。应用例
取ICR小鼠60只，雌雄比1 :2，随机分成5组，每组12只，称各组体重，即空白对照组(灌给，高脂模型组，低剂量组、高剂量组，阳性对照组。除空白对照组(喂基础饲料)外，其它各组均饲喂的是高脂饲料(20 %猪油、2 %胆固醇、0.2 %胆酸盐、0.1 %丙基硫氧嘧啶)。 低剂量组按小鼠体重的0.1 mL/10g剂量每天一次用实施例1的降血脂发酵物灌胃，高剂量组比低剂量组增加一倍用量，阳性对照组按小鼠体重的0.1 mL/10g剂量每天一次用市售螺旋藻灌胃，空白组和高脂模型组按小鼠体重的0.1 mL/10g剂量每天一次用清水灌胃， 每日定时投料灌胃，且自由饮水；灌胃4周，称各组体重，禁食不禁水12 h后，眼球取血，37 °C水域30 min后离心(3000 r/min、15 min)分离血清，测血清中胆固醇(TC)、甘油三酯 (TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)；同时解剖内脏，摘取肝脏、腹脂称各组重。分别得到如表1和表2所示的结果。
表1 各组小鼠的血脂的水平表
组别TC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)空白对照组2. 42±0. 630. 90±0. 470. 46±0. 031. 88±0. 47高脂模型组3. 56 ±0. 591. 89±0. 321. 15±0. 101. 15±0. 46低剂量组2. 92±0. 411. 09±0. 420. 48±0. 181. 98±0. 60高剂量组2. 86 ±0. 341. 10±0. 410. 40±0. 262. 00±0. 37阳性对照组2. 61±0. 741. 35±0. 450. 58±0. 252. 05±0. 57
从表1中可以看出低剂量组、高剂量组、阳性对照组的各血脂水平都较高脂模型组为低，说明本发明的降血脂发酵物与螺旋藻一样具有降低血脂的作用。
表2 各组小鼠的体重增长率肝指数和脂肪系数的水平表
组别体重增长率(％)肝系数(％)脂肪系数(％)空白对照组31. 71±6. 405. 87±0. 661. 58±0. 41高脂模型组36. 76±3. 624. 90 ±0. 243. 26±0. 52低剂量组32. 67±3. 935. 24±0. 272. 57±0. 34高剂量组31. 09±4. 035. 31±0. 392. 38±0. 70阳性对照组33. 31±3. 855. 23±0. 462. 70±0. 51
其中肝系数为小鼠肝脏重量和体重之比，脂肪系数为鼠体内的腹脂和体重之比；从表 2中可以看出服用本发明的低剂量组和高剂量组与空白对照组体重接近，明显低于高脂模型组，也低于阳性对照组，说明未显肥胖；服用本发明的低剂量组和高剂量组与阳性对照组的肝系数和脂肪系数接近，而肝系数明显大于高脂模型组，脂肪系数明显小于高脂模型组， 说明本发明与螺旋藻一样具有降低血脂和脂肪的作用，可以减肥。
我们临床研究也发现，服用本发明的降血脂益生菌剂，TC、TG都有显著降低，而 HDL-C显著升高、LDL-C显著下降(P <0.01)，并存在明显的量效关系。发酵后沉淀物中主要成分为活菌和经菌株降解后的浒苔产物，降血脂益生菌剂中活菌以内生孢子形式存在。 服用后孢子进入肠道，在肠道上部能迅速复活并分泌活性很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶， 有助于降解复杂的碳水化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多种物质，同时通过生物氧化消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，肠道原籍优势菌大多属厌氧菌，而有害菌和外来菌多为需氧菌，因而有利于维持肠道生态平衡。浒苔降解产物中不仅含有动物必需的各种营养物质，营养均衡，而且还含有多糖、萜类和留体等多种生物活性物质，具有降血脂抗、氧化及预防脂肪肝的作用。
权利要求
1.一种降血脂益生菌剂的制备方法，其特征在于包括下述步骤a、种子培养按重量百分份5 8%的碳源、2 4 %的氮源、0. 3 0. 6 %的NaCl、 0. 001 0. 003 %的MnSO4,余量为水，混合后搅拌均勻配成种子培养基，所述碳源为蔗糖、 麦芽糖、β-环糊精、葡萄糖或可溶性淀粉，所述氮源为酪蛋白、酵母浸膏、大豆蛋白、明胶或牛肉膏，然后在所述种子培养基中接入地衣芽孢杆菌BLc株，该地衣芽孢杆菌BLc株的保藏号为CGMCC No :4324, 37°C下培养8 10小时得到地衣芽孢杆菌BLc株菌液；b、发酵培养基按重量百分份4 10%的浒苔干粉、1 4 %的酵母浸膏，0. 1 0. 5 % 的 NaCl, 0. 2 0. 6 % 的 K2HPO4 · 3H2 0、0. 01 0. 03 % 的 NaH2PO4,余量为水，混合后用 Na2CO3调pH值为6 7，搅拌均勻配成发酵培养基；C、接种在所述发酵培养基中接入所述地衣芽孢杆菌BLc株菌液，所述地衣芽孢杆菌BLc株菌液的接入重量是所述发酵培养基重量的8 12 %，每毫升所述地衣芽孢杆菌BLc 株菌液的活菌数为5 X IO5 5 X IO7个；d、发酵37°C室温，120r/min摇床或发酵罐上培养36 40h，静置沉淀、离心得到沉淀物；e、喷雾干燥在所述沉淀物加入脱脂奶粉均质，用无菌水稀释成固形物含量为10 25% (W/V)，再添加β-环糊精均勻混合，在进风温度为100 120°C，出风温度为80 100°C，进料速度8 lOmL/min条件下喷雾干燥，得到降血脂益生菌剂，所述脱脂奶粉加入重量是所述沉淀物重量的1 5%，所述β -环糊精添加重量是所述沉淀物重量的5 8%。
2.如权利要求1所述的一种降血脂益生菌剂的制备方法，其特征在于所述种子培养基由6 %的蔗糖、3 %的酪蛋白、0.5 %&NaCl、0. 002 %的MnSO4,余量为水配制而成。
3.如权利要求1所述的一种降血脂益生菌剂的制备方法，其特征在于所述发酵培养基由 8 % 的浒苔干粉、3 % 的酵母浸膏，0. 3% 的NaCl，0. 4 %&Κ2ΗΡ04·3Η2 0,0. 02 % 的NaH2PO4, 余量为水配制而成。
4.如权利要求1所述的一种降血脂益生菌剂的制备方法，其特征在于所述地衣芽孢杆菌BLc株菌液的接入重量是所述发酵培养基重量的10 %。
全文摘要
本发明公开了一种降血脂益生菌剂的制备方法，通过种子培养将地衣芽孢杆菌BLc株活化和扩大培养，再将扩大培养的地衣芽孢杆菌BLc株接入发酵培养基中，发酵培养基中NaCl、K2HPO4·3H2O、和NaH2PO4具有促进BLc株的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等各种酶的分泌和提高活性的作用，将培养基的pH控制在6～7可提高酶的活性，使浒苔降解，并含有大量的地衣芽孢杆菌BLc株孢子体，喷雾干燥孢子体暂时失活，食用后进入胃肠复活并分泌各种酶，促进胃肠食物分解，将胆固醇、脂肪等分解，同时能拮抗肠道致病菌，而浒苔降解产物具有降血脂、抗脂质过氧化及预防脂肪肝的作用；因此本发明一种原料成本较低、制备方法简单、对胃肠功能有促进作用，可降低血脂的降血脂益生菌剂的制备方法。
文档编号A61K35/74GK102166015SQ20111007249
公开日2011年8月31日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年3月25日
发明者徐嘉杰, 苏秀榕, 高翔 申请人:宁波大学