专利名称：异黄酮类化合物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种异黄酮类化合物的用途，尤其涉及一种毛蕊异黄酮在制备抗病毒药物中的用途。
背景技术：
近年来，临床实践证明黄芪在治疗病毒性心肌炎中具有显著效果。但其中的活性成分尚未完全清楚。有研究团队就黄芪的有效部位和主要有效成分对抗柯萨奇病毒及治疗病毒性心肌炎的关系进行了较深入的多年研究，并发现毛蕊异黄酮-7-0-β -D-吡喃葡萄糖苷(以下简称毛蕊异黄酮苷)在柯萨奇病毒(Coxsackie Virus B3,CVB3)感染的细胞和动物模型上具有显著的抗病毒活性(Biol. Pharm. Bull. 2009,68-73 ；CN1813711B)。体内、 外实验结果均表明，毛蕊异黄酮苷能显著抑制CVB3在宿主细胞上的复制，减少心肌天冬氨酸转氨酶(Aspartate Amino Transferase,AST)禾口乳酸脱S酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)的释放；显著提高CVB3感染BALB/c鼠的生存率，降低心肌病毒滴度，减轻心肌病理改变，改善左室心功能；抗病毒机理研究提示，毛蕊异黄酮苷通过抑制CVB3-VP1在心肌中的表达、抑制TNF- α的分泌、调节T淋巴细胞亚群分化等环节来抑制病毒介导的免疫损伤，从而实现抑制CVB3和治疗病毒性心肌炎的综合药效。进一步研究发现，毛蕊异黄酮苷在抑制 HIV病毒引起的细胞病理效应方面具有较高的治疗指数，表明该化合物也很有可能成为潜在的抗 HIV 药物(Chem. Nat. Compd+. 2009，282-285 ；CN101590072B)。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种异黄酮类化合物，作为活性成分在制备抗病毒药物中应用。本发明的另一个目的在于提供一种异黄酮类化合物，作为活性成分在制备抗柯萨奇病毒药物中应用。本发明的又一个目的在于提供一种异黄酮类化合物，作为活性成分在制备抗HIV 病毒药物中应用。本发明所称的“异黄酮类化合物”是指异黄酮类化合物以及所成的盐，如钠盐和
Φ^Ρ 盐 ο本发明所称的“毛蕊异黄酮”是指毛蕊异黄酮以及所成的盐，如钠盐和钾盐。本发明所称的“病毒”是指由一个核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质构成的非细胞形态的营寄生生活的生命体，如但不仅限于，痘病毒类、疱疹病毒类、腺病毒类、乳头瘤病毒类、细小病毒类、嗜肝DNA病毒类、逆转录病毒类、呼肠孤病毒类、博尔纳病毒类和弹状病毒类等。本发明所称的“病毒性疾病”是指由病毒感染引起的偏离生物体正常形态与功能的状态。本发明所称的“柯萨奇病毒”是指一种肠病毒，分为A和B两类，经呼吸道和消化道感染生物体，感染后会出现发热、打喷嚏和咳嗽等感冒症状。妊娠期感染可引起非麻痹性脊髓灰质炎性病变，并致胎儿宫内感染和致畸。所称的“柯萨奇病毒性疾病”是指由柯萨奇病毒引起的多种病毒性疾病，如但不仅限于，病毒性心肌炎、流行性胸痛、无菌性脑炎、脑膜炎、克山病和病毒性癫痫等。本发明所称的“免疫缺陷病毒”是指一种能攻击生物体免疫系统的病毒，属于反转录病毒科，慢病毒属，如但不仅限于，猴免疫缺陷病毒(Simian immunodef iciencyvirus, SIV)、猫免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus, FIV)、牛免疫缺陷病毒(Bovine immunodeficiency virus, BIV)禾口人免疫缺陷病毒(Human immunodef iciencyvirus, HIV)。 本发明免疫缺陷病毒尤其指HIV。现已证实HIV分为两型HIV-1型和HIV-2型，它们又有各自的亚型。它把人体免疫系统中最重要的T4淋巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破坏T4 淋巴细胞，从而破坏人的免疫系统，最终使免疫系统崩溃，使人体因丧失对各种疾病的抵抗能力而发病并死亡。这种病毒在地域内终生传染，使人体成为各种疾病的载体。HIV本身并不会引发任何疾病，而是当免疫系统被HIV破坏后，人体由于抵抗能力过低，丧失复制免疫细胞的机会，从而感染其他的疾病导致各种复合感染而死亡。所称的“HIV病毒性疾病” 是指由感染HIV病毒所导致的获得性免疫缺陷综合症症，即艾滋病，其临床症状表现如但不仅限于，食欲下降、厌食、恶心、呕吐、腹泻、头晕、头痛、反应迟钝、智力减退、精神异常、抽风、偏瘫、弥漫性丘疹、带状疱疹、口腔和咽部粘膜炎症及溃烂和多种恶性肿瘤。本发明所称的“生物体”或“患者”是指人、野生动物和家畜(Livestock)。野生动物为自然状态下未经人工驯化的动物。家畜是为了提供食物来源而人工饲养的动物，如 狗、猫、鼠、仓鼠、猪、兔、奶牛、水牛、公牛、绵羊、山羊、鹅和鸡等。给予治疗的“生物体”优先选择哺乳动物，尤其是人。本发明所称的“预防”是指在未被临床标准认定的疾病前，各种用于防止疾病发生或发展的手段或措施，包括医学、物理或化学的方法，以阻止和降低疾病各种症状的发生或发展。本发明所称的“治疗”是指为了阻止和降低疾病的发生或发展，使疾病病程的发展或加重得以抑制、遏制、减轻、改善、减缓、停止、延迟或反转，所描述的保持和/或用药时的疾病的、紊乱的或病理学状态的各种指标包括减轻或减少症状或并发症，或治愈或消除疾病、紊乱或状况。本发明所称的“药物”是指可以用于治疗疾病的单一化合物、多种化合物形成的组合物和中药材，或指以单一化合物为主要活性成分的组合物或制剂(formulation)，还指由多种化合物为活性成分的组合物或制剂。所称的“药物”不仅指根据一国之法律规定，通过其设立的行政机构审批并准予生产的产品，还指在为了获得通过审批和准予生产的过程中，所形成的含单一化合物为活性成分的各类物质形态。“形成”应理解为通过化学合成、生物转化或购买等途径获得。本发明所称的“制剂”是指含有本发明异黄酮类化合物的有利于给药 (drugdelivery)的剂型，如但不仅限于，水溶液注射剂、粉针剂、丸剂、散剂、片剂、贴剂、 栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂和控释剂等。这些药用辅料既可以是各种制剂中常规使用的，如但不仅限于，等渗剂、缓冲液、矫味剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂等；也可以是为了与所述物质相适应而选择使用的，如乳化剂、增溶剂、抑菌剂、止痛剂和抗氧剂等，这类辅料能有效提高组合物所含化合物的稳定性和溶解性或改变化合物的释放速率和吸收速率等，从而改善本发明化合物在生物体内的代谢，进而增强给药效果。此外，还可以为实现特定的给药目的或方式，如缓释给药、 控释给药和脉冲给药等，而使用的辅料，如但不仅限于，明胶、白蛋白、壳聚糖、聚醚和聚酯类高分子材料，如但不仅限于，聚乙二醇、聚氨酯、聚碳酸酯及其共聚物等。所称的“有利于给药”的主要表现有但不仅限于，提高治疗效果、提高生物利用度、降低毒副作用和提高患者顺应性等。本发明所称的“有效治疗剂量”指能减缓各种病理学意义上的症状而使用本发明化合物的量。本发明组合物的特定剂量需要根据具体的情况加以确定，如给药的方式、给药途径、给药时患者的状态以及在治疗时的病理学状况等。本发明提供的一种异黄酮类化合物为毛蕊异黄酮(Calycosin)，化学名称7， 3’ - 二羟基-4’ -甲氧基异黄酮，其结构式如式I所示。多种直接或间接的方法可以获得本发明异黄酮类化合物盐，如将毛蕊异黄酮溶于稀的氢氧化物溶液中，再经低温减压浓缩后即可得到毛蕊异黄酮盐。本发明所列举的方法是出于充分公开的需要，而进行的说明。本领域技术人员可以根据教科书和实验手册教导，以及通过必要的实验获得本发明异黄酮类化合物盐。所列举的获得异黄酮类化合物盐的方法不得限定本发明。有多种方法可以获取本发明毛蕊异黄酮，如但不仅限于，从中药材黄芪中提取、 分离和纯化(CN102079738A ；CN102030735A ；CN101775418A ；沈阳药科大学学报，2006， (11))；从上海中药标准化研究中心购买(CN101653438A)；从生物体代谢产物中提取、分离和纯化；化学全合成和生物催化和转化等。本发明所列举的各种制备方法应当理解为对实施本发明技术方案进行的必要公开，获得本发明毛蕊异黄酮的方法不得限定本发明。本发明毛蕊异黄酮可以作为唯一的或主要的活性成分用于制备预防或治疗病毒性疾病的药物，或与其它一种或多种具有抗病毒作用的化学物质或药物一并给予生物体。 这些化学物质如但不仅限于，毛蕊异黄酮苷、叠氮胸苷、双脱氧胞苷、双脱氧肌苷、双脱氧胸苷、苏拉明、三氮唑核苷、磷甲酸盐、α-干扰素、白细胞介-2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、二性霉素Β、5_氟胞嘧啶、脒康唑、氟康唑、头孢唑啉、头孢氨噻污、复达酸、环丙氟哌酸、先锋美他醇、万古霉素、环丙氟哌酸、乙胺丁醇、异烟胼、吡嗪酰胺、 多粘菌素B、庆大霉素、鬼白毒素、长春花碱、长春新碱和博莱霉素。这些药物如但不仅限于，齐多夫定(zidovudine，AZT)、地丹诺辛(didanosine，ddl)、扎西他宾(zalcitabine， ddC)、司他夫定(stavudine，d4T)、拉米夫定(lamivudine，3TC)、阿巴卡韦(abacavir， ABC)、乙曲西他槟(emtricitabine，FTC)、富马酸替诺夫福韦(tenofovir，TDF)、奈韦拉平 (nevirapine, NVP)、地拉韦定(delavirdine，DLV)、依非韦伦(efavirenz, EFV)、依曲韦润 (etravirine, TMC-125)、沙奎那韦(saquinavir，SQV)、茚地那韦(indinavir，IDV)、利托那韦(ritonavir，RTV)、奈非那韦(nelfinavir，NFV)、安普那韦(amprenavir，APV)、福司安普那韦(fosamprenavir，FMP)、洛匹那韦(lopinavir，LPV)、安扎那韦(atazanavir，ATV)、替派那韦(tipranavir，TIV)、达如那韦(darunavir，DRV)、恩夫韦肽(enfuvirtide，T-20)、麦瑞韦若克(maraviroc，MVC)、雷特格韦(raltegravir，MK-0518)、老鹳草、金银花、瓜蒌皮、 柴胡、香薷、石榴皮、甘草、木棉花、鸡血藤、红花、糯稻根、诃子、白花蛇舌草、菱角、银杏叶、 马齿苋、胡黄连、龙葵、全蝎和疫苗。所称的“一并给予生物体”是指本发明毛蕊异黄酮或与其它一种或多种具有抗病毒作用的化合物或药物混合后经单一的给药途径，如但不仅限于，口服(Oral)、鼻腔(Nasal)、(面)颊(Buccal)、透皮(Transdermal)、肺部(Pulmonal)、 阴道(Vaginal)、皮下(Subcutaneous)或静脉Gntravenous)给予生物体；或与其它一种或多种具有抗病毒作用的化学物质或药物分别经多种的给药途径给予生物体。本发明提供的毛蕊异黄酮在体外对柯萨奇病毒B族3型Nancy (CoxB3)具有明显的抑制作用，其半数抑制浓度(median inhibitory concentration, IC50)为 7· 94 μ g · πι Λ 治疗指数(therapeutic index，Tl)为5. 63。与毛蕊异黄酮苷相比，毛蕊异黄酮的治疗指数更高，具有显著的抗柯萨奇病毒活性，其抗CVB3病毒活性更显著。本发明提供的毛蕊异黄酮在体外对HIV-I诱导的合胞体的形成和pM抗原形成具有抑制作用，半数有效浓度(50% Effective Concentration, EC50)为 2. 20 μ g ·πι ΛΤΙ 值高于39. 60，具有显著的抗HIV病毒活性，其抗HIV-I型病毒的活性更显著。本发明提供的一种毛蕊异黄酮，在制备抗病毒药物中的应用。本发明提供的另一种毛蕊异黄酮，在制备预防或治疗病毒性疾病的药物中的应用。本发明提供的另一种毛蕊异黄酮，在制备抗柯萨奇病毒的药物中的应用。本发明提供的另一种毛蕊异黄酮，在制备抗HIV病毒的药物中的应用。本发明提供的另一种毛蕊异黄酮，在制备预防或治疗柯萨奇病毒性疾病的药物中的应用。本发明提供的另一种毛蕊异黄酮，在制备预防或治疗HIV病毒性疾病的药物中的应用。本发明技术方案实现的有益效果本发明提供的一种异黄酮类化合物为毛蕊异黄酮，对柯萨奇病毒具有明显的抗病毒活性。在体外对CoxB3病毒的IC50为7. 94 μ g · mL—1，TI为5. 63。与毛蕊异黄酮苷相比， 本发明毛蕊异黄酮对柯萨奇病毒的治疗指数更高，其抗柯萨奇病毒的活性更显著。本发明提供的毛蕊异黄酮，对HIV病毒具有明显的抗病毒活性。在体外对HIV-I诱导的合胞体的形成和PM抗原形成具有抑制作用，EC5tl为2. 20 μ g · mL—1，TI值高于39. 60， 具有显著的抗HIV病毒活性。作为毛蕊异黄酮苷(原形)的代谢产物，本发明毛蕊异黄酮比原形成分具有更强的抗病毒活性。在抑制艾滋病病毒(HIV)方面，毛蕊异黄酮的IC5tl值为4. 48μ g/mL，而原形成分的IC5tl值大于200 μ g/mL,相差44倍以上。在抑制柯萨奇病毒B3方面，毛蕊异黄酮的 IC50值为7. 94 μ g/mL,而原形成分的IC50值为251. 19 μ g/mL,相差32倍。本发明还提示毛蕊异黄酮苷可能主要是通过降解后的毛蕊异黄酮发挥其抗病毒作用。本发明提供的毛蕊异黄酮作为活性成分，用于制备抗病毒药物，用于制备预防或治疗病毒性疾病的药物。
图1为MTT法检测毛蕊异黄酮苷、大豆苷元和毛蕊异黄酮三种化合物对C8166细胞存活率影响；图例中，“1”表示毛蕊异黄酮苷，“2”表示大豆苷元，“3”表示毛蕊异黄酮；图2为毛蕊异黄酮苷、大豆苷元和毛蕊异黄酮三种化合物对HIV-Iiiib病毒在细胞 C8166复制中的合胞体抑制作用，结果显示为平均值士标准差(η = 6-9)；图例中，“1”表示毛蕊异黄酮苷，“ 2，，表示大豆苷元，“ 3 ”表示毛蕊异黄酮；图3为毛蕊异黄酮苷、大豆苷元和毛蕊异黄酮三种化合物对HIV-Iiiib病毒在细胞 C8166复制中的ρΜ抗原产生抑制作用，结果显示为平均值士标准差(η = 6-9)；图例中， “ 1，，表示毛蕊异黄酮苷，“ 2，，表示大豆苷元，“ 3 ”表示毛蕊异黄酮。
具体实施例方式以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自于西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。实施例1毛蕊异黄酮的制取收集给予毛蕊异黄酮苷灌胃的实验大鼠粪便500g，用5倍量的甲醇提取3次后， 合并所得的甲醇提取物，蒸干甲醇后，经101大孔树脂吸附。然后，先用30%乙醇对101大孔树脂进行洗脱，再用50%乙醇对101大孔树脂进行洗脱并收集馏分，最后用90%乙醇再生101大孔树脂。之后，所得馏分蒸干后，吸附于kphadex LH-20葡聚糖凝胶，并用乙醇洗脱，经薄层层析后将含有相同组分的洗脱液合并，获得A、B和C三份馏分，所得馏分B吸附于硅胶H60，经二氯甲烷-甲醇(100 1-5 1，体积比)洗脱液洗脱后，再经半制备液相色谱富集后，获得 47mg 毛蕊异黄酮(m/z :285[M+H]+;13C-WR(DMS0_d6，100MHz) δ (ppm) 174. 53(C-4)，162. 48(C-7)，157. 33(C-9)，152. 98 (C-2)，147.47 (C_4，)，146. 00(C_3，)， 127. 24 (C-5)，124. 68(C_1，)，123. 33 (C-3)，119. 65(C_6，)，116. 62 (C-10)，116. 42 (C-2 ‘)， 111.95 (C-5'),102.05 (C-8), 55. 65 (OMe)) 0馏分C经半制备液相色谱富集后，获得 23mg 大豆苷元(m/z :255 [M+H]+ ； 13C-WR(DMS0_d6，δ (ppm) :174. 64 (C-4)，162. 44 (C-7)， 157. 38 (C-9)，157. 12 (C-4‘ ),152.72(0-2),130.01(0-2' ),130. 01(C-6' ), 127. 23 (C-5), 123. 45(C-1，)，122. 50 (C-3)，116. 61 (C-10)，115. 05 (C_6)，114. 90 (C-3 ‘ )，114. 90 (C-5 ‘)， 102. 04(C-8))ο实施例2毛蕊异黄酮的制取将毛蕊异黄酮苷在酸性条件下用IM H2SO4水解后，经阴离子交换树脂 Amberlite(OF)分离，获得毛蕊异黄酮(m/z 285[M+H]+ ； 13C-WR(DMS0_d6，100MHz) δ (ppm) :174. 53 (C-4)，162. 48 (C-7)，157. 33 (C-9)，152. 98 (C-2)，147. 47 (C_4，)， 146. 00 (C-3 ‘ )，127. 24 (C-5)，124. 68(C_1，)，123. 33 (C-3)，119. 65(C_6，)，116. 62 (C-10)， 116. 42 (C-2，), 111. 95 (C-5‘ )，102. 05 (C-8), 55. 65 (OMe))
实施例3抗病毒活性试验1.培养液和培养基细胞培养液含10%胎牛血清，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品； DMEM(高糖)培养基，RPMI-1640和胎牛血清购自于美国Gibco公司。RPMI-1640完全培养基含有10%胎牛血清，L-谷氨酰胺2mM，HEPESlOmM, 50 μ M 2-巯基乙醇(购自于Bio-Rad)，100，000IU青霉素和100 μ g/ml链霉素。2.细胞和病毒人喉癌上皮细胞(Hep-2)，购自中国协和医科大学基础所细胞中心。柯萨奇病毒B 族3型(CoxB;3)Nancy株，由中国中医科学院中药研究所崔晓兰实验室常规传代，半数组织培养感染剂量(50% Tissue culture infective dose，TCID5tl)为 10-6. 5，_80°C冰箱保存。 本实施例所涉及的柯萨奇病毒B-3型菌株(中国典型培养物保藏中心保藏编号为GDV015)， 属小核糖核酸病毒科，肠道病毒属。人T淋巴细胞系C8166、HIV-1实验株HIV-Iiiib均由英国 Medical Research Council,AIDS Reagent Project 惠赠。所有细胞和病毒均以含 10% 胎牛血清的RPMI-1640完全培养基进行培养。按常规方法制备HIV-Iiiib，滴定并计算出病毒的TCID5tlt5病毒贮存液分装后，置_70°C保存。细胞和病毒按常规方法冻存和复苏。3.对H印-2细胞的毒性试验分别取毛蕊异黄酮苷、大豆苷元和毛蕊异黄酮各10mg，实验前溶于100 μ L DMS0， 再用细胞维持液稀释至Img ^L-1,作为原液。将筛选样品原液用培养液做1 2 1 256 倍比稀释后，加到已长成单层的Hep-2细胞培养板中，100 μ L/孔，每个稀释度药液做4个复孔，同时设正常细胞对照。将培养板置于温度为37°C，C02浓度为5%的培养箱中培养，每日在倒置显微镜下观察细胞病变情况，确定细胞不出现明显病变的最低稀释倍数(最大无毒浓度)，按 Reed-Muench 法(Virology, J. P. Lippincott，Philadelphia，1988，22-25)计算半数细胞毒性浓度(median toxic concentration, TC50)禾口最大无毒浓度(maximal atoxic concentration, TC0)。4.筛选样品的体外抗柯萨奇病毒作用(CPE法)取已长成的Hep-2单层细胞的培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接种IOOTCId50的CoxB3病毒液于96孔板，100 μ L/孔，置温度为37°C, CO2浓度为5% 的培养箱中吸附1小时后，弃去病毒液，再分别加入相应稀释度的筛选样本(从最大无毒浓度开始往下对倍稀释5个浓度)，100 μ L/孔，同时设正常细胞对照和病毒对照。置于温度为37 V，CO2浓度为5 %的培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变为++++时记录试验结果。细胞病变按6级标准判断-细胞生长正常，无病变出现；士 细胞病变少于整个单层的10% ；+:细胞病变约占整个单层细胞的25%以下；++:细胞病变约占整个单层细胞的50%以下；+++ 细胞病变约占整个单层细胞的75%以下；++++ 细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。按 Reed-Muench 计算 IC5050。
5. HIV-I感染性滴定HIV-Iiiib 按 Johnson&Byington (Techniques in HIV Research, Stockton Press, NewYork (1990)，pp. 71-76)所述方法改良进行滴定，简述如下将HIV-I贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，同时设置对照孔6孔。每孔加入C8166细胞50 μ L，每孔终体积为200 μ L，并于温度为37°C，CO2浓度为5%条件培养。第3天补加新鲜RPMI-1640完全培养基100 μ L，第7天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-I诱导的细胞病变效应(Cytopathic Effect, CPE)，以每孔是否有合胞体(Syncytium)的形成确定。按 Reed-Muench (J. Virol. Methods. 2001，107-126)方法计算病毒的 TCID5。。6.对C8166细胞的毒性实验将毛蕊异黄酮苷、大豆苷元和毛蕊异黄酮溶解于DMSO中，贮存液浓度为25mg/ mL,储存条件为4°C ；AZT溶解于RPMI-1640完全培养基中，0. 22 μ m滤膜过滤除菌，分装后_20°C保存。4X 105/mL C8166细胞悬液100 μ L与不同的待测药物溶液混合，设3个重复孔。同时设置不含药物的对照孔，于温度为37°C，CO2浓度为5%的条件培养3天，采用 MTT比色法检测细胞毒性(J. Ethnopharmacol. 2008，249-256)。ELx800酶标仪测定OD值， 测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到半数细胞毒性浓度值(50% Cytotoxic Concentration, CC50)，即对50%的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的药物浓度。7.对HIV-Iiiib致细胞病变(CPE)的抑制实验将8X 105/ml C8166细胞50 μ L/孔接种到含有100 μ L/孔梯度倍比稀释(5倍倍比稀释6个梯度)毛蕊异黄酮苷、大豆苷元和毛蕊异黄酮三种化合物的96孔细胞培养板上，然后加入50 μ L的HIV-Iiiib稀释上清，1300TCID50/孔，设3个重复孔。同时设置不含药物的正常细胞对照孔，叠氮胸苷(3，-Azido-3' -deoxythymidine, AZT)为阳性药物对照。 于温度为37°C，C02浓度为5%的条件培养3天，倒置显微镜下(100X)计数合胞体的形成。 EC50为抑制合胞体形成50%时的化合物浓度。8.对实验株HIV-Iiiib急性感染C8166细胞中病毒复制的抑制实验将4X 105/mL、于温度为37°C，CO2浓度为5%的条件下预先用HIV-Iiiib感染2小时的〇8166细胞10(^1^接种到含有100 μ L倍比稀释(5倍倍比稀释6个梯度)毛蕊异黄酮苷、大豆苷元和毛蕊异黄酮三种化合物的96孔板上，1300TCID50/孔，于温度为37°C，CO2浓度为5%的条件培养3天。离心后收集培养上清，0.5% Triton-X 100灭活。采用捕捉p24 抗原ELISA方法(J. Ethnopharmacol. ,2008,249-256)检测化合物对HIV-1复制的抑制作用。实验后，对各项实验结果进行记录、整理和归纳，毛蕊异黄酮苷、大豆苷元和毛蕊异黄酮对Hep-2细胞存活率的影响如表1所示，MTT法检测对C8166细胞存活率影响1 所示，MTT法检测阳性对照AZT对C8166细胞存活率影响如表2所示。毛蕊异黄酮浓度低于31. 25 μ g · mL"1对!fep-2细胞的存活并无影响，而当浓度为 44. 67 yg -mr1时，即可对半数的ifep-2细胞存活率产生影响。对C8166细胞毒性实验得到近似的结果，即在浓度为40 μ g -mL-1时，毛蕊异黄酮即对C8166细胞存活有明显抑制用，浓度为200μ g · mL"1时，毛蕊异黄酮已对绝大部分(约70% )C8166细胞存活有明显抑制作用，而毛蕊异黄酮苷对C8166细胞存活的抑制作用仅有10%。浓度为400 μ g. mL—1时，阳性对照AZT对C8166细胞存活率产生影响。由此可见，毛蕊异黄酮对ifep-2细胞和C8166细胞的抑制力显著高于毛蕊异黄酮苷。 表1三种化合物对H印-2细胞存活率影响
权利要求
1.一种结构式如下的异黄酮类化合物，在制备抗病毒药物中应用。
2.根据权利要求1所述的异黄酮类化合物，作为活性成分在制备抗病毒药物中应用。
3.根据权利要求1所述的异黄酮类化合物，作为活性成分在制备抗柯萨奇病毒药物中应用。
4.根据权利要求1所述的异黄酮类化合物，作为活性成分在制备抗免疫缺陷病毒药物中应用。
5.一种结构式如下的异黄酮类化合物，在制备预防或治疗病毒性疾病的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的异黄酮类化合物，其特征在于作为活性成分在制备预防或治疗病毒性疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求5所述的异黄酮类化合物，其特征在于作为活性成分在制备预防或治疗柯萨奇病毒性疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求5所述的异黄酮类化合物，其特征在于作为活性成分在制备预防或治疗艾滋病的药物中的应用。
全文摘要
一种异黄酮类化合物，在制备抗病毒药物中的应用。本发明提供的异黄酮类化合物为毛蕊异黄酮，具有显著的抗艾滋病毒和柯萨奇病毒活性。本发明异黄酮类化合物作为活性成分，用于制备预防或治疗病毒性疾病的药物。
文档编号A61P31/12GK102302484SQ20111019312
公开日2012年1月4日 申请日期2011年7月11日 优先权日2011年7月11日
发明者吴斌, 唐意红, 孙兆林, 李志雄, 王睿睿, 罗荣华, 范明松, 郑永唐, 陈明苍, 陈璐莹, 黄成钢 申请人:中国科学院上海药物研究所, 中国科学院昆明动物研究所