专利名称：一种含有吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提取物、制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种含有吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提取物制备方法，本发明还包括本发明的提取物在镇痛方面的应用。
背景技术：
吴茱萸碱(evodiamine, EV0)和吴茱萸次碱(rutaecarpine, RUT)是中药吴茱萸的主要活性成分，其具有降压、舒血管、抗过敏、抗炎、镇痛等作用。EVO和RUT的VR1激动作用，可促进神经递质(CGRP、P物质等)的合成和释放，试验证实高剂量的EVO能使小鼠离体回肠神经元脱敏发挥镇痛作用，推測EVO的镇痛机制可能与辣椒素类似，通过与外周感觉神经传入纤维上的VR1结合，激活与之偶联的膜离子通道，使Ca2+通道开放，胞质中Ca2+浓度升高，兴奋感觉神经，促进神经元及其纤维释放神经递质，进而使其从外周和中枢神经细胞中逐渐耗竭排空，阻断疼痛的传导，从而发挥镇痛作用。除了上述的镇痛机制，EVO与RUT还能下调环氧合酶_2 (C0X-2)的表达或者抑制C0X-2的活性，抑制炎性介质的释放，缓解炎性疼痛。因此，EVO与RUT可能是ー类针对多靶点的镇痛药物。中国专利CN 1931271A专利提供了一种吴茱萸提取物及其制备方法、药物组合物和用途，但其制备方法不包含且不能推断出本发明提取物的制备方法。
发明内容
本发明提供ー种含有吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提取物制备方法。本发明还发现本发明的含有吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提取物具有镇痛作用，为此，本发明提供ー种含有吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取物的医药新用途。本发明的含有吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提取物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱比例在
1-10 :1-5范围内。上述比例优选提取物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的比例为I. 3 1-1.8 I。本发明的含有吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提取物纯度在50%以上。本发明提取物从天然药物例如芸香科植物吴茱萸、疏毛吴茱萸和石虎等或其炮制品中提取获得。EVO和RUT是ー类极度难溶的化合物，几乎不溶于水和多数有机溶剤，ロ服吸收困难，我们的研究表明灌胃给予SD大鼠500mg kg—1的EVO単体，血药浓度峰值(Cmax)为49. 0± 19. Ong !!!じ1，生物利用度仅为0.1% o灌胃给予SD大鼠40mgぜ的RUT単体，血药浓度值低于最低检测限(2ng じ1)。而在Wistar品系的大鼠(自发性高血压大鼠)连续18天灌胃给予40mg *kg_1的RUT单体,最后一次给药后30min的血药浓度仅为2. 4±3ng じ1。因而，寻找更有效的EVO和RUT给药形式具有重要意义。本研究室发现特定比例的提取物较化学合成単体能明显改善EVO和RUT的吸收，増加二者的生物利用度，且呈现纯度依赖性。本发明的提取物优选制备方法如下
A、药材提取将吴茱萸属原料(药材或炮制品)用こ醇溶液(含体积百分含量(下同)60% -90%的こ醇)、こ醇、甲醇等有机溶剂提取，得到提取液。B、分段水 沉将上述提取液或浓缩后的提取液加入水后使醇的浓度下降并不低于33%，后离心取沉淀；C、精制将B所得的沉淀用醇重結晶，离心收集沉淀干燥后，即得不同纯度的吴茱萸碱和吴茱萸次碱的组合物。本发明的提取物可用于镇痛，治疗的疼痛包括糖尿病性神经疼痛、腰背痛、慢性肌肉骨骼痛、骨关节炎或类风湿性关节炎等，但不限于此。本发明提取物的制备方法エ艺简单可控，成本低；可通过控制エ艺因素制备不同纯度提取物；生产过程无污染，具有良好的生产和开发价值。
图I是不同剂量吴茱萸提取物乳膏对不同时相小鼠舔后足累计时间的影响(均数土标准差，n = 8)，*P < 0. 05 ;#P < 0. Olv. s 空白基质组；图2是大鼠ロ服三种纯度吴茱萸提取物后EVO的药时曲线(均数土标准差，n =6)；图3是大鼠ロ服三种纯度吴茱萸提取物后RUT的药时曲线(均数土标准差，n =6)；图4是大鼠ロ服六种比例混合物后EVO的药时曲线(均数土标准差，n = 6)；图5是大鼠ロ服六种比例混合物后RUT的药时曲线(均数土标准差，n = 6)；
具体实施例方式以下通过实施例进ー步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例I吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取物的制备A、提取(A)将吴茱萸属原料(芸香科植物吴茱萸的干燥近成熟果实)按原料与60%こ醇溶液的体积分数比为I : 10-12向原料中加入60%こ醇溶液，然后将两者的混合物热至70-100°C，保温3小时后，滤渣取液。(B)按所述吴茱萸属原料与60%こ醇溶液的体积分数比为I : 8-10向A步(A)滤出的渣中加入60%こ醇溶液，并将两者混合物加热至70-100°C，保温3小时后，滤渣取液。(C)按所述吴茱萸属原料与60%こ醇溶液的体积分数比为I : 8-10向A步⑶滤出的渣中加入60%こ醇溶液，并将两者混合物加热至70-100°C，保温3小时后，滤渣取液。将分别通过所述各A步(A)、(B)、(C)制取的液体混合一起后减压浓缩，直至其中重量与所述原料重量之比为I : 1-10为止。B、分段水沉浓缩后的提取物离心收集沉淀，按沉淀与90%こ醇重量比为I : 15-20向沉淀中加90%こ醇溶解，再次提取。将提取液离心弃去沉淀，按上清液与水的体积分数比为I 0.5向上清液中加入水稀释こ醇液，使こ醇终浓度为60%，离心弃去沉淀；按上清液与水的体积分数比为I : 0. 3向上清液中加入水稀释こ醇液，使こ醇终浓度为45%，离心取沉淀(a);按上清液与水的体积分数比为I : 0. 3向上清液中加入水稀释こ醇液，使こ醇终浓度为33%，离心取沉淀(b);按上清液与水的体积分数比为I : 0.3向上清液中加入水稀释こ醇液，使こ醇终浓度为25%，离心取沉淀(c)。C、精制将B所得的沉淀(a，b，c)分别用1_10倍量的甲醇重結晶，离心收集沉淀干燥后，即得三种纯度的吴茱萸提取物，高、中、低纯度分别为80%、49%和16%，EV0和RUT的比例为 I. 3 I。
实施例2不同纯度提取物的大鼠体内药代动力学比较将实施例I方法获得的高、中、低纯度吴茱萸提取物分别混悬于0. 5% CMC-Na溶液中，制成混悬液。18只健康SD大鼠，实验前禁食12h，不禁水，灌胃给予高、中、低纯度吴茱萸提取物混悬液，剂量为40mg kg-1 (EVO)，3Img kg-1 (RUT)。分别在灌胃后0. 25,0. 5、0. 75、1、1. 5、2、2. 5、3、4h于眼眶后静脉丛取血0. 5ml，置于肝素抗凝的塑料离心管中，血样即刻采用液液萃取法处理，进样分析，结果见图2、3。高纯度组中EVO的Cmax是中纯度组的2. I倍，低纯度组的3. 8倍，而高纯度组中RUT的Cmax是中纯度组的2. 3倍，低纯度组的9. 4倍。统计分析后，三组EVO和RUT的Cmax差异有统计学意义(P < 0. 01)。EVO和RUT的AUCch4也随纯度的提高而升高，低纯度组明显低于高、中纯度组(P < 0. 01)。提示提取物中杂质可能延缓或阻碍EVO和RUT的吸收，其阻碍作用強弱与杂质含量可能存在依赖关系。提取物的纯度与其体内吸收的情况成正比，纯度越高，吸收越好，进而药效越強。实施例3不同比例EVO和RUT的大鼠体内药代动力学比较为证实EVO和RUT比例对药物体内吸收的影响，将EVO和RUT的化学合成品以20 I、10 1、5 I、I I、I 5的比例混合，并分别混悬于0. 5% CMC-Naこ醇溶液中，制成混悬液。30只健康SD大鼠，实验前禁食12h，不禁水，灌胃给予上述混悬液。分别在灌胃后0. 25,0. 5,0. 75、I、I. 5、2、2. 5、3、4h于眼眶后静脉丛取血0. 5ml，置于肝素抗凝的塑料离心管中，血样即刻采用液液萃取法处理，进样分析，结果见图4、5。采用CMC-Naこ醇溶液增加药物的吸收以体现EVO和RUT比例对大鼠在体吸收的影响。试验结果显示，EV0/RUT比例在10 : I I : 5之间的吸收强于20 : I或I : 10，推測原因可能为适宜的比例有助于EVO和RUT以无定形的晶型存在，而无定型药物常具有较高的溶解度和生物利用度。10 : I I : 5的EV0/RUT比例接近天然药物中两者的天然比例。本发明的提取物具有镇痛作用，以下通过实验数据证明本发明的医药用途。实验采用常规手段，含有吴茱萸碱和吴茱萸次碱的组合物使用本发明实施例I方法得到。药理学试验观察了本组合物治疗三种不同原因引起的疼痛模型的药理学效应。(I)吴茱萸提取物用于治疗福尔马林诱导的小鼠疼痛本实验取昆明小鼠，雌雄各半，随机分为空白基质组、扶他林乳胶阳性对照组、辣椒碱软膏阳性对照组、受试药(吴茱萸提取物乳膏)低、中、高剂量乳膏组6个组，右后足均匀涂布上述药物，给药120min后各鼠右后足筋膜下注射2. 5%福尔马林生理盐水溶液20yL，观察I相(0-5min)，II相(20_35min)小鼠舔后足累积时间作为评估治疗疼痛指标，比较各组间差异。实验选用扶他林乳胶和辣椒碱软膏两种阳性药，其中，扶他林乳胶(诺华制药，I. 16%)通过抑制COX的活性发挥解热镇痛作用，而辣椒碱软膏(长春普华制药，0. 025% )则能激动辣椒素受体使感觉神经脱敏来发挥镇痛作用，两种市售药物的镇痛机制与受试药相同，因而选择上述两种市售外用制剂作为阳性对照。其中低、中、高剂量乳膏选用本发明的组合物制备方法，获得的提取物吴茱萸碱和吴茱萸次碱比例为I. 8 1，含量为71.0%。低、中、高剂量乳膏含药量分别为0. 1^.0.2%和 0. 4%。实验数据采用SPSS17. 0统计分析软件，以独立样本t检验方法进行分析，结果见图I。
结果显示，与空白基质对照组比较，0. 1% -0.4%的吴茱萸提取物乳膏及0.025%辣椒碱软膏阳性组小鼠在给药后5min内舔后足累计时间显著減少，提示药物对福尔马林所致的C型纤维过度放电引起的疼痛有良好的改善作用。高剂量乳膏与扶他林乳胶还能显著降低20-35min内舔后足累计时间，表明提取物乳膏还对炎性疼痛有效。总言之受试药对该模型两相疼痛均有显著治疗作用，并且其效应具有剂量依赖性。(2)吴茱萸提取物用于热刺激疼痛模型治疗取雌性昆明小鼠，随机分成空白基质组、扶他林乳胶阳性对照组、辣椒碱软膏阳性对照组、受试药低、中、高剂量乳膏组6个组，置于55±0. 5°C恒温池中，以小鼠舔后足为疼痛反应指标，记录产生反应的潜伏期。选取基础痛阈在5-25s之间的小鼠(从将小鼠置于热板上至小鼠开始舔后足的时间作为基础痛阈)，右脚均匀涂布相同量的上述药物，測量用药后不同时间点小鼠痛阈，比较各组间差异。其中低、中、高剂量乳膏选用本发明的组合物制备方法，获得的提取物吴茱萸碱和吴茱萸次碱比例为I. 8 1，含量为71.0%。低、中、高剂量乳膏含药量分别为0. 1^.0.2%和 0. 4%。实验数据采用SPSS17. 0统计分析软件，以独立样本t检验方法进行分析，结果见表I。表I不同剂量吴茱萸提取物乳膏对热刺激痛阈值的影响(均数土标准差，n = 6)
权利要求
1.一种含有吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提取物，该提取物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的比例在1-10 1-5范围内。
2.根据权利要求I所述的提取物，其特征在于吴茱萸碱和吴茱萸次碱的比例为I.3 1—1.8 I。
3.根据权利要求I或者2所述的提取物，其特征在于含茱萸碱和吴茱萸次碱的纯度在50%以上。
4.制备权利要求I至3所述提取物的方法， A、药材提取 将吴茱萸属原料用体积百分浓度为60% -90%乙醇溶液、乙醇或甲醇溶剂提取，得到提取液； B、分段水沉 将上述提取液或浓缩后的提取液中加入水使醇的浓度降低但大于33%，离心后取沉淀； C、精制 将B所得的沉淀用醇重结晶，离心收集沉淀干燥后，即得含吴茱萸碱和吴茱萸次碱的组合物。
5.权利要求I至3所述的组合物在制备治疗镇痛药物中的应用。
6.根据权利要求5所说的用途，其特征在于所说的镇痛是包括糖尿病性神经疼痛、腰背痛、慢性肌肉骨骼痛、骨关节炎或类风湿性关节炎疼痛。
全文摘要
本发明涉及一种含有吴茱萸碱EVO和吴茱萸次碱RUT的提取物、制备方法，本发明还包括本发明提取物的医药用途。本发明提供的含有吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提取物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的比例在1-10∶1-5范围内。本发明发现特定比例的提取物较化学合成单体能明显改善EVO和RUT的吸收，增加二者的生物利用度，且呈现纯度依赖性。本发明的提取物可用于镇痛。
文档编号A61K36/756GK102755425SQ20111011116
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者丁劲松, 周应军, 徐世希, 罗芳梅, 胡长平, 陈菲 申请人:长沙晶易医药科技有限公司