专利名称：吴茱萸碱衍生物单克隆抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体，尤其是涉及一种吴茱萸碱衍生物单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸、石虎及梳毛吴茱萸的干燥近成熟果实，具有驱寒镇痛、止呕、止湾和舒张血管的功效。吴茱萸碱(evodiamine, EV0)是吴茱萸最重要生物碱成分之一，具有多种生物学活性，其中抗肿瘤以及抗炎特性备受关注。研究表明吴茱萸碱可通过阻滞多种肿瘤细胞(如人甲状腺癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、结肠癌等)的细胞周期、诱导细胞凋亡以及抑制血管生成等途径，从而达到抗肿瘤的功效。此外，EVO也具有明 确的抗炎活性，主要表现在以下几个方面①抑制巨噬细胞前列腺素E2和一氧化氮(NO)的产生这一方面是其拮抗核因子- κ B(NF-k B)活性导致环氧合酶2、诱导性NO合成酶(iNOS)表达受抑的结果；另一方面与其阻断Akt和p70S6K的磷酸化进而抑制缺氧诱导因子-I a (HIF-1 α )的翻译有关。②抑制神经小胶质细胞NO的产生该作用通过iNOS依赖途径而介导。③抑制中性粒细胞活性氧簇的产生在佛波酯和N-甲酰-甲二磺酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)刺激的中性粒细胞中，EVO可通过抑制NADPH氧化酶的活性从而使活性氧簇产生减少。由此可见，EVO具备明确的抗肿瘤和抗炎活性，但是EVO的具体作用机理至今尚未完全阐明，它是如何进入细胞，在胞内具体的作用靶点等问题有待进一步研究，而EVO单克隆抗体的缺乏严重制约了该方面的研究进展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种杂交瘤细胞株及其分泌的吴茱萸碱衍生物单克隆抗体。具体地，分泌吴茱萸碱衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO C201201，其培养物名称及注明的鉴别特征杂交瘤细胞株081-01，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址湖北省武汉市武汉大学，邮编430072。本发明所述的吴茱萸碱衍生物单克隆抗体，由上述的保藏号为CCTCC NO C201201的杂交瘤细胞株产生。其为Ig Gl, K型。本发明还提供上述的吴茱萸碱衍生物单克隆抗体的制备方法，其主要包含步骤I)将吴茱萸碱衍生物与BSA交联，获得抗原吴茱萸碱衍生物-BSA ；所述吴茱萸碱衍生物(化学名为10-胺基-14-甲基-8，13，13b，14-四氢-7H-吲哚并[2’ 3’ 3，4]吡啶并[2，l-b]喹唑啉-5-酮)的结构式如下H /
式I2)用步骤I)获得的抗原与福氏不完全佐剂乳化，免疫小鼠；3)从免疫小鼠中获取免疫脾细胞,然后与骨髓瘤细胞融合,筛选效价高的杂交瘤细胞；4)对小鼠注射步骤3)所述杂交瘤细胞的悬液，诱导腹水产生，检测腹水效价，分离杂交瘤细胞分泌的抗体，获得所述吴茱萸碱衍生物单克隆抗体。其中，步骤4)中通过亲和层析纯化所述吴茱萸碱衍生物单克隆抗体。上述的方法，进一步包括步骤用单克隆抗体Ig亚类鉴定法鉴定步骤4)所述吴茱 萸碱衍生物单克隆抗体的类型。本发明所述的吴茱萸碱衍生物单克隆抗体可以用于检测吴茱萸碱衍生物在细胞内的分布中。具体的检测方法包括步骤将小鼠腹腔巨噬细胞接种于已放置玻片的24孔板中，孵育过夜，向其中加入吴茱萸碱衍生物溶液使其作用，PBS冲洗后用多聚甲醛固定，然后通过Triton-100打孔，血清封闭后，加入吴茱萸碱衍生物单克隆抗体，孵育过夜，再加入荧光标记的二抗，染核后封片检测。本发明还提供一种ELISA试剂盒，其包括上述的吴茱萸碱衍生物的标准品、吴茱萸碱衍生物单克隆抗体，预包被抗原吴茱萸碱衍生物-OVA的96孔板；酶标羊抗鼠二抗，TMB显色液，终止液。本发明所述的ELISA试剂盒可以用于检测吴茱萸碱衍生物的含量。本发明提供一种吴茱萸碱衍生物单克隆抗体、及其制备方法和应用，所述抗体是针对小分子化合物吴茱萸碱衍生物的单克隆抗体，是由人工抗原吴茱萸碱衍生物-牛血清白蛋白(BSA)偶联物免疫的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经杂交瘤筛选后,通过注入同系小鼠腹腔诱生腹水分离获得吴茱萸碱衍生物单克隆抗体，利用该方法能够获得大量纯的吴茱萸碱衍生物单克隆抗体，可将该吴茱萸碱衍生物抗体制备成吴茱萸碱衍生物的酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒，用于检测吴茱萸碱衍生物的含量，此外该抗体还可用于细胞免疫荧光检测吴茱萸碱衍生物在细胞内的分布情况。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图I为A220-吴茱萸碱衍生物浓度标准曲线。横坐标为吴茱萸碱衍生物的浓度(μ g/ml),纵坐标为220nm波长下光吸收值。图2为吴茱萸碱衍生物与其抗体亲和力图谱。图3为吴茱萸碱衍生物抗体的竞争ELISA标准曲线。横坐标为吴茱萸碱衍生物浓度的对数值，纵坐标为吸光度比值AAtl (A为添加了吴茱萸碱衍生物的吸光值，AO为不添加吴茱萸碱衍生物的吸光值)。图4A、4B、4C为小鼠腹腔巨噬细胞内吴茱萸碱衍生物的免疫荧光图谱。其中箭头所在位置(红色荧光所在位置)即为吴茱萸碱衍生物在细胞内的分布。其中图4A为使用Cy3染料的荧光图，图4B为使用双苯咪唑类染料Hoechst 33258染料染色的细胞核的荧光图，图4C为Merge (突光重叠图)。
具体实施例方式以下实施例将结合数据对本发明作进一步说明。实施例I :吴茱萸碱衍生物(化学名为10_胺基-14-甲基-8，13，13b，14-四氢-7H-吲哚并[2’ 3’ 3，4]吡啶并[2，l-b]喹唑啉-5-酮)的制备 步骤I :反应式如下
权利要求
1.一种分泌吴茱萸碱衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NOC201201。
2.一种吴茱萸碱衍生物单克隆抗体，其特征在于，由保藏号为CCTCC NO C201201的杂交瘤细胞株产生。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为IgGl，K型。
4.一种权利要求1-3任一项所述的吴茱萸碱衍生物单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包含步骤 1)将吴茱萸碱衍生物与BSA交联，获得抗原吴茱萸碱衍生物-BSA； 其中所述吴茱萸碱衍生物的结构式如下H / 式I 2)用步骤I)获得的抗原与福氏不完全佐剂乳化，免疫小鼠； 3)从免疫小鼠中获取免疫脾细胞，然后与骨髓瘤细胞融合，筛选效价高的杂交瘤细胞； 4)对小鼠注射步骤3)所述杂交瘤细胞的悬液，诱导腹水产生，检测腹水效价，分离杂交瘤细胞分泌的抗体，获得所述吴茱萸碱衍生物单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4)中通过亲和层析纯化所述吴茱萸碱衍生物单克隆抗体。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进一步包括步骤用单克隆抗体Ig亚类鉴定法鉴定步骤4)所述吴茱萸碱衍生物单克隆抗体的类型。
7.权利要求4所述的吴茱萸碱衍生物单克隆抗体在检测吴茱萸碱衍生物在细胞内的分布中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，吴茱萸碱衍生物单克隆抗体检测吴茱萸碱衍生物在细胞内的分布的方法包括步骤将小鼠腹腔巨噬细胞接种于已放置玻片的24孔板中，孵育过夜，向其中加入吴茱萸碱衍生物溶液使其作用，PBS冲洗后用多聚甲醛固定，然后通过Triton-IOO打孔，血清封闭后，加入吴茱萸碱衍生物单克隆抗体，孵育过夜，再加入荧光标记的二抗，染核后封片检测。
9.一种ELISA试剂盒，其包括权利要求4所述的吴茱萸碱衍生物的标准品、吴茱萸碱衍生物单克隆抗体，预包被抗原吴茱萸碱衍生物-卵清蛋白的96孔板；酶标羊抗鼠二抗，TMB显色液，终止液。
10.权利要求9所述的ELISA试剂盒在检测吴茱萸碱衍生物含量中的应用。
全文摘要
本发明提供一种吴茱萸碱衍生物单克隆抗体及其制备方法和应用，所述吴茱萸碱衍生物单克隆抗体，由保藏号为CCTCC NOC201201的杂交瘤细胞株产生。所述吴茱萸碱衍生物单克隆抗体为Ig G1，κ型。本发明所述的吴茱萸碱衍生物单克隆抗体，可制备成吴茱萸碱衍生物的酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒，用于检测吴茱萸碱衍生物的含量，此外该抗体还可用于细胞免疫荧光检测吴茱萸碱衍生物在细胞内的分布情况。
文档编号C07K16/44GK102660509SQ20121012622
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者张醇, 杨雪, 梁华平, 范霞 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院