专利名称：用于离体检测细胞的诊断方法
用于离体检测细胞的诊断方法本发明本质上涉及用对表征细胞子集的靶物特异性的结合域检测所述细胞子集的方法，所述方法包括离体检测所述细胞子集，其中要在取出所述细胞子集前对包含或假定包含所述细胞子集的受试者施用所述结合域。本发明还涉及如本文中限定的结合域在本文中限定的方法中的用途。还涵盖如本文中限定的结合域用于制备要在本文中限定的方法中使用的诊断用组合物的用途。在另一个方面，本发明涉及要在本文中限定的方法中使用的如本文中限定的结合域。还公开了试剂盒，其包含如本文中限定的结合域和对受试者施用所述结合域的手段，以及任选地，用本文中限定的方法检测所述结合域的手段。在另一个方面，本发明涉及结合域，优选地治疗有效的抗体，如例如阿伦单抗(alemtuzumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、加利昔单抗(galiximab)、吉妥单抗(gemtuzumab)、易普利单抗(ipilimumab)、拉贝珠单抗(Iabetuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、曲妥单抗(trastuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、rhMab ICR62、rhMab Β-Lyl 和帕妥珠单抗(pertuzumab)等，包括其组合用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗倾向于有利地响应所述结合域的患者，如通过本文中限定的方法鉴定的。通过单克隆抗体靶向肿瘤关联表面抗原是一种用于治疗不同恶性肿瘤的成功办法。然而，在使用给定抗体启动治疗性干预前，不得不确认相关抗原的表达。这经常通过外植肿瘤组织的福尔马林固定和石蜡包埋规程后的常规免疫组织化学(IHC)或者原位杂交测定法完成。用治疗性抗体的治疗仅在已经确认了相关肿瘤关联靶抗原的表达时证明是正当的。基于放射性标记的抗体的生物分布方法也有讨论(Decker等，Nucl. Med. AndBiol.，35(2008)，第599页-第604页)。然而，这些方法仅略了解抗体在活体和/或外植器官内的生物分布。免疫组织化学(IHC)是通过使用经标记的抗体作为特异性试剂，经由由标志物诸如荧光染料、酶、放射性元素或胶体金显现的抗原-抗体相互作用来定位组织切片中的抗原。免疫组织化学一般由下列步骤组成a) —抗结合特定抗原；b)抗体-抗原复合物被经标记的二抗结合；c)在抗体-抗原结合的位置检出所述标记物及由此所述抗原(若存在的话)。一般地，为了增强否则可能低得不足以检出的检测信号而采用二抗。Albert H. Coons 及其同事(Coons 等，1941, 1955;Coons 和 Kaplan, 1950)首次用荧光染料标记抗体，并且将其用于鉴定组织切片中的抗原。随着免疫组织化学技术的扩充和发展，已经引入了酶标记物诸如过氧化物酶和碱性磷酸酶，以及胶体金，等等。在异常细胞诸如发现于癌性肿瘤中的那些细胞的诊断中广泛使用免疫组织化学染色。其它特异性分子标志物是特定细胞事件诸如增殖或细胞死亡特征性的。IHC也在基础研究中广泛使用以了解生物标志物和差异表达的蛋白质在生物组织的不同部位中的分布和定位。由于免疫组织化学牵涉特异性抗原-抗体反应，它比仅鉴定有限数目的蛋白质、酶和组织结构的传统上使用的特殊酶染色技术具有明显的优点。因此，免疫组织化学已经变为一项至关重要的技术，并且在许多医学研究实验室以及临床诊断学中广泛使用。
W02008/033495报告了令人惊讶的发现，即对EGF受体特异性的某种抗体克隆对皮肤病，特别是银屑病的检测和治疗可能是有用的。还提出了所述抗体用于体内成像方法和用于基于“经典”IHC的方法。虽然体内成像方法需要在检测前施用该抗体(参见所述文件的权利要求26和33以及段落
)，但是清楚的是，W02008/033495中披露的IHC方法(所述IHC方法作为体内成像方法的备选使用)仅在取出所讨论的组织后使经标记的抗体与靶细胞接触(具体见段落
、
和
以及实施例I)。W02008/033495既未披露也未提出在取出相应的组织样品前施用抗体及通过IHC方法检测结合的抗体。组织制备是免疫组织化学的基石。为了确保保存组织构造和细胞形态学，迅速的且适当的固定是必要的。然而，不适当的或延长的固定可以显著降低抗体结合能力，因为抗原性靶物在固定规程的过程中被改变或甚至被破坏。这可以导致降低的信号强度，导致信号的完全缺乏，或甚至更糟，导致靶物改变，这可以产生假阳性和/或假阴性信号。因此，IHC结果的可靠性取决于IHC固定过程中靶物可能的改变。其它因素也可能影响IHC结果的可靠性。例如，将固定的组织包埋到石蜡中是标准的，然而，这预先假定用于IHC测量的结合域(例如抗体)是“石蜡可透过的”，即其必须能够在石蜡背景中找到其靶物。已经将可适用于IHC研究的抗体优化以满足这类特定的标准(例如，石蜡透过性)，并且因此，可以与治疗性抗体具有不同结合特征。一般而言，治疗性抗体不是石蜡反应性的，而且因此除了治疗有效的抗体之外，必需开发可用于IHC中靶物检测的抗体。然而，“诊断用”和“治疗性”抗体之间的这种差异倾向于产生问题。例如，尽管曲妥单抗在早期和晚期HER2阳性乳腺癌患者中有印象深刻的临床益处，但并非所有受治疗的患者可以以类似的程度受益。作为分子靶向疗法，曲妥单抗的临床效力依赖于治疗的候选患者的肿瘤标本中HER2状态的精确评估。目前，在临床背景中用于HER2状态评估的两种最标准化的方法是免疫组织化学(IHC)和FISH。尽管使用上述方法对HER2阳性肿瘤患者有可靠的选择，但在晚期乳腺癌患者中使用单一药剂曲妥单抗的响应率(RR)仅在从19%至34%的范围内。之所以如此，是因为检测HER2过表达的最广泛使用的IHC方法实际上不能证明曲妥单抗特异性靶位点的存在。因此，本领域需要改进的方法，该方法允许更准确和/或更灵敏地检测期望的靶物(优选细胞性靶物)和/或以此类靶物为特征的细胞子集。因此，作为本发明基础的技术问题是提供用于离体检测细胞的诊断方法。本发明解决此需要，并因此作为该技术问题的解决办法，提供了用对表征细胞子集的靶物特异性的结合域检测所述细胞子集的方法，所述方法包括离体检测来自受试者的肿瘤样品中的所述细胞子集，其中所述受试者是在取出所述组织样品前已经接受过所述结合域的受试者。到目前为止，一般不用治疗性抗体，而用适用于IHC的抗体实施靶物表达的验证。然而，此方法具有的限制可以导致对靶物确认的误解。此外，常规的福尔马林固定具有缺点(Chu W-S等，Modern Pathol 2005; 18:850-863) 固定可以以如下的方式修饰表面抗原，从而降低(或增强)IHC抗体的结合，这并不反映临床情况。另外，必须以特殊的方式加工经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织载玻片，以得到用IHC抗体的最佳染色(例如，通过加热或与特殊的酶一起温育进行的抗原修复)。最终，肿瘤关联表面抗原在肿瘤生长和转移性扩散的过程中可以受到调控(过表达、内在化或脱落)，这例示了为了能够改变疗法(使用不同结合域)或者决定给定疗法仍然合适与否，尽可能经常评估给定疗法的实际效率的必要性。因此，一种在疗法启动的时间点在体内同时允许验证靶物表达和证明治疗性抗体结合的技术会是期望的，并且会优化分层过程。我们已经开发出解决这两个问题的方法。将治疗性抗体用有机荧光团标记，并在人异种移植物中i.v.注射。在此报告中，我们证明了近红外荧光(NIRF)验证靶物表达和对肿瘤组织结合的效用。对小鼠(其携带Her2阳性肿瘤)单次i. V.注射50微克Cy5标记的赫赛汀(Herceptin)或奥密塔克(Omnitarg)后，强荧光信号在24至48小时后在肿瘤区是可检出的。随后对外植肿瘤组织的分析揭示，Her2特异性抗体仅结合肿瘤细胞，而不结合鼠组织。相比之下，用针对人IgE的对照抗体柯耐尔(Xolair)没有生成荧光信号(图1-3)。该方法优于通过经典IHC常规检测靶抗原，因为i)相关靶物在其被结合域结合时处于其“天然环境”中；ii)可以检测原发性肿瘤生长和转移性扩散过程中靶物表达的调控;iii)肿瘤组织的外植和固定要在结合域(抗体)已经结合相关靶物后实施；iv)治疗性抗体和IHC抗体的结合特征的差异变得不明显。本发明的进一步的实施方案在本文中得到表征和描述，并且在权利要求书中也得到反映。必须注意的是，如本文中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数提及物，除非上下文另外明确指示。因此，例如，提及“一种试剂”包括一种或多种此类不同试剂，而提及“该/所述方法”包括提及本领域普通技术人员已知的等同步骤和方法，其可以修改或替代本文中描述的方法。除非另外指示，一系列要素前的术语“至少”应理解为指该系列中的每件要素。本领域的技术人员会认可，或者仅使用常规实验便能够确定本文中描述的本发明具体实施方案的许多等同方案。本发明意图涵盖此类等同方案。除非上下文另外需要，贯穿本说明书和所附的权利要求书，词语“包含”及变型应理解为暗示纳入叙述的整数或步骤或整数或步骤的组，而不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的组。贯穿本说明书的文本引用数篇文件。在此通过提及而完整收录本文中引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、用法说明书等)，不管上文还是下文。凭借在先发明，本文中的任何文字都不应解释为承认本发明没有资格早于所述公开。在第一个方面，本发明涉及用对表征细胞子集的靶物特异性的结合域检测所述细胞子集的方法，所述方法包括用所述结合域离体检测所述细胞子集，其中要在取出所述细胞子集前对包含或假定包含所述细胞子集的受试者施用所述结合域。优选地，本发明的方法基于IHC方法。本发明还涉及用对表征细胞子集的靶物特异性的结合域检测所述细胞子集的方法，所述方法包括用所述结合域离体检测所述细胞子集，其中所述细胞子集源于如下的受试者，该受试者(a)包含或假定包含所述细胞子集且(b)已经用所述结合域预处理。优选地，本发明的方法是体外(或离体)方法。在又一个方面，本发明涉及用对靶物特异性的结合域检测表征细胞子集的所述靶物的方法，所述方法包括离体检测所述靶物，其中要在取出所述细胞子集前对包含或假定包含所述细胞子集和/或靶物的受试者施用所述结合域。本发明还涉及用对靶物特异性的结合域检测表征细胞子集的所述靶物的方法，所述方法包括离体检测所述靶物，其中所述细胞子集源于如下的受试者，该受试者(a)包含或假定包含所述细胞子集且(b)已经用所述结合域预处理。在本发明方法的一个优选的实施方案中，所述细胞子集包含于组织样品内。会理解的是，要以一定的量对受试者施用结合域达一段时间，使得足以允许其对靶物的结合。因此，本发明涉及IHC方法，其特征在于对靶物特异性的结合域结合在其天然环境中的靶物，且具体地，在由所述靶物表征的细胞子集已经自所述受试者取出并且进行IHC固定规程前。由此，靶物的“天然环境”是例如体内(受试者内)的靶物或处于其细胞培养环境中的细胞系。术语“IHC固定规程”包括为了确保保存组织构造和细胞形态学而可以实施的所有公知的步骤和方法。在本文中还例示了这类IHC固定规程。“IHC方法”意味着通过使用经标记的结合域作为特异性试剂，经由由标记物显现的靶物-结合域相互作用来定位组织切片中的靶物(例如抗原)。所述组织切片或是对组织样品采集的薄(约2-40μπι)片，或者若组织样品不是非常厚并且是可透过的，则其整体使用。优选地，所述组织样品是经包埋的，例如在石蜡中。因此，本发明在又一个实施方案中涉及一种方法，优选IHC方法，包括检测以由细胞子集特异性的靶物表征的所述细胞子集的步骤，该靶物的特征在于所述靶物受到对所述靶物特异性的结合域结合，所述结合域在从受试者取出所述细胞子集(或包含所述细胞子集的肿瘤样品)前已经结合所述靶物。在另一个实施方案中，本发明涉及一种方法，优选IHC方法，包括检测细胞子集特异性的靶物的步骤，该靶物的特征在于所述靶物受到对所述靶物特异性的结合域结合，所述结合域在从受试者取出所述细胞子集(或包含所述细胞子集的肿瘤样品)前已经结合所述靶物。离体发生的“捡湿”通过技术人员公知的标准检测技术实施，并且包括但不限于，任何种类的合适的IHC检测技术,诸如基于突光的显微术,优选基于近红外的显微术,任选地包括载玻片扫描。可以为随后的3D重建使用所述载玻片扫描。术语“结合域”就本发明而言表征多肽中与给定靶物特异性结合/相互作用的域。优选地，所述结合域能够与特定的抗原或肿瘤靶抗原或特定的抗原组，例如不同物种中的相同抗原或肿瘤靶抗原特异性结合/相互作用。所述结合/相互作用还理解为限定“靶物的特异性识别”。术语“结合域”明确包括所有种类的支架(其中一些在本文中进一步表征)，该支架以至少一种抗原或表位相互作用位点为特征。抗原或表位相互作用位点以特异性识别抗原或表位(即本发明的靶物)的抗原/表位特异性结合实体为特征。优选地，这类抗原或表位结合位点是基于抗体/免疫球蛋白域的。术语“特异件识别靶物”或“对靶物特异件的”,依照本发明意味着结合域，例如抗体能够与如本文中定义的靶物特异性相互作用和/或结合。如本文中使用的，术语“结合”就靶物和结合域之间的相互作用而言指一般同与蛋白质结合(即非特异性结合)相比，结合域以统计学显著的程度与该靶物结合(例如相互作用或复合)。因此，术语“结合域”还理解为指与靶物具有统计学显著的联合或结合的域。抗原相互作用位点与其特定抗原的特异性相互作用也可以导致所述位点对该抗原的简单结合。此外，结合域/抗原相互作用位点与其特定抗原的特异性相互作用或者可以导致信号启动，例如由于诱导抗原构象的变化、抗原的寡聚化等所致。本发明的“结合域”包括但不限于抗体、域抗体(dAb)、脂笼蛋白、Affibody、Avimer、肽适体、微体等。按照本发明的结合域的一个优选的例子是抗体或其抗原结合片段，更优选单克隆抗体或其抗原结合片段，且甚至更优选治疗性抗体或其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段在一个最优选的实施方案中是经荧光标记的。还涵盖双特异性或多聚体抗体形式。结合域(例如抗体)要在取出细胞子集和/或包含所述细胞子集的所述肿瘤样品前，并且也在实施检测前对受试者施用，即在检测(包括固定)J1L，并且因此也在取出所述细胞子集和/或包含所述细胞子集的所述组织样品前。“在…前”进一步意味着结合域的实际施用和细胞子集和/或组织样品的实际取出之间的时段使得根据情况，结合域具有足以结合其靶物的时间。所述时间段取决于靶物、结合域、结合域的结合特征(结合域对靶物的亲和力或亲合力)、结合域在受试者中的半衰期、结合域的血液清除(倘若其在静脉内施用)，等等。然而，技术人员能够判断哪个时间段足以允许结合域对靶物的特异性结合。这适合于结合域的量、施用路径等。倘若为了检测第一结合域(一级结合域)而使用二级结合域，还涵盖仅第一结合域要在检测前，并且因此如上文解释的，也在取出所述细胞子集和/或包含所述细胞子集的所述组织样品前施用，或者这两者，即一级和二级结合域要在检测前施用(同时或序贯)。在下文中更为详细地解释了一级和二级结合域。优选的是，一级结合域要在细胞子集和/或包含所述细胞子集的所述组织样品的检测前，并且因此也在其取出前对受试者施用，并且在取出所述细胞子集和/或包含所述细胞子集的所述组织样品后使用二级结合域(若采用的话)。更优选的是，为了检测第一结合域，仅采用一级结合域而非二级结合域。本发明的受试者是要在取出所述细胞子集/组织样品前施用结合域的受试者。或者，本发明的受试者是在取出所述组织样品/细胞子集前已经接受了本发明的结合域的受试者。涵盖的是，本发明的受试者在取出组织样品/细胞子集前已经包含本文中限定的结合域。本发明的受试者包含或假定包含所述细胞子集和/或靶物。“假定包含”意味着意图诊断细胞子集和/或靶物是否存在、缺乏、过表达或表达不足。因此，预先得知(即在发生实际检测前)感兴趣的细胞子集和/或靶物是否存在、缺乏、过表达或表达不足是不必要的。此外，还涵盖的是，本发明的受试者是包含本发明的结合域的受试者。会理解的是，本发明的组织样品和/或细胞子集是从本发明的受试者获得的。因此，本发明涉及用对表征细胞子集的靶物特异性的结合域检测所述细胞子集的免疫组织化学(IHC)方法，所述方法包括离体检测所述细胞子集，其中所述细胞子集(或如本文中描述的组织样品)自在取出所述组织样品/细胞子集前已经接受本发明的结合域的受试者获得。施思路径视情况而定，并且包括口服施用，但是优选的是胃肠外，例如静脉内、肌肉内、腹膜内、动脉内、瘤内施用，等等。更优选的是静脉内施用。供胃肠外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、混悬剂和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油、和可注射有机酯诸如油酸乙酯。水性载体包括水、含醇/水性溶液、乳剂或混悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格(Ringer)氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸盐林格氏(lactated Ringer’s)、或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如那些基于林格氏右旋糖的)，等等。也可以存在防腐剂和其它添加剂诸如，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体，等等。涵盖的是，结合域对表征细胞子集的靶物是特异性的。术语“细胞子集”指通过至少一种，即1、2、3、4、5、6、7种或其至更多种靶物表征和/或可鉴定的感兴趣的细胞，所沭鞭物帮助将此细胞子集与其它细胞区别。所述靶物是或假定是该细胞子集特异性的。靶物可以在所述细胞子集之上或之中特异性存在(表达)，它可以在所述细胞子集之上/之中特异性上调(过表达)，它可以在所述细胞子集之上/之中特异性下调(表达不足)或者其可以自涵盖的细胞子集特异性缺乏。因此，会理解的是，与可比较的对照细胞的正常/天然状态相比，不仅存在或缺乏靶物可以表征细胞子集，而且靶物的表达水平变化也可以(例如，随时间；响应刺激物或抑制剂)，其中“可比较的对照细胞的正常/天然状态”意味着如下的对照细胞，其优选地与形成所述细胞子集的细胞是相同种类的，例如这两者都是上皮细胞，但是其自不同来源衍生。“不同来源”包括，例如自健康受试者获得的细胞/组织样品或自同一受试者的截然不同的但明显健康的部分获得的细胞/组织样品，其中所述不同部分表现为没有以所述细胞子集为特征的疾病的关联症状。还涵盖通过前述条件的混合限定细胞子集，例如至少一种靶物特异性存在，而另一种不然，等等。“感兴趣的细胞”意味着其取决于分析的意图，并且因此取决于选择的靶物，以确定哪些细胞是感兴趣的，而哪些不是。例如，公知的是某些肿瘤过表达肿瘤标志物，如β -HCG, CA 15-3、CA 19-9, CA 72-4、CFA、MUC-1、MAGE、p53、ETA、CA-125、CEA、AFP、PSA、PSMA、ErbB受体家族(其是四种紧密相关的受体酪氨酸激酶的亚家族EGFR(ErbB-I)、HER2/c-neu (ErbB-2)、Her 3 (ErbB-3)和 Her 4 (ErbB-4))等，S卩“细胞子集”可以包含表达/过表达一种或多种这些肿瘤标志物的细胞(推测为肿瘤细胞)。同样地，有可能根据分析的意图鉴定不表达一种或所有提及的肿瘤标志物的细胞子集。形成细胞子集的细胞可以是动物细胞、寄生物诸如蠕虫的细胞、真菌细胞、细菌、病毒或原生动物。术语“动物细胞”包括，例如在后文中定义的“受试者”细胞。优选肿瘤细胞。因此，在一个优选的实施方案中，所述细胞子集由肿瘤细胞组成或包含肿瘤细胞。如本文中使用的，术语或“肿瘤细胞”指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。肿瘤的例子包括但不限于，癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌肿瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(schwannoma)(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌和黑素瘤。“肿瘤细胞”进一步包括“实体瘤”，其指的是选自下组的肿瘤胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(h印atoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤、以及头和颈癌，优选乳腺癌。细胞系也是涵盖的。可以以“分离的形式”使用这些细胞系。细胞系本身是不受限的，即涵盖表达本发明的意义内的靶物的每种想得到的细胞。所述细胞系可以是同质或Μ- 。(轺w喇發剩 「坩锲ΨΕ·: 蛾朱。(轺趄锥喇鞞頰)锲隹§$s§s^s ^ 150^s-e ws§0,.(锲隹S胡裝(顆沭轺酤暖坩喇fDRi r月潞蛋拉硐屮坩賒鞞细_蛋剩吞蔣__)「孰，__)「與3^l·坩賒鞞KH wfr肚资坩)M)锲隹驾親劁胡~ SSSSS Ssi^与锻皿)Sffl 1^^. - 0sff^ss^§0s^0 )锲-Ek (允龄闰鞞轺
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。胡裝驾親锲隹裡條驾親闳Μ ^ 银每。轺呜咪罔 ZVL ^ < 8s6co6SI Zo分别形成细胞子集。同样地，有可能限定提及的肿瘤内更有限的肿瘤细胞子集，例如那些表达、过表达和/或表达不足至少一种IE物，例如ErbB受体家族受体的肿瘤细胞。细胞子集是例如过表达ErbB受体家族受体,例如Her2/neu受体的肿瘤细胞。所述细胞子集包含在组织样品中或者它本身是组织样品(例如，自肿瘤衍生的肿瘤细胞，在细胞培养中生长的细胞系，已经分离并且优选还已经纯化以富集期望细胞类型的原代细胞)。例如，肿瘤细胞和/或(微)转移周围经常有健康的，即非致瘤性组织，即该肿瘤细胞然后可以在健康组织内形成细胞子集。由此，组织样品可以包含健康细胞的子集和致瘤性细胞的子集。在所述肿瘤细胞子集内，可能有可能限定进一步的肿瘤细胞子集，例如表达/过表达HER2/neu的这类肿瘤细胞。还涵盖的是，例如组织样品包含病毒或其它病原性物种(细菌、原生动物等)。这类细菌然后可以在此组织样品内形成细胞子集，或者包含例如胞内细菌的细胞可以在组织样品内形成细胞子集。如前文提到的，还涵盖的是组织样品完全由细胞子集组成。会理解的是，术语“组织”、“组织样品”、“组织切片”等可互换使用。此外，还涵盖的是，本发明的方法可以用细胞子集(其可以包含在组织样品中)实施。可以通过活组织检查诸如针活组织检查、手术活组织检查、骨髓活组织检查等获得组织样品。术语“靶物”或“表征所述细胞子集的靶物”包括与结合域结合并且对于期望的细胞子集而言特异的或假定为特异的所有结构/抗原/表位。“特异的”意指此靶物表征所述细胞子集，即其主要存在于这些细胞之上(或之中)，或在这些细胞之上或之中主要是缺乏的或主要过表达或表达不足。由此，“主翌”应当反映如下的事实，即在生物学系统中，实现期望的细胞子集随着时间的推移保持不变的情况几乎是不可能的。靶物可以与生物学状态，诸如疾病或病症以及病原体的存在有关。当靶物与某种生物学状态“有关”时，靶物的存在或缺乏或者某个量的靶物的存在或缺乏可以鉴定该生物学状态。在本发明的上下文中的“靶物”明确包括蛋白质、肽、酶、核酸、多糖、脂质、受体、细胞性靶物、和/或肿瘤抗原或其存在(定性)和/或其量(定量)是感兴趣的并且表征细胞子集的任何其它种类的结构/抗原/表位。优选地，所述靶物(其存在、缺乏或量)对于特定疾病，优选对于癌症具有预后价值。“细胞件靶物”包括表征细胞子集的所有种类的表位/抗原/结构(优选在细胞表面上)，诸如 CAM 例如 NCAM、ICAM-I、VCAM-I、PECAM-I、LI、CHLl、MAG、整联蛋白诸如 α ν β 3和ανβ 5整联蛋白、选择蛋白、CD抗原诸如CDld，其可以用于靶向例如树突细胞、肠上皮细胞、B细胞子集、NKT细胞子集；CD lla、b、c、d ;CD14和CD16/18，其可以用于靶向例如巨噬细胞；CD23，其可以用于靶向例如表达IgM或IgD的活化的成熟B细胞(特别是套细胞)、活化的单核细胞/巨噬细胞、T细胞子集、血小板、嗜曙红细胞、朗格汉斯细胞、小结树突细胞或肠上皮；CD54 (也称为ICAM-1)，其可以用于靶向例如B和T细胞以及B细胞前体、单核细胞、破骨细胞、内皮细胞和各种上皮细胞；CD57，其可以用于靶向例如NK子集、T细胞子集、神经外胚层组织、视网膜、脑、前列腺、肾近端小管的细胞；⑶64(也称作Fe YRI)，其可以用于靶向抗原呈递细胞，包括巨噬细胞/单核细胞、活化的粒细胞、树突细胞或早期髓样细胞；CD91(也称为低密度脂蛋白受体相关蛋白；亦称作α-2巨球蛋白受体)，其可以用于靶向成纤维细胞、树突细胞、巨噬细胞、肝、脑或肺组织以及CD-20、CD-45。此外，该术语涉及抗CD抗体，涉及由不同起源(乳房、结肠、肺、前列腺、卵巢、肝和胰腺)的癌症干细胞表达的抗原，涉及分子危险信号、TLR、细菌毒素，例如如记载于WO 2006/114308的针对神经细胞的“Trapo”，或通常存在于树突细胞上的DEC-205。另外，该术语涉及血管归巢肽，其对于某些器官或组织，如例如脑、肾、肺、皮肤或心脏可以是特异的。更优选地，该术语涉及诸如在下列文献中提及的肽Arap，W.等，Proc. Natl Acad Sci. U. S. A.，99:1527-1531 (2002) ; Ra jotte, D.等，J. ClinInvest.，102:430-437 (1998) ; Pasqualini, R.和 Ruoslahti, E. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:83;Rajotte, D.和 Ruoshlati, E. , J. Biol. Chem. 274:11593-11598 (199 9) ; Essler, M.和 Ruoshlati, E. , Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. , 99:2252-2257 (2002)。
术语“受体分子”或“受述”指细胞膜上或胞质或细胞核内结合配体并且通常转导信号的蛋白质，诸如代谢型(metabotiOpic)受体、G蛋白偶联受体、毒蕈碱乙酰胆碱受体、 腺苷受体、肾上腺素受体、GABA受体、血管紧张素受体、大麻素受体、胆囊收缩素受体、多巴胺受体、胰高血糖素受体、代谢型谷氨酸受体、组胺受体、嗅觉受体、阿片样物质受体、趋化因子受体、钙感测受体、促生长素抑制素受体、5-血清素(serotonin)受体、胰泌素受体、Fe 受体或受体酪氨酸激酶(RTK)。受体酪氨酸激酶家族由许多多肽生长因子、细胞因子和激素的高亲和力细胞表面受体组成，并且包含ephrine受体(Eph受体家族)、RET受体家族等；VEGF 受体家族，包含 VEGFRl (Flt-I)、VEGFR2(Flk-l/KDR)和 VEGFR4 (Flt_4)等，以及由 FGFRl、FGFR2、FGFR3、FGFR4和FGFR6例示的成纤维细胞生长因子受体家族。还包括并且特别优选ErbB受体家族，其为四种紧密相关的受体酪氨酸激酶的亚家族EGFR(ErbB-I)、 HER2/c-neu(ErbB-2)、Her 3 (ErbB-3)和 Her 4 (ErbB-4)。
术语“核酸”指本领域技术人员已知的任何核酸，例如多核苷酸，如DNA、RNA、单链 DNA、cDNA、PNA或其衍生物。
术语“蛋白质”包括任何感兴趣的多肽，包括治疗活性的蛋白质、酶、标志物蛋白质7等等。
术语“肢”指通过酰胺键连接至少两个氨基酸(优选α-氨基酸)，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个和甚至更多，多达30个氨基酸形成的分子。
术语“酶”意为包括对于细胞子集而言特异的或假定为特异的催化活性蛋白质，如例如在肿瘤细胞中经常过表达的金属蛋白酶等。
术语“脂质”意为包括能够表征细胞子集的所有种类的脂质，并且包括结合蛋白质诸如受体、激酶或磷酸酶，继而介导这些脂质对特定细胞应答的影响的脂质信使。
术语“多糖”意指由经糖苷键连接起来的重复单元(单糖或二糖)形成的聚合碳水化合物结构，并且包括在细胞表面上呈现的多糖(例如MUC-1)、形成细菌或病毒荚膜或被膜或作为其部分的多糖、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)等。
术语“肿瘤抗原”，与“肿瘤标志物”可互换，包括肿瘤特异性抗原和肿瘤关联抗原，优选负责原发性肿瘤生长和转移的肿瘤关联抗原。“肿瘤抗原”的例示有(但不限于) β-HCG'CA 15-3,CA 19-9,CA 72_4、CFA、MUC-l、MAGE、ras、p53、ETA、CA_125、CEA、AFP、PSA、 PSMA、Ep-CAM、CD33、CD44v6、MCSP、CD30、ErbB受体家族，其是四种紧密相关的受体酪氨酸激酶的亚家族EGFR (ErbB-I)、HER2/c-neu (ErbB-2)、Her 3 (ErbB-3)和 Her 4(ErbB_4)、血管生成素及其受体、VEGF 及其受体、CD9 ；CDCPI ；CSFlR ；CYR61 ；HER3 ；HPN(=Hepsin) ；TDGFI ； TR0P2 ;CD44 ；IGF1R ；TWEAK ；EGFR 和 PLGF 和 / 或 c-met，等等。
本文中提到的细菌、病毒或其它病原性生物体也可以形成靶物，优选当细胞(宿主细胞)包含这些病原性生物体时。所述宿主细胞以所述靶物(细菌、病毒)表征。
特别优选细胞子集表面上呈现的靶物(作为单一靶物或其组合)。
甚至更优选具有诊断价值的靶物。“诊断价倌”意味着已经知道或未来将知道靶物的存在或缺乏或上调或下调对特定疾病具有预后价值(如HER2/neu对于乳腺癌)。
术语“直迷”，与“体外”可互换，指在受控的环境中在细胞中进行的活动。如在本文中和本领域中使用的，此术语经常与“培养物中”可互换使用，所述“培养物中”可以指细胞培养物中的细胞或器官培养物中的细胞。
因此，在另一个方面，本发明涉及用对表征细胞子集的靶物特异性的结合域检测所述细胞子集和/或检测表征所述细胞子集的靶物的方法，所述方法包括体外检测所述细胞子集，其中所述结合域在检测所述细胞子集前和/或检测所述靶物前已经结合其靶物。
在一个优选的实施方案中，所述细胞子集包含在组织样品内。
优选地，本发明的结合域是经标记的。
極记盤在本发明的上下文中指通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的化合物或组合物。
标记物可以是直接或间接可检测的。
“直接”意味着标记物本身生成信号，诸如放射性、生色或荧光信号。直接的标记物包括放射性标记物；荧光标记物，电子密试剂等。直接标记物具有或生成可测量的信号，其可以用于量化和/或检测(定性)结合的结合域。荧光标记物是优选的直接标记物。
在本发明的一些实施方案中，所述检测通过直接免疫组织化学进行，并且包括检测所述(优选荧光)标记的结合域的存在。更优选地，所述结合域是抗体。
会理解的是，如果没有采用二级结合域，那么直接标记一级结合域。
“间接”意味着标记物例如由然后本身可检测的另一实体(检测实体)结合。间接检测或间接标记物牵涉直接或间接可检测的第二结合域对间接标记物的结合。例如，本发明的结合域的间接标记物可以是结合配偶的配体，诸如作为链霉亲合素的结合配偶的生物素，或者核苷酸序列，其是可以与其特异性杂交的互补序列的结合配偶，等等。因此，“间接标记”的特征在于操作一级结合域，使得其可以通过对所述操作(例如生物素标记物)特异件的第二结合域(有时也表示为检测实体)来检测。
在一个优选的实施方案中，所述结合域是抗体(一抗)，而所述检测实体是与一抗 (的标记物)特异性起反应的二抗。
还涵盖的是将间接和直接标记混合。例如，直接标记物已经能够生成信号(例如荧光标记物，如FITC)，但是特异性结合所述标记物的也例如用直接标记物标记的二级结合域(抗FITC抗体)结合一级信号的标记物，并且由此可以增加可检测的信号。这类手段和方法对于技术人员，特别是免疫化学领域的从业人员是公知的。
优选的是，对/要对受试者(或其被受试者包含在内)施用的至少10%的结合域群体用直接或用间接的标记物标记。优选地，对/要对受试者施用的大于50、60、70、80、90 或甚至100%的结合域群体用直接或用间接的标记物标记。
在另一个实施方案中，一级结合域(例如抗体)本身不被标记，伹是通过结合一级结合域的二级结合域(检测实体)检测/可检出(例如，在小鼠中生成的未标记的一抗通过经标记的、在另一物种中生成并且特异性结合小鼠抗体的二抗(例如山羊抗小鼠)检测)。然后，二级结合域是直接或间接标记的。这类抗体检测夹心物是完善建立的，而且技术人员对生成/建立或创建这类系统不会有问题。
用于免疫组织化学的最常见的固定剂是低聚甲醛，其经常在含有约1-5%低聚甲醛的多种多样的缓冲液中使用。在下文例示了基于低聚甲醛的特定缓冲液
a)含4%低聚甲醛的O. IM磷酸盐缓冲液
b)含2%低聚甲醛和O. 2%苦味酸的O. IM磷酸盐缓冲液
c) PLP (低聚甲醛、赖氨酸、低聚甲醛)固定剂例如含4%低聚甲醛、O. 2%高碘酸盐 (periodate)和I. 2%赖氨酸的O. IM磷酸盐缓冲液
d)具有O. 05%戊二醛的4%低聚甲醛
这些缓冲液不意图限制本发明，而是仅例示通常为了实现组织的充分固定而应用的特定条件。标准的固定时间是约5、10、15、20、30分钟至过夜。如此处理的组织经常进行随后的石蜡包埋方案，接着在有机溶剂如例如二甲苯中温育并用乙醇处理。然后，通常通过分别将样品置于95%、70%、50%、30%醇(例如乙醇)中达几分钟来将其水合。然而，没有标准的IHC方案，即方案会随着靶物、组织、使用的抗体等而变化。所有这点是技术人员已知的，并且在不再费周折的情况中常规处理。具体方案披露于例如因特网(在搜索引擎如 Google等中使用串IHC方案可搜索)。一些抗原甚至不会幸免于中等量的醛固定。在此情况下，经常将组织在液氮中快速(fresh)冷冻，并用恒冷切片机切割。将切片于-20C或更低保持冷冻，直到用冷的丙酮或醇固定。
因此,涵盖的是，在本发明上下文中采用的标记物经受仵IHC规稈，例如固定、石蜡包埋、杂交等。若标记物在其已经进行IHC方案后仍然可检出，则它“经受住IHC规程”。 例如一些标记物可以被热(石蜡包埋)或有机溶剂、或固定缓冲液等灭活，并且不再能够生成可检测的信号，因为该信号太低或者因为信号不再存在。因此，标记物的抗性将取决于使用的特定IHC方案。因此，可能的是一种标记物在一种特定IHC方案的过程中被灭活，但是在采用另一种IHC方案后仍然可用。
优选地，本发明的标记物经受住固定，更优选地，其经受住用福尔马林的醛固定。 在这点上，“经受住”意味着其在所述规程后仍然可检出，即优选地，其不损失其检测能力的超过50%。
涵盖的是，一级结合域也和二级结合域(若在检测前采用的话)也经受住IHC规程。
如本文中使用的焚光标记物”表征包含焚光团的分子。突光团，有时亦称作突光染料，是分子中吸收特定波长的能量并且以不同波长再发射能量的官能团。在与所述特定的(预定的)波长相比时，所述不同波长以与所述特定的(预定的)波长可区别的波长再发射，例如它以更长的波长或以更短的波长再发射，但是在后一种情况中强度降低。发射的能量的量和波长取决于荧光团和该荧光团的化学环境两者。
用于偶联荧光标记物，包括NIR荧光标记物的方法是本领域公知的。这些标记物与抗体的缀合技术在过去几年期间已经明显成熟，并且卓越的概述参见Aslam，Μ.和Dent ,A. , Bioconjugation (1998) 216-363，London,以及在章 “Macromolecule conjugation” 于 Tijssen,P., “Practice and theory of enzymeimmunoassays，，(1990)，Elsevier, Amsterd am o13
从上文引用的文献(Aslam，见上文)得知合适的偶联化学。根据存在哪种偶联模块，荧光标记物可以在水性或有机介质中与抗体直接起反应。所述偶联模块是用于将荧光染料标记物与抗体化学偶联的反应基或活化基。所述荧光染料标记物可以直接附着于抗体或经由间隔物与抗体连接以形成包含抗体和NIR荧光标记物的NIR荧光标记缀合物。使用的间隔物可以选择或设计为使得内在具有适当长的体内持久性(半衰期)。
优选地，荧光标记物选自下组量子点剂、荧光染料、PH敏感性荧光染料、电压敏感性荧光染料、和荧光标记的微球，优选荧光染料。
“量子点剂”或“量子点”，又称为纳米晶体，是称为半导体的一类特殊材料，其是由 II-VI, III-V或IV-VI周期类材料构成的晶体。
“荧光蛋白”包括例如增强或未增强的绿色荧光蛋白(GFP)、CFP、YFP、BFP。 更多的荧光蛋白记载于Zhang, Nat Rev Mol Cell Biol. 2002，12，第906-18页或于 Giepmans, Science. 2006, 312,第 217-24 页。
“荧光染料”包括所有种类的荧光标记物，包括但不限于荧光素，包括所有其衍生物如例如FITC;罗丹明，包括所有其衍生物诸如四甲基罗丹明(TAMRA)和其异硫氰酸盐衍生物(TRITC)、硫代罗丹明101 (及其磺酰氯形式德克萨斯红(Texas Red))、罗丹明红、 和罗丹明的其它衍生物，其包括更新的荧光团诸如Alexa 546、Alexa 555、Alexa 633、 DyLight 549 和 DyLight 633) ；Alexa Fluors (Alexa Fluor 突光染料家族由 Molecular Probes生产)；由Dyomics生产的荧光染料家族DyLight Fluor、ATTO染料，其代表由 Siegen的ATTO-TEC GmbH制造的一系列荧光标记物和染料(W0/2007/067978日本)； LaJolla 蓝(Diatron, Miami, Fla.);卩引哚菁绿(indocyanine green) (ICG)及其类似物 (Licha 等，1996，SPIE 2927:192-198; Ito 等，美国专利 No. 5，968，479);吲哚三羰花青 (indotricarbocyanine) (ITC;WO 98/47538),和螯合的镧系兀素化合物。突光镧系兀素金属包括铕和铽。还涵盖近红外(NIR)荧光标记物。使用具有在近红外光谱中的激发和发射波长的NIR荧光标记物，即640-1300nm，优选640_1200nm，且更优选640_900nm。使用电磁谱的此部分使组织穿透最大化，并且使生理学丰富的吸收物诸如血红蛋白(<650nm)和水 (>1200nm)的吸收最小化。理想的供体内使用的近红外荧光染料展现出
(I)窄光谱特征，
(2)高灵敏度(量子产率)，
(3)生物相容性，
(4)去偶联的吸收和激发光谱，和
(5)光稳定性。
各种近红外(NIR)荧光标记是商品化的，并且可以用于制备依照本发明的荧光实体。例示性的NIRF标记物包括下列各项Cy5. 5、Cy5和Cy7 (Amersham, Arlington Hts., IL) ；IRD41 和 IRD700(LI-C0R, Lincoln, NE) ；NIR-I(Dejindo, Kumamoto,日本)； LaJoIIa 蓝(Diatron, Miami, FL);卩引哚菁绿(ICG)及其类似物(Licha, K.等，SPIE-The International Society for OpticalEngineering 1996;第 2927 卷:192-198;US 5，968，479);吲哚三羰花青(ITC; W098/47538);和螯合的镧系元素化合物以及SF64、 5-29,5-36和5-41 (来自W02006/072580)。荧光镧系元素金属包括铕和铽。镧系元素的突光特性记载于 Lackowicz, J. R.，Principles of Fluorescence Spectroscopy,第 2 版,KluwerAcademic, New York, (1999)。
“荧光微球”很详细地记载于W0/2007/067978，其通过提述并入本文。
已知由荧光染料发射的能量的量和波长取决于荧光团和该荧光团的化学环境两者。由此得出结论，荧光染料可以PH敏感性或电压敏感性起反应，即它们是由化学环境的这类变化可活化的。更多可活化的荧光标记物很详细地记载于例如US 2006/0147378 Al、 US 6592847,US 6，083，486、W0/2002/056670或US 2003/0044353 Al，所有这些都通过提述并入本文。
在本发明的上下文中优选突光染料。特别优选的是Cy、Alexa和Dylight家族的荧光染料。
受试者在本发明的上下文内是动物。优选地，所述受试者是脊椎动物，更优选是哺乳动物。更优选的是，所述哺乳动物受试者是人、猴诸如猕猴、小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、马、骆驼、犬、猫、猪、牛、山羊或禽。人受试者是最优选的。非人受试者可以代表特定疾病或病症的模型。还涵盖的是，本发明的受试者包括异种移植物，优选人肿瘤细胞。
优选地，本发明的结合域是或包含表位结合域。
优选地，所述表位结合域是抗体或其抗原结合片段。
术语“担指结合靶物的单克隆或多克隆抗体(参见Harlow和 Lane, “Antibodies, A Laboratory Manual，，, CSH Press, Cold Spring Harbor, USA, 1988), 或所述抗体的保留或基本保留其结合特异性的衍生物。这类抗体的优选衍生物是嵌合抗体，其包含例如小鼠或大鼠可变区和人恒定区。术语“抗体”还包含双功能(双特异性)抗体和抗体构建体，如单链Fv(scFv)或抗体融合蛋白。术语“scFv片段”(单链Fv片段) 是本领域中完全了解的，并且由于其尺寸小和重组生成这类片段的可能性而是优选的。所述抗体或抗体结合部分是人抗体或人源化抗体。依照本发明，术语“人源化抗体”意指如下的非人起源的抗体，其中可变区中的至少一个互补决定区(CDR)诸如CDR3和优选地所有6个⑶R已经用具有期望特异性的人起源的抗体的⑶R替换。任选地，抗体的一个或多个非人恒定区已经用人抗体的一个或多个恒定区替换。用于生成人源化抗体的方法记载于，例如EP-Al O 239 400和W090/07861。术语抗体或其抗原结合片段还包括重链抗体及其可变域，其在 WO 94/04678、W096/34103 和 WO 97/49805、WO 04/062551、WO 04/041863、 WO 04/041865、WO 04/041862和WO 04/041867中提及；以及域抗体或“dAb”，其基于传统的4链抗体分子的重链可变域(VH)或轻链可变域(VL)或自其衍生(参见，例如Ward等， 1989Nature 341，544-546)。
如本文中使用的，术语“抗原结合片段”指保留或基本保留抗体的结合特异件的如本文中规定的抗体片段，如分开的轻和重链、Fab、Fab/c、Fv、Fab’、F (ab’)2。抗原结合片段可以包含抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH);然而，其并不必须包含这两者。例如，Fd片段具有两个VH区，而且经常保留完整的抗原结合片段的抗原结合功能。
除了抗体或其抗原结合片段之外，术语“表位结合逑”还包括结合(特异性结合) 靶物的其它结合实体。术语“表位结合域”包括，例如以不依赖于不同V区或域的方式(特异性)结合抗原或表位的域，这可以是域抗体(dAb)，例如人、骆驼(camelid)或鲨鱼免疫球蛋白单一可变域，或者其可以是作为选自下组的支架的衍生物的域CTLA-4(Evibody);脂笼蛋白;蛋白A衍生的分子诸如蛋白A的Z域(Affibody, SpA)、A域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白诸如GroEI和GroES ;转铁蛋白(Trans-body);锚蛋白重复蛋白(DARPin);肽适体；C型凝集素域(Tetranectin);人Y-晶体蛋白和人泛素(affilins) ;PDZ域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz型域；和纤连蛋白(adnectin);其已经经过蛋白质工程化改造以获得对与天然配体不同的配体的结合。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞关联抗原4)是一种主要在⑶4+T细胞上表达的⑶28家族受体。其细胞外域具有可变域样Ig折叠。与抗体⑶R 对应的环可以用异源序列取代以赋予不同结合特性。工程化改造为具有不同结合特异性的 CTLA-4 分子也称为 Evibody。关于更多详情，参见 Journal of Immunological Methods 248(1-2)，31-45(2001)。
脂笼蛋白是转运疏水性小分子诸如类固醇、后胆色素类(bilins)、类视黄醇 (retinoids)和脂质的胞外蛋白质家族。它们具有的刚性β片层二级结构在圆锥形结构的开放端具有许多环，其可以被工程化改造为结合不同靶抗原。Anticalin的大小是 160-180个氨基酸，并且自脂笼蛋白衍生。关于更多详情，参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000),US7250297B1和 US20070224633。
Affibody是一种自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A衍生的支架，其可以工程化改造为结合抗原。该域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化生成文库。关于更多详情，参见Protein Eng. Des. Sel. 17,455-462(2004)和 EP1641818A1。
Avimer是自A域支架家族衍生的多域蛋白。约35个氨基酸的天然域采用限定的二硫键键合结构。通过改组由A域家族展现的天然变异产生多样性。关于更多详情，参见 Nature Biotechnology 23(12)，1556-1561 (2005)和ExpertOpinion on Investigational Drugs 16(6)，909-917(2007 年 6 月)。
转铁蛋白是一种单体血清转运糖蛋白。可以通过在容许的表面环中插入肽序列来将转铁蛋白工程化改造为结合不同靶抗原。工程化转铁蛋白支架的例子包括Trans-body。 关于更多的详情，参见 J. Biol. Chem 274，24066-24073(1999)。
设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)自锚蛋白衍生，所述锚蛋白是介导膜内在蛋白附着于细胞骨架的蛋白质家族。单个锚蛋白重复是由两个α螺旋和一个β转角组成的33个残基的基序。可以通过将每个重复的第一个α螺旋和β转角中的残基随机化来对它们进行工程化改造以结合不同靶抗原。可以通过增加模块数目增加其结合界面(亲和力成熟方法)。关于更多详情，参见J. Mol. Biol. 332，489-503 (2003)，PNAS 100 (4)，1700-1705 (2003)和 J. Mol. Biol. 369，1015-1028(2007)和 US20040132028A1。
纤连蛋白是一种可以工程化改造为结合抗原的支架。Adnectin由人纤连蛋白III 型(FN3)的15个重复单元的第10个域的天然氨基酸序列的骨架组成。β夹心物一端的三个环可以被工程化改造为使Adnectin能够特异性识别感兴趣的治疗性靶物。关于更多的详情，参见 Protein Eng. Des. Sel. 18，435-444 (2005)、US20080139791、TO2005056764 和 US6818418B1。
肽适体是由恒定支架蛋白，通常为含有在活性位点插入的约束性可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)组成的组合识别分子。关于更多的详情，参见ExpertOpin. Biol. Ther. 5，783-797(2005)。
微体自含有3-4个半胱氨酸桥的长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白衍生，微蛋白的例子包括KalataBI和芋螺毒素(conotoxin)以及knottin。微蛋白具有可以被工程化改造为包括多达25个氨基酸而不影响该微蛋白的总体折叠的环。关于更多工程化knottin域的详情，参见W02008098796。
其它表位结合域包括已经作为支架用于工程化改造不同靶抗原结合特性的蛋白质，包括人Y-晶体蛋白和人泛素(affilins)、人蛋白酶抑制剂的kunitz型域、Ras结合蛋白AF-6的PDZ域、蝎毒素(卡律蝎毒素(charybdotoxin))、C型凝集素域(四连凝集素 (tetranectin)),其综述见 Handbook of TherapeuticAntibodies (2007, Stefan Dubel 编)的第 7 章Non-Antibody Scaffolds and ProteinScience 15:14-27(2006)。本发明的表位结合域可以自任何这些备选的蛋白域衍生。更多“表位结合域”的例子是受体(特异性结合其配体)、凝集素(特异性结合多糖)、锌指和亮氨酸拉链(结合核酸)、酶(特异性结合其底物)、病毒和细菌(例如特异性结合其靶细胞)、核酸(特异性地彼此杂交)等。
涵盖的是，在本发明的一些实施方案中，所述结合域是治疗活性的。
“治疗活性”意味着结合域本身能够或认为能够在受试者中施加治疗效果，如例如，治疗有效的抗体，其减轻疾病的症状或起因，其治疗疾病，其能够预防疾病的发作，等坐寸ο
在一些实施方案中，所述治疗活性的结合域选自下组阿伦单抗、阿泊珠单抗、西妥昔单抗、依帕珠单抗、加利昔单抗、吉妥单抗、易普利单抗、拉贝珠单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、曲妥单抗、尼妥珠单抗、马帕木单抗、马妥珠单抗、rhMab ICR62、rhMab B-Lyl和帕妥珠单抗。
在一些实施方案中，还涵盖的是，所述受试者在取出所述组织样品和/或细胞子集前已经以治疗有效剂量接受所述结合域，即本发明的所述受试者在取出组织样品/细胞子集前已经包含治疗有效量的所述结合域。或者，本发明的受试者是在取出所述组织样品 /细胞子集前已经以治疗有效剂量接受本发明的结合域的受试者。
通过本发明，现在有可能同时组合结合域的两种不同性能，即(a)经由IHC检测技术可检测标记靶物的性能和(b)以治疗活性方式起作用的性能。因此，可以在IHC中使用的可检测标记的标志物和治疗活性剂可以是同一种实体。具体地，现在有可能在IHC背景中采用每种治疗性抗体，由此提高IHC结果的可靠性。例如，对某些肿瘤“分级”是标准的， 例如根据肿瘤标志物诸如HER2/neu的表达水平进行一通过本发明的实施方案可以改进这类测量的预后关联性，因为该测量现在用随后会应用(或预先已经应用)的治疗性抗体实施。由此，所得的IHC测量更精确地反映某种肿瘤靶物(其也被治疗性抗体“使用”)仍然在那里与否，是否可以假定用完全相同的抗体的后续治疗很可能会获得成功与否(例如 如果所述治疗性抗体使用的靶物仍然在那里，那么可以推测使用完全相同抗体的治疗应当具有更高的成功预期)。因此，将同一抗体用于两种不同的目的是重要的优点。也不需要开发在IHC背景中工作的特异性抗体，因为抗体在细胞子集/组织样品作为固定的对象前已经结合其靶物，等等。因此，结合反应抗体_靶物更紧密地反映实际情况。
另外，经福尔马林固定的经石蜡包埋的组织载玻片必须以特殊的方式加工，以得到用IHC抗体的最佳染色(例如，有必要通过加热和/或与特殊的酶一起温育来修复/暴露抗原I)。这类专门化的处理在应用本发明的教导后是不必要的，因为抗原性表位在受试者内或在细胞培养背景内呈现和结合，由此防止或减少如下的风险，即抗原在固定规程过程中被遮蔽(并且因而通过结合域检测不到或错误地检出)，由此潜在地破坏或改变指示所述靶物的存在、缺乏或表达程度的表位。
本发明还涉及如本文中限定的结合域在本文中限定的方法中的用途。
本发明还涉及如本文中限定的结合域用于制备要在本文中限定的方法中使用的组合物的用途。优选地，所述组合物是诊断用组合物，但是也涵盖药物组合物。
本发明还涉及要用于本文中限定的方法的如本文中限定的结合域。因此，在又一个方面，本发明涉及在本发明的免疫组织化学(IHC)方法中使用的对表征细胞子集的靶物特异性的结合域，该IHC方法包括离体检测所述细胞子集，其中所述结合域要在取出所述细胞子集前对包含或假定包含所述细胞子集的受试者施用。本发明还涉及在用于检测细胞子集的免疫组织化学(IHC)方法中使用的对表征细胞子集的靶物特异性的结合域，该方法包括离体检测所述细胞子集，其中所述细胞子集(或如本文中描述的组织样品)自在取出所述组织样品/细胞子集前已经接受本发明的结合域的受试者获得。
在本发明的一些实施方案中，所述细胞子集通过免疫组织化学，优选通过肓接免疫组织化学检测。
免疫组织化学(IHC)是通过使用直接标记(直接IHC)或间接标记(间接IHC)的结合域定位组织切片中的靶物(例如抗原)和/或呈现靶物的细胞子集，所述结合域经由特异性靶物_结合域相互作用与其靶物起反应。然后，通过提及的标记物显现这些相互作用。
主要有两种用于组织中抗原的免疫组织化学(IHC)检测的策略，即直接方法和间接方法。免疫组织化学染色的直接方法使用一种直接标记的结合域，其直接结合染色的靶物。因此，直接方法是一步染色方法，并且牵涉例如与组织切片中的抗原直接起反应的经标记的抗体(例如，缀合有FITC的抗血清)。此技术仅利用一种抗体，并且因此，规程是简单且快速的。已知此直接IHC方法就像其在本发明前使用以“常规形式”实施时具有由于很少的信号放大所致的灵敏度问题。推测这是由于以下事实，即靶物本身已经在固定步骤过程中改变，这显著降低“可检测”靶物的量，并且因此也降低可以结合并由此检测靶物的结合域的量。然而，令我们很惊讶，可以证明通过应用本发明的教导，即通过在检测前，并且由此在取出组织前，以及也在组织固定前将直接标记的结合域与靶物起反应，确实有可能甚至用直接标记的一级结合域检出靶物(即不需要通过特异性结合一级结合域的第二结合域“放大”信号)。
在本发明的其它实施方案中，通过间接免疫组织化学检测所述细胞子集。免疫组织化学染色的间接方法使用一种针对所探查的靶物的结合域，和针对第一结合域的经标记的第二结合域。涵盖如下的方法，其中所述结合域是抗体(一抗)，而所述检测实体是与该一抗(的标记物)特异性起反应的二抗。
间接方法牵涉与祀物起反应的一抗(第一层通常未标记)和与一级结合域起反应的经标记的二级结合域(第二层)。例如，二级结合域是针对已经生成一抗的动物物种的 IgG生成的。
还设想了在本发明方法的一些实施方案中，所述免疫组织化学的特征在于下列步骤
(a)提供含有包含细胞子集的所述组织样品和/或所述细胞子集的手段(例如载玻片)，所述细胞子集已经与结合域结合；
(b)任选地，固定所述组织样品；
(C)任选地，使所述组织样品脱水；
(d)任选地,允许该组织样品石腊化(paraffinize)；
(e)直接或间接检测结合域及由此所述细胞子集。
“歴定”意指适用于制备靶物/细胞子集/包含所述细胞子集的组织样品以进行随后的IHC规程的一种固定规程。特别地，为了确保保存组织构造和细胞形态学而实施“固定”。合适的固定条件是公知的，并且也在本文中公开。或者，还涵盖通过深度冷冻(例如在液氮中)保存组织/子集。
所有上述预处理步骤/措施都在术语“固定”的范围内，即固定明确包括用固定剂如甲醛、低聚甲醛的固定；和/或组织样品/细胞子集的深度冷冻，和/或任选地，还包括将组织/细胞子集在石蜡或类似的媒介物中包埋。必须理解的是，本发明的要点在于令人惊讶的发现，即允许结合域(例如对靶物特异性的一抗)在呈现所述靶物的组织/子集等进行固定规程前结合其靶物是有利的，因为固定规程可以影响靶物的量和/或质量，由此以不想要的方式改变结果。
也可以将组织/子集石蜡化(通常在固定后)。
将不同IHC方案投入实践的手段和方法是技术人员公知的，而且不用再费周折， 已经及会/可以对感兴趣的特定组织/细胞子集/靶物采用。下文列出了三种例示性方案， 然而，所述方案仅是例示性的，而并不意图限制本发明的范围。
A.细胞系
在无菌玻璃盖片或载玻片上将培养的细胞培养过夜
用PBS短暂清洗
期望时固定。可能的规程包括
用含10%福尔马林的PBS持续10分钟(保持湿润)
用冰冷的甲醇持续5分钟，允许风干
用冰冷的丙酮持续5分钟，允许风干
在PBS中清洗
B.冷冻的切片
将在O. C.T.化合物中包埋的新鲜组织在液氮或液氮中预冷的异戊烷中速冻。将冰冻块于-80° C贮存。
切出约4_8um厚的恒冷切片机切片，并将其在Superfrost plus载玻片或经明胶包被的载玻片上安放。将载玻片于-80° C贮存，直至需要。
在染色前，将载玻片于室温加热30分钟，并在冰冷的丙酮中固定5分钟。风干30 分钟。
在PBS中清洗。
C.石蜡切片
将切片在二甲苯中脱石蜡化，2x5分钟。
用100%乙醇水合，2x3分钟。
用95%乙醇水合，I分钟。19
优选的是，如下实施固定规程
将切片在二甲苯中脱石蜡化，约3x约I分钟；
用100%乙醇水合，约2x约I分钟；
用90%乙醇水合，约I分钟；
用80%乙醇水合，约I分钟；
用70%乙醇水合，约I分钟；
加水约I分钟。
用迈尔(Mayer)氏苏木精染色约I分钟
用流水清洗约O. 5分钟至2分钟
加水约10秒
用O. 1%曙红持续约I分钟
用70%乙醇水合，约5秒；
用80%乙醇水合，约10秒；
用90%乙醇水合，约10秒；
用100%乙醇水合，约10秒(在显微镜中检查切片)；
二甲苯，约I分钟。
上述方案中的术语“约”包括多至100%的偏差(就时间间隔而言)。还涵盖了被说成实施例如两次的步骤实施三次或仅一次，等等，技术人员完全知道有可能以一定程度修改上述方案。应当理解的是，上述方案仅充当用于实施成功的固定规程的准则。
涵盖的是，可以通过荧光显微术检查相应的切片。
我们对携带Calu3 (Her2阳性肿瘤)的小鼠注射50微克Cy5标记的赫赛汀、奥密塔克和柯耐尔。赫赛汀和奥密塔克是针对Her2的治疗性抗体(阳性对照组)，而柯耐尔是一种结合人IgE的抗体(阴性对照组)。注射后48小时，强荧光信号在经赫赛汀_Cy5和奥密塔克_Cy5处理的小鼠的肿瘤区中是可检出的，而柯耐尔_Cy5处理组在肿瘤中没有显示荧光信号(图la-c)。在体内成像后，将肿瘤外植，在福尔马林中固定，然后脱水，并在石蜡中包埋。将经石蜡包埋的组织切成2μπι切片，在显微镜载玻片上安放，并于39° C温育过夜。随后对外植的肿瘤组织的分析揭示了，Her2特异性抗体仅结合肿瘤细胞，而非鼠组织。 相比之下，用针对人IgE的对照抗体柯耐尔没有生成荧光信号(图3a-3c)。
为了验证经标记的抗体对肿瘤细胞的特异性结合，我们使用一种新开发的染色规程，其使得有可能从一块组织载玻片中获得明视野和荧光信息。使用常规的染色规程，需要两块连续的组织载玻片。用于苏木精(嗜碱结构)/曙红(嗜曙红结构)染色的一块载玻片提供了非常详细且构造精细的形态学概观。使用第二块载玻片来显现Cy5标记的抗体的荧光信号。这些常规方法的缺点在于两块组织载玻片的形态学差异和用于细胞核和细胞组织的荧光染色的额外准备时间。使用我们的新方法，可以从一块组织载玻片中得到这些信息。为此，我们改变现有Roche苏木精/曙红染色方案的浓度和温育时间。苏木精和曙红在荧光条件下显示激活，从而我们可以或多或少显现像在明视野测量中的相同形态学详情。凭借我们特殊的荧光照相机系统(Nuance;CRi)，有可能分开不同荧光体的荧光谱。这些多谱成像系统使用户即使在分子标志物共定位于单个组织切片中时仍能够将它们定量， 产生多标记物组织切片上每种单独的标记物的清楚且准确的图像。这些系统还为我们提供离析(unmix)和消除Nuance荧光图像中的自身荧光的有力能力，由此显著提高信噪比，并且改进结果的准确度。在新方法中，我们首先在明视野中测量组织载玻片的优化的苏木精 /曙红染色(图2a_2c)。然后，将同一载玻片区转换成荧光，并测量苏木精和曙红信号以及 Cy5标记的抗体信号。Nuance系统将这三种荧光信号与剩余的不想要的载玻片信息(例如， 自身荧光)分开，并将它们在一张图像中缝缀在一起(图3a-3c)。
因此，涵盖的是，优选地，如上文规定的那样实施本发明的方法。具体地，涵盖将细胞子集(优选地，其包含在组织样品中)用苏木精/曙红染色，随后用荧光检测装置(例如突光照相机系统(Nuance;CRi))或能够分开不同突光体的突光谱的相当系统(Olympus)分析。出于所述目的可以设计或使用的软件等是技术人员公知的。
一旦获得“信号”，证明所述信号真实反映靶物分布仍然是有点难度的事情。最简单的阴性对照是组织中缺乏表达，其中通过RNA酶保护知道靶物RNA不会表达，和如通过原位杂交看到的，表达限制于靶组织中已经表达RNA的区域。一种备选的阴性对照是通过将结合域与过量的其制备所用的肽或蛋白质一起预温育来消除信号。如果仅看到一条带，那么Western印迹可以提示相互作用的特异性；不过,优化Western印迹条件的困难应该证明免疫组织化学反应中的条件不及最佳的可能性。
涵盖的是，在本发明的方法中，所述检测进一步包括原位杂交技术，优选荧光原位杂交(FISH)。
本发明还涉及试剂盒，其包含如本文中限定的结合域，以及任选地，对受试者施用所述结合域的手段，和/或用本文中限定的方法检测所述结合域的手段。所述试剂盒可以进一步包含传单，其包含关于如何采用结合域，且特别是如何在本发明的方法中采用结合域的用法说明书。在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含如本文中描述的结合域 (所述结合域是经标记的，优选用荧光染料标记)，和另外施用手段，如例如注射器，稀释所述结合域的药学可接受载体等，和优选地，还有帮助技术人员对相应的受试者施用结合域的技术说明书(特别重要的是，结合域要在取出组织/细胞子集前施用)。所述试剂盒可以进一步包含在已经对受试者施用结合域后从所述同一受试者取出组织样品的手段，和/ 或固定取出的组织样品的手段，诸如允许固定取出的组织样品的缓冲剂和/或供随后的荧光显微术用的玻璃载玻片，和/或石蜡化取出的组织样品的石蜡，和/或除去石蜡的有机溶齐Li，等等。
本发明还涉及用于用对表征细胞子集的靶物特异性的结合域检测所述细胞子集的方法，所述方法包括体外检测所述细胞子集，其中所述结合域在所述细胞子集的固定前和/或在所述靶物的检测前已经结合其靶物。
本发明还涉及用于用对靶物特异性的结合域检测表征所述细胞子集的所述靶物的方法，所述方法包括体外检测所述靶物，其中所述结合域在所述细胞子集的固定前和/ 或在所述靶物的检测前已经结合其靶物。
另外/或者，可以使用如本文中定义的“用于检测细胞子集”的方法来
(i)鉴定倾向于有利地响应结合域的受试者(优选地，所述受试者是患有肿瘤的受试者)，或
(ii)监测疗法，优选地，基于结合域的抗癌/肿瘤疗法(即，结合域是治疗活性的)，或
(iii)鉴定能够体内结合靶物的结合域，
(iv)选择倾向于对以靶物为特征的肿瘤起治疗有效作用的结合域；
(V)将肿瘤分型(typify)。
会理解的是，如本文中使用的，术语“检测细胞子集”包括如下的情况，其中提及的细胞子集的并非所有(定量)个体细胞都被结合域结合(尽管这些细胞也以所述靶物为特征)。由于结合域在细胞块如肿瘤中积累有天然的限制，有可能并且因此涵盖的是，即并非所有限定细胞子集的靶细胞被结合域结合。
有利地，本发明的方法在疗法启动的时间点在体内同时允许验证靶物表达并证明治疗性抗体结合。因此，本发明的方法可以应用于患者的分层。在佐剂背景中，首先会用少量经标记的治疗性抗体处理患者。随后，会将肿瘤组织在约24至48小时后用手术取出，在福尔马林中固定，并包埋于石蜡中。可以通过基于近红外的显微术确认肿瘤关联抗原的表达和抗体对肿瘤细胞的特异性结合。
或者，对倾向于有利地响应结合域的受试者的鉴定可以被称为“分层医学 (stratified medicine)”。分层医学是对具有共享的生物学特征(例如如本文中限定的革巴物或细胞子集)的患者组的管理，其通过使用分子诊断测试选择最佳的疗法，从而对所述组实现最好的可能的医学结果来进行。例如，涵盖的是，为了治疗患者中的某种肿瘤，表征哪种结合域(例如有治疗活性或假定有治疗活性的单克隆抗体)对患者组或甚至对特定患者具有最好的结合特征。因此，通过采用本发明的实施方案，有可能找到对患者最好的结合域(个体化药学)。由此，本发明很大的优点在于治疗活性结合域(例如抗体)也可以用于基于IHC的检测，这导致反映实际体内情况的结果。体内情况意指可能的是，一些患者更有利地响应抗体A，而其他更有利地与抗体B起反应(由此，两种抗体对同一种靶物例如对 Her2/neU都是特异性的)。如此，结合特征的差异可以指导技术人员对给定的治疗情况(例如肿瘤)使用最好的可能的结合域。因此，可以对特定的患者特异性地选择结合域。例如， 涵盖的是提供均结合同一靶物的一组抗体，并且测试这些抗体中的哪个对相应的患者显示最有希望的结合特征(个体化医学)。
“监测疗法”包括现在有可能用治疗活性抗体监测给定靶物或以所述靶物为特征的细胞子集的存在、缺乏、过表达、表达不足，所述治疗活性抗体已经或者可以用于治疗以所述靶物和/或子集为特征的疾病。因此，例如现在有可能在患者中用特定抗体治疗肿瘤， 并且用同一种抗体监测疗法的“成功”。在这方面，涵盖的是，治疗性抗体是经标记的或至少部分标记的(例如总抗体群体的10%是经标记的，而剩余是未标记的)，并且时时监测体内响应。还涵盖的是，将治疗有效的，但未标记的抗体时时用处于标记形式的同一抗体替换以监测体内响应。
“鉴定能够体内结合靶物的结合域”意味着现在有可能提供一组结合域，(a)所述组是或假定是治疗有效的；或者(b)所述组包含或假定包含治疗有效的结合域，并且测试这些结合域是否能够结合相应的祀物，由此指示所述结合域在全体患者或患者亚组中或甚至仅在一名患者中(个体化鉴定)是治疗有效的。因此，有可能选择倾向于对肿瘤(该肿瘤以所述靶物为特征)治疗有效地起作用的结合域。
“将肿瘤分型”意味着评估肿瘤的状态，例如HER2/neu状态。
本发明还涉及结合域，优选地治疗有效的抗体，如例如阿伦单抗、阿泊珠单抗、西妥昔单抗、依帕珠单抗、加利昔单抗、吉妥单抗、易普利单抗、拉贝珠单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、曲妥单抗、尼妥珠单抗、马帕木单抗、马妥珠单抗、rhMab ICR62、rhMab B-Lyl和帕妥珠单抗等，包括其组合用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗倾向于有利地响应所述结合域的患者，如通过本文中描述的方法鉴定的。
本发明还涉及治疗活性结合域，优选治疗活性抗体如例如阿伦单抗、阿泊珠单抗、 西妥昔单抗、依帕珠单抗、加利昔单抗、吉妥单抗、易普利单抗、拉贝珠单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、曲妥单抗、尼妥珠单抗、马帕木单抗、马妥珠单抗、rhMab ICR62、rhMab B-Lyl和帕妥珠单抗等，包括其组合，其用于治疗倾向于有利地响应所述结合域的患者，如通过本文中描述的方法鉴定的。
图1-3 :使用经标记的赫赛汀(a)、奥密塔克(b)和柯耐尔(C)得到的体内NIRF信号强度(图la、b、c)和外植肿瘤组织的经福尔马林固定的/经石蜡包埋的HE组织载玻片 (图2a、b、c)的多谱成像(图3a、b、c)的关联。
图4-6 :体内和离体NIRF信号强度的关联。可以在Cy5标记的赫赛汀和奥密塔克的情况中在Her2阳性肿瘤中显现强体内荧光信号(图4a、4b)。用Cy5标记的爱必妥 (Erbitux)、抗IGF-IR和抗Her3不能检测到特异性荧光信号(图4c_4e)。外植的、经福尔马林固定且经石蜡包埋的肿瘤的离体分析确认这些结果。经标记的抗体的特异性结合仅可以在赫赛汀_Cy5和奥密塔克-Cy5的情况中显现，而爱必妥_Cy5、抗IGF_lR_Cy5和抗 Her3-Cy5在肿瘤细胞上未显示荧光信号(图6a_6e)。
图7 :图7A和图7B表明以绿色标示的Her2基因表达。无Her2基因表达的细胞已经被鉴定为鼠基质细胞。图7C和图7D表明Cy5标记的赫赛汀(抗Her2单克隆抗体)对表达Her2基因的肿瘤细胞的特异性结合。
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此公开内容结合附图可以得到最好地理解，所述附图通过提述并入本文。此外，通过以下实施例会更好地了解本发明及其许多优点，所述实施例作为例示给出而并不意图为限制性的。实施例
以下实施例例示了本发明。这些实施例不应解释为限制本发明的范围。实施例以例示的目的纳入，并且本发明仅由权利要求书限制。
实施例I
为了验证这些新方法，我们对携带CalU3(Her2阳性肿瘤)的小鼠注射50微克Cy5 标记的赫赛汀、奥密塔克和柯耐尔。赫赛汀和奥密塔克是针对Her2的治疗性抗体(阳性对照组)，而柯耐尔是一种结合人IgE的抗体(阴性对照组)。注射后48小时，强荧光信号在经赫赛汀_Cy5和奥密塔克-Cy5处理的小鼠的肿瘤区中是可检出的，而柯耐尔_Cy5处理组在肿瘤中没有显示荧光信号(图la-c)。在体内成像后，将肿瘤外植，在福尔马林中固定，然后脱水，并在石蜡中包埋。将经石蜡包埋的组织切成2 μ m切片，在显微镜载玻片上安放，并于39° C温育过夜。随后对外植的肿瘤组织的分析揭示了，Her2特异性抗体仅结合肿瘤细胞，而非鼠组织。相比之下，用针对人IgE的对照抗体柯耐尔没有生成荧光信号(图3a_3c)。
为了验证经标记的抗体对肿瘤细胞的特异性结合，我们使用一种新开发的染色规程，其使得有可能从一块组织载玻片中获得明视野和荧光信息。使用常规的染色规程，需要两块连续的组织载玻片。用于苏木精(嗜碱结构)/曙红(嗜曙红结构)染色的一块载玻片提供了非常详细且构造精细的形态学概观。使用第二块载玻片来显现Cy5标记的抗体的荧光信号。这些常规方法的缺点在于两块组织载玻片的形态学差异和用于细胞核和细胞组织的荧光染色的额外准备时间。使用我们的新方法，可以从一块组织载玻片中得到这些信息。 为此，我们改变现有Roche苏木精/曙红染色方案的浓度和温育时间。苏木精和曙红在荧光条件下显示激活，从而我们可以或多或少显现像在明视野测量中的相同形态学详情。凭借我们特殊的荧光照相机系统(Nuance;CRi)，有可能分开不同荧光体的荧光谱。这些多谱成像系统使用户即使在分子标志物共定位于单个组织切片中时仍能够将它们定量，产生多标记物组织切片上每种单独的标记物的清楚且准确的图像。这些系统还为我们提供离析和消除Nuance荧光图像中的自身荧光的有力能力，由此显著提高信噪比，并且改进结果的准确度。在新方法中，我们首先在明视野中测量组织载玻片的优化的苏木精/曙红染色(图 2a-2c)。然后，将同一载玻片区转换成荧光，并测量苏木精和曙红信号以及Cy5标记的抗体信号。Nuance系统将这三种荧光信号与剩余的不想要的载玻片信息(例如，自身荧光)分开，并将它们在一张图像中缝缀在一起(图3a_3c)。
实施例2
我们在第二项实验中证实了来自第一个实施例的结果。为此，使用相同实验背景， 但是用一些额外的Cy5标记的抗体(爱必妥、抗IGF-1R、抗_Her3)。来自赫赛汀_Cy5和奥密塔克_Cy5的强体内信号与组织载玻片中的强离体发信号相关联(图4a、4b、6a、6b)。另一方面，爱必妥-Cy5、抗IGF-1R-Cy5和抗Her3_Cy5未显示显著的体内和离体突光。体内和离体成像的结果与来自实施例I的先前显示的数据完全匹配。
实施例3
随后的研究的目的在于检验经标记的抗体是否特异性结合肿瘤细胞。已经使用来自图Ia的载玻片进行荧光原位杂交。使用此测定法，可以在经福尔马林固定的组织载玻片中检出Her2基因。图7b证明Cy5标记的抗Her2抗体(赫赛汀)仅结合表达Her2基因的细胞。
氺氺氺氺氺
会清楚的是，本发明可以以上述说明书和实施例中的具体描述以外的其它方式实践。根据上述教导，本发明的许多修改和变型是有可能的，并且因此在所附权利要求书的范围内。
在发明背景、发明详述和实施例中引用的每篇文件(包括专利、专利申请、期刊文章、摘要、实验室手册、书籍或其它公开内容)的全部公开内容在此通过提述并入本文。
权利要求
1.一种用于用结合域检测细胞子集的免疫组织化学(IHC)方法，所述结合域对表征所述细胞子集的靶物是特异性的，所述方法包括离体检测所述细胞子集，其中要在取出所述细胞子集前对包含或假定包含所述细胞子集的受试者施用所述结合域。
2.权利要求I的方法，其中所述细胞子集由肿瘤细胞构成。
3.权利要求I或2的方法，其中所述结合域是标记的，优选地用荧光标记物标记的。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述靶物是蛋白质、肽、酶、核酸、多糖、脂质、受体、细胞性靶物和/或肿瘤抗原。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述结合域是抗体。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中通过直接免疫组织化学检测所述细胞子集。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中通过间接免疫组织化学检测所述细胞子集。
8.权利要求7的方法，其中所述通过直接免疫组织化学检测包括检测所述(荧光)标记的结合域的存在。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者在取出所述组织样品前已经以治疗有效剂量接受所述结合域。
10.如前述权利要求中任一项限定的结合域在前述权利要求中任一项限定的方法中的用途。
11.如前述权利要求中任一项限定的结合域用于制备要在前述权利要求中任一项限定的方法中使用的诊断用组合物的用途。
12.如前述权利要求中任一项限定的结合域，其要在前述权利要求中任一项限定的方法中使用。
13.试剂盒，其包含如前述权利要求中任一项限定的结合域，和对受试者施用所述结合域的手段，以及任选地，用前述权利要求中任一项限定的方法检测所述结合域的手段。
14.如前述权利要求中任一项限定的方法，其用于(i)鉴定倾向于有利地响应治疗活性结合域的受试者，或( )监测疗法，或(iii)鉴定能够在体内结合靶物的结合域，或(iv)选择倾向于对以靶物为特征的肿瘤起治疗活性作用的结合域；或(V)将肿瘤分型(typifying)。
15.—种治疗活性结合域，如例如阿伦单抗(alemtuzumab)、阿泊珠单抗(apoIizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、加利昔单抗(galiximab)、吉妥单抗(gemtuzumab)、易普利单抗(ipilimumab)、拉贝珠单抗(Iabetuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、曲妥单抗(trastuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、rhMab ICR62、rhMabB-Lyl和帕妥珠单抗等,包括其组合,其用于治疗倾向于有利地响应所述结合域的患者，如通过前述权利要求中任一项的方法鉴定的。
全文摘要
本发明本质上涉及用对表征细胞子集的靶物特异性的结合域检测所述细胞子集的方法，所述方法包括离体检测所述细胞子集，其中要在取出所述细胞子集前对包含或假定包含所述细胞子集的受试者施用所述结合域。本发明还涉及如本文中限定的结合域在本文中限定的方法中的用途。还涵盖如本文中限定的结合域用于制备要在本文中限定的方法中使用的诊断用组合物的用途。在另一个方面，本发明涉及要在本文中限定的方法中使用的如本文中限定的结合域。还公开了试剂盒，其包含如本文中限定的结合域和对受试者施用所述结合域的手段，以及任选地，用本文中限定的方法检测所述结合域的手段。在另一个方面，本发明涉及结合域，优选地治疗有效的抗体，如例如阿伦单抗(alemtuzumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、加利昔单抗(galiximab)、吉妥单抗(gemtuzumab)、易普利单抗(ipilimumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、曲妥单抗(trastuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、rhMab ICR62、rhMab B-Ly1和帕妥珠单抗(pertuzumab)等，包括其组合用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗倾向于有利地响应所述结合域的患者，如通过本文中限定的方法鉴定的。
文档编号A61K39/395GK102939538SQ201180028948
公开日2013年2月20日 申请日期2011年5月9日 优先权日2010年5月7日
发明者M.多博兹, W.朔伊尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司