在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计的制作方法

在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计的制作方法【专利摘要】本发明提供的支架具有在各个结构域(例如CH2和CH3)不对称的重链，来实现超越用天然同源二聚体(对称)Fc分子的参与调节效应功能的各种Fc受体之间的选择性，和获得的变体Fc同源二聚体的增加的稳定性和纯度。这些新分子包含设计用于改变抗体起作用和其在治疗剂中找到用途的天然方式的异质组分的复合物。【专利说明】在Fe结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计[0001]1.介绍1.1交叉引用相关申请本申请根据美国法典第35篇第I19(e)条要求2010年11月5日提交的美国临时专利申请号61/410，746;2010年12月21日提交的美国临时专利申请号61/425，375;2011年2月3日提交的美国临时专利申请号61/439，341;2011年4月14日提交的美国临时专利申请号61/475，614;2011年5月31日提交的美国临时专利申请号61/491，846和2011年6月16日提交的美国临时专利申请号61/497，861的权益，所述申请中每一个都通过引用完整地并入本文。[0002]1.2关于序列表的声明本申请通过引用并入与本申请一起提交的序列表，所述序列表作为2011年11月4日创建的文本文件ZymeworksV84467W0.txt,其大小为15千字节。[0003]1.3.发明领域本发明一般提供多肽异源二聚体、其组合物、以及制备和使用所述多肽异源二聚体的方法。更具体而言，本发明涉及热稳定的多特异性抗体，包括双特异性抗体，其包含异源二聚的Fe结构域。[0004]1.4发明背景双特异性抗体是基于抗体的分子，其可以同时结合两个分离且不同的抗原(或相同抗原的不同表位)。双特异性抗体的一个用途是重新引导细胞毒性免疫效应细胞，例如通过抗体依赖细胞毒性(ADCC)以增强对肿瘤细胞的杀伤。在这种背景下，双特异性抗体的一个臂结合肿瘤细胞上的抗原，并且另一个臂结合效应细胞上表达的决定簇。通过交联肿瘤和效应细胞，所述双特异性抗体不仅在肿瘤细胞周围引入效应细胞，而且也同时引起其活化，造成有效杀死肿瘤细胞。双特异性抗体已经用于在肿瘤组织富集化学或放射治疗剂以最小化对正常组织的有害作用。这种情况下，双特异性抗体的一个臂与要破坏的靶向细胞上表达的抗原相结合，另一个臂递送化疗药物、放射性同位素或毒素。[0005]通常开发双特异性抗体的一个主要障碍是难于为临床前和临床研究生产足够质量和数量的材料。[0006]全长双特异性抗体的传统生产方法是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein等人，1983，Nature，305:537-539)。抗体分子的Fe部分二聚化的内在趋势导致形成最高达10个不同的由重链和轻链的各种组合组成的IgG分子的复杂混合物，其中只有一个具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤纯化正确分子，亲和层析相当烦琐，且产率较低。W093/08829和Traunecker等人，1991，EMBOJ.,10:3655-3659公开了相似程序。因此，使用传统的杂交瘤技术产生具有选择用于结合两个不同目标的两个Fab臂的双特异性抗体分子是具有挑战性的[SegalDM等人.(2001)JImmunolMethods.248,1-6.]。三功能抗体Catumaxomab是源自大鼠/小鼠四价杂交瘤(quadroma)的双特异性mAb,且在基于蛋白A柱的层析分离中基于pH依赖性洗脱实现该分子的纯化[LindhoferH.等人.(1995)JImmunol155，219-225]。[0007]另一个双特异性抗体生产的传统方法是将不同特异性的两种抗体或其片段进行化学缀合。然而，该方法也复杂，并且化学修饰过程可以使抗体失活或促进聚集。因为难以从不需要的产物中进行纯化，所得双特异性抗体的低产率和差质量使得所述过程不适合用于临床开发所需的大规模生产。此外，这些分子不可以维持常规的抗体构型。[0008]近期，多种异源二聚化技术已经用于提高双特异性抗体的生产。然而，单个异源二聚化结构域如Jun/Fos卷曲螺旋与scFv结构域的融合产生同或异源二聚体的混合物且需要通过重新折叠而装配(deKruif和Logtenberg,J.Biol.Chem.271:7630-4,1996)。scFv片段与全抗体的融合也用作二聚化方式(Coloma和Morrison,Nat.Biotechnol.15:159-63,1997)0然而，所述融合得到的大分子的实体组织穿透能力差。两个scFv片段融合在一起已经用于产生双特异性蛋白(如MicrometInc.,Bethesda,MD的BITE?抗体，美国专利号7，635，472)。然而，所述蛋白不含Fe区，并且因此无法通过Fe区操作它们的活性。另外，这些蛋白较小C55kDa)并且因此在血清中有相对短的半衰期。[0009]在其他异源二聚化技术中，双特异性抗体由在一条臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和在另一条臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。已发现，此种不对称结构有助于分离所需的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链的组合，因为免疫球蛋白轻链仅存在于一半双特异性分子中提供了一种容易的分离方案。这种方法参见W094/04690。产生双特异性抗体的进一步详情参见例如，Suresh等人，1986,MethodsinEnzymology，121:210。[0010]根据W096/27011所述的另一种方法，可以工程改造一对抗体分子，以最大程度提高由重组细胞培养物回收的异源二聚体的百分比。在这种方法中，用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代第一抗体分子CH3接口上的一个或多个较小氨基酸侧链。通过用较小氨基酸侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代较大氨基酸侧链，在第二抗体分子接口上产生与较大侧链相同或相似大小的补偿性“腔”。这提供了提高异源二聚体相对于其他不良终产物如同源二聚体的产率的机制[US00`5731168A,US007183076B2,RidgwayJB,PrestaLG,CarterP.ProteinEng1996Jul;9(7):617-21;AtwellS,RidgwayJB,WellsJA,CarterP.JMolBiol1997Jul4;270(1):26-35.]。Gunasekaran及其同事[GunasekaranK.等人.(2010)JBiolChem.285,19637-46]最近已经采用了互补静电设计策略来实现选择性异源二聚化目标。Davis及其同事[Davis,JH.等人.(2010)ProtEngDesSel;23(4):195-202]已经使用链交换工程改造的结构域(SEED)设计CH3结构域，其由交替的人IgA和IgGCH3序列的区段构成，且这些优先以异源二聚体形式结合。然而，所有这些技术产生的包含异源二聚体Fe区的抗体比亲本或野生型分子稳定明显更差。[0011]因此，在本领域中仍然存在对于替代的多特异性变体Fe异源二聚体、特别是变体CH3结构域的需要，其已经进行修饰以选择具有增加的稳定性和纯度的异源二聚体。[0012]2.发明概述根据本发明的一个方面，提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含变体CH3结构域，所述变体CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述异源二聚体Fe区进一步包含变体CH2结构域，所述变体CH2结构域包含促进FeY受体的选择性结合的不对称氨基酸修饰。在一个实施方案中，与野生型CH2结构域相比，变体CH2结构域选择性结合FeYIIIa受体。在一个实施方案中，变体CH3结构域具有约70°C或更高的熔解温度(Tm)。[0013]在另一个方面，提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含具有增加稳定性的变体CH3结构域，所述变体CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述变体CH3结构域具有约70°C或更高的熔解温度(Tm)。在一个实施方案中，相对于野生型Fe区，异源二聚体Fe区在CH3结构域中不包含额外的二硫键，更具体地，相对于野生型Fe区，异源二聚体Fe区在CH3结构域中不包含额外的二硫键。在可替代的实施方案中，相对于野生型Fe区，异源二聚体Fe区在变体CH3结构域中包含额外的二硫键，条件是约70°C或更高的熔解温度(Tm)是在额外的二硫键不存在的情况下。在又另一个实施方案中，相对于野生型Fe区，异源二聚体Fe区在变体CH3结构域中包含额外的二硫键，且其中所述变体CH3结构域具有约77.5°C或更高的熔解温度(Tm)。[0014]在一个实施方案中，提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含具有增加稳定性的变体CH3结构域，所述变体CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述变体CH3结构域具有约70°C或更高的熔解温度(Tm)且所述异源二聚体Fe区具有高于约90%的纯度，或者所述异源二聚体Fe区具有约95%或更高的纯度，或者所述异源二聚体Fe区具有高于约98%或更高的纯度。[0015]在一个实施方案中，也提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含具有增加稳定性的变体CH3结构域，所述变体CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述变体CH3结构域具有约70°C或更高的熔解温度(Tm)或者Tm是约71°C或更高或者Tm是约74°C或更高。在另一个实施方案中，异源二聚体Fe区具有约98%或更高的纯度且Tm是约73°C或者其中所述异源二聚体Fe区具有约90%或更高的纯度且Tm是约75°C。[0016]在某些实施方案中，提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y和Y407A，所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366A和K409F。在一个方面，第一CH3结构域多肽或第二CH3结构域多肽包含T411、D399、S400、F405、N390或K392位的进一步氨基酸修饰。T411位的氨基酸修饰选自T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W。D399位的氨基酸修饰选自D399R、D399W、D399Y或D399K。S400位的氨基酸修饰选自S400E、S400D、S400R*S400K。F405位的氨基酸修饰选自F4051、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W。N390位的氨基酸修饰选自N390R、N390K或N390D。K392位的氨基酸修饰选自K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E。[0017]在某些实施方案中，提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y和Y407A，所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366V和K409F。[0018]在另一个实施方案中，提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰Y407A，所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366A和K409F。在一个方面，第一CH3结构域多肽或第二CH3结构域多肽包含进一步氨基酸修饰K392E、T411E、D399R和S400R。在另一个方面，第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰D399R、S400R和Y407A且第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366A、K409F、K392E和T411E。在进一步实施方案中，变体CH3结构域具有约74°C或更高的熔解温度(Tm)且异源二聚体具有约95%或更高的纯度。[0019]在另一个实施方案中，提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含L351位的氨基酸修饰和氨基酸修饰Y407A，所述第二CH3结构域多肽包含T366位的氨基酸修饰和氨基酸修饰K409F。在一个方面，L351位的氨基酸修饰选自L351Y、L3511、L351D、L351R或L351F。在另一个方面，Y407位的氨基酸修饰选自Y407A、Y407V或Y407S。在又另一个方面，T366位的氨基酸修饰选自T366A、T3661、T366L、T366M、T366Y、T366S、T366C,T366V或T366W。在一个实施方案中，变体CH3结构域具有约75°C或更高的熔解温度(Tm)且异源二聚体具有约90%或更高的纯度。[0020]在另一个实施方案中，提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含F405位的氨基酸修饰和氨基酸修饰L351Y和Y407V，所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T394W。在一个方面，第一CH3结构域多肽或第二CH3结构域多肽包含K392、T411、T366、L368或S400位的氨基酸修饰。F405位的氨基酸修饰是F405A、F4051、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W。K392位的氨基酸修饰是K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E。T411位的氨基酸修饰是T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W。S400位的氨基酸修饰是S400E、S400D、S400R或S400K。T366位的氨基酸修饰是T366A、T3661、T366L、T366M、T366Y、T366S、T366C、T366V或T366W。L368位的氨基酸修饰是L368D、L368R、L368T、L368M、L368V、L368F、L368S和L368A。[0021]在另一个实施方案中，提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和`Y407V，所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T394W。在一个方面，第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366L或T366I。[0022]在又另一个实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰F405A和Y407V，所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T3661、K392M和T394W。[0023]在某些实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰F405A和Y407V，所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366L、K392M和T394W。[0024]在另一个实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰F405A和Y407V，所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366L和T394W。[0025]在另一个实施方案中提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰F405A和Y407V，所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366I和T394W。[0026]在异源多聚体的某些实施方案中，提供了双特异性抗体或多特异性抗体。[0027]在另一个实施方案中，提供了包含本发明的异源多聚体和药学可接受载体的组合物。[0028]在另一个实施方案中，提供了包含编码本发明的异源多聚体的核酸的宿主细胞。[0029]在某些实施方案中，提供了异源多聚体，其中所述异源多聚体包含至少一种治疗性抗体。在一个方面，所述治疗性抗体选自阿巴伏单抗(abagovomab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿伦珠单抗、aurograb、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗(belimumab)、贝伐珠单抗、briakinumab、卡那单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、塞舍珠单抗(certolizumabpegol)、西妥昔单抗、达克珠单抗、地舒单抗(denosumab)、依法珠单抗、加利昔单抗(galiximab)、吉妥珠单抗奥佐米星、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗、英利昔单抗、伊匹木单抗、鲁昔单抗、美泊利单抗、莫他珠单抗、莫罗单抗、mycograb、那他珠单抗、尼妥珠单抗、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、培妥珠单抗、雷珠单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗、替利珠单抗(teplizumab)、托珠单抗/atlizumab、托西莫单抗、曲妥珠单抗、ProxiniumTM、RencarexTM、优特克单抗和扎芦木单抗(zalutumumab)。[0030]在本发明的异源多聚体的另一个实施方案中，提供了在患有由癌抗原表征的癌症的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的异源多聚体施用于所述患者。[0031]在本发明的异源多聚体的另一个实施方案中，提供了在患有由免疫抗原表征的免疫病症的患者中治疗免疫病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的异源多聚体施用于所述患者。[0032]在又另一个实施方案中，提供了分离的包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含具有增加稳定性的变体CH3结构域，所述变体CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，并且其中所述变体CH3结构域选自表1、表6和表7中所列变体。[0033]3.附图概述图1是显示CH3(顶部)、CH2(中部)和受体区域的野生型抗体的图示3-D结构。在左手侧上的虚线矩形扩展至右手侧，其显示CH3的靶区的两个区域，区域I和区域2；图2是显示368位的野生型残基的图示3-D代表；图3是显示突变的368位的区域I的图示3-D代表；图4是显示区域2中额外突变的图示3-D代表；图5是对于前三种变体AZ1、AZ2和AZ3的碰撞评分、接口面积差异、包装差异、静电能差异和整体“亲和力评分”的计算机芯片上计算值的表格；图6是显示“构建在”变体AZl上的变体AZ2和AZ3的图示3-D图像；图7显示AZ2和AZ3变体的图示3-D代表；图8显示如图5中但对于AZ1、AZ2和AZ3异源二聚体和同源二聚体的表格。亲和力评分对于同源二聚体是不相关的，所以没有显示关于同源二聚体的该方面的评分；图9是野生型(左)和突变的AZ4(右)的3-D代表的图示；图10显示如图5且显示对于AZ4异源二聚体和同源二聚体的计算机上芯片计算值的表格；图11是CH3变体AZ5(左)和AZ6(右)的图示；图12如图5所述且显示对于AZ4、AZ5和AZ6的计算机上芯片数据的表格；图13是抗体在左侧的图示3-D代表，具有使用异源二聚方法在受体区域的结合特征的可能性的绘图；图14是IgG分子的图不；图15显不FeY受体的多重序列比对。Genebank/Uniprot序列ID:FcYRIIA(spP12318),FeyRIIB(spP31994),FeyRIIC(gi126116592),FeyRIIIA(spP08637)、FeyRIIIB(sp075015)；图16是Fc-FcYRIIIb复合物的晶体结构的图示[PDBID:1T83,Radaev&Sun]。Fe和Fey受体的1:1复合物观察到在Fe和FeYR的两条链之间具有不对称接触；图17显示基于不对称Fe支架的替代多功能分子的图示:不对称Fe支架和不对称Fe单体IgG臂；图18显示基于不对称Fe支架的替代多功能分子的图示:不对称Fe单特异性IgG臂和不对称Fe双特异性IgG臂(共用轻链)；图19显示基于不对称Fe支架的替代多功能分子的图示。不对称Fe双特异性IgG臂和功能分子如毒素；图20显示基于不对称Fe支架的替代多功能分子:不对称Fe单一scFv臂和不对称Fe双特异性scFv臂；图21显示基于不对称Fe支架的替代多功能分子:不对称Fe三特异性scFv臂和不对称Fe四特异性scFv臂。[0034]图22显示了为了更好的FcyR选择性在Fe的一面不对称设计突变引入了用于FcyR相互作用的产生侧面和具有野生型样相互作用的非产生面。可以引入Fe的非产生面上的突变以阻断与FcR的相互作用和Fe偏好极性，以便只在产生面上相互作用。[0035]图23显示了野生型人IgGl的氨基酸序列。[0036]图24显示Fe异源二聚体设计的迭代过程，其组合如下详述的阳性和阴性设计策略。[0037]图25显示用来确定异源二聚体纯度的体外测定。该测定基于具有不同分子量的两条Fe重链的全长单特异性抗体支架；重链A具有C-末端His标记(His)且重链B具有C末端可裂解的mRFP标记(RFP)。两条重链A(His)和B(RFP)连同固定量的轻链以不同的相对比率进行表达，产生具有不同分子量的3种可能的二聚体种类:a)同源二聚体链A(His)/链A(His)Cl50kDa);b)异源二聚体链A(His)/链B(RFP)Cl75kDa);c)同源二聚体链B(RFP)/链B(RFP)C200kDa)。表达后，如实施例2中所述，通过非还原性SDS-PAGE确定异源二聚体相比于两种同源二聚体的比例，其允许通过分子量分开3种二聚体种类。用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶。[0038]图25A.测试的变体是仅WT链A(His);仅WT链B(RFP);WT链A(His)加链B(RFP);对照I链A(His)加链B(RFP)，其具有>95%的报道的异源二聚体纯度。用针对如上所述针对IgG-Fc(抗Fe)、mRFPTag(抗mRFP)和HisTag(抗His)的抗体通过Western印迹验证二聚体条带的组成。SDS-PAGE显示对于His/His同源二聚体的单一条带，对于His/RFP异源二聚体的双条带和对于RFP同源二聚体的多条带。多条带是mRFP标记的人工产物且已被证实不影响Fe异源二聚体的物理特性。[0039]图25B.以公开的Fe异源二聚体变体对照1_4作为对照验证SDS-PAGE测定，参见表A。以不同的链A(His)vs链B(RFP)的相对比例表达变体:具体而言，分别地，比例1:3等于25%、10%、65%的LC、HC_His、HC_mRFP比例；比例1:1等于25%、20%、55%的LC、HC_His、HC_mRFP比例且比例3:1等于25%、40%、35%的LC、HC_His、HC_mRFP比例(链A(His)与链B(RFP)的表观1:1表达对于WTFe已经确定为接近20%/55%(His/RFP))。[0040]图25C.显示非还原SDS-PAGE测定以确定支架I变体的异源二聚体纯度。以不同的链A(His)vs链B(RFP)的相对比例表达Fe变体，且如图2中所述通过非还原SDS-PAGE进行分析。具体而言，分别地，比例1:3等于25%、10%、65%的LC、HC_His、HC_mRFP比例；匕匕例1:1等于25%,20%,55%的LC、HC_His、HC_mRFP比例且比例3:1等于25%,40%,35%的LC、HC_His、HC_mRFP比例(链A(His)与链B(RFP)的表观1:1表达对于WTFe已经确定为接近20%/55%(His/RFP))。[0041]图26显示以链A(His)vs链B(RFP)的特定比例表达Fe的异源二聚体变体(参见表2)，通过蛋白A亲和层析纯化且如图25中所述通过非还原SDS-PAGE进行分析。[0042]图26A说明如何基于目视检查SDS-PAGE结果而将不同的变体分级为纯度分类中。为了比较，将等量的蛋白A纯化的产物上样至凝胶上。已经通过对选择的变体的LC/MS验证了该基于非还原SDS-PAGE的纯度的定义(参见图28)。[0043]图26B支架I和2(AZ94、AZ86、AZ70、AZ33和AZ34)的选择的蛋白A纯化的异源二聚体变体的实施例SDS-PAGE结果。[0044]图27说明用来测定CH3-CH3结构域的熔解温度的DSC分析，其中使用了两种独立方法。[0045]图21L将热谱图拟合至4次独立的Non-2-State-转换且进行优化以产生接近于Herc印tin的报道文献值?72°C(CH2)和?82°C(Fab)的CH2和Fab转换值。[0046]图27B.将异源二聚体变体的均一和基线校正的热谱图从WT中减去，以产生仅对于CH3转换的正负差峰值。[0047]图28说明如实施例2中所述的实例变体AZ70的LC/MS分析。注明了糖基化异源二聚体和同源二聚体的预期(计算的平均值)质量。与异源二聚体质量一致的区域含有对应于损失甘氨酸(-57Da)和添加I个或2个己糖(分别为+162Da和+324Da)的主峰。如果没有对应于任一种同源二聚体的明显峰，那么异源二聚体纯度被归类为>90%。[0048]图29显示图29AWTFe；图29BAZ6；图29CAZ33；图29DAZ19的CH3接口。如详述部分所述的计算机芯片上的综合分析和变体与WT的比较表明，初始AZ33异源二聚体的稳定性低于WT稳定性的原因之一是Y407和T366的核心相互作用/包装的损失。初始AZ33显示如图29B所示的在该疏水核心处的非最佳包装，表明该区域、尤其是T366位的优化可以改进AZ33的稳定性。这一点在图29C和图29D中以T366I与T366L进行说明。实验数据与这种结构分析相关且显示T366L给出了Tm的最大改进。参见，实施例5。[0049]图30说明在初始支架I变体AZ8例举的构象动力学分析的实用性和重要性。在计算机芯片上诱变后的结构(接近WT的骨架构型)与50ns分子动力学模拟分析的代表性结构相叠加。该图突出了AZ8变体相比于WT的环区域D399-S400的较大构象差异，其进而将疏水核心暴露于溶剂且引起AZ8异源二聚体的稳定性降低。[0050]图31说明来自计算机芯片上综合分析和MD模拟的信息如何用于所述阳性设计策略。如图30中所示，AZ8稳定性低于WT稳定性的原因之一是环399-400与409的减弱的相互作用，这主要是由于F405包装相互作用的损失(参见图31A(WT)vsFig31B(AZ8)的比较)。阳性设计策略之一是优化区域的疏水性包装以稳定399-400环构象。这通过图31C中所示的K392M突变而实现。图31C代表异源二聚体AZ33，其具有74°的Tm，相比之下，初始阴性设计变体AZ8具有68°的Tm。[0051]图32说明使用分子动力学轨迹的主成分分析观察到的Fe分子的动力学。图32A显示作为参考的Fe结构的骨架轨迹。图32B和C代表沿Fe结构中顶部2种主要运动方式观察到的动力学重叠。链A和B的CH2结构域表现出相对于彼此明显的开/关运动，而CH3结构域是相对刚性的。CH3接口处的突变影响CH2结构域中这种开/关运动的相对灵活性和动力学。[0052]图33说明两个支架2变体相比于WT的疏水核心包装。图33AWTFe;图338AZ63；和图33CAZ70。初始支架2变体的计算机芯片上的综合分析表明，Y407-T366核心WT相互作用的损失是初始支架2变体的稳定性低于WT稳定性的原因之一。Y407-T366的损失被突变K409F部分补偿，但如图33B中所示，特别地T366A突变留下疏水核心中的腔，这使变体相比于WT不稳定。如图33C中的Fe变体AZ70所示，由额外突变T366V_L351Y靶向该疏水核心证明是成功的；AZ70具有75.5°C的实验确定的Tm。参见，表4和实施例6。[0053]图34说明两个支架2变体相比于WT的环399-400的相互作用:图34AWTFe；图34BAZ63;和图34CAZ94。初始支架2变体的计算机芯片上的综合分析表明，由于突变K409F的WT盐桥K409-D399的损失(图34A)和因此不满意D399(图34B)引起399-400环的更力口’开放的’构象。这进而导致疏水核心的更大的溶剂暴露和变体相比于WT的进一步的不稳定。用于稳定399-400环且补偿K409-D399相互作用损失的策略之一是设计如图34C对于变体AZ94所示的额外的盐桥D399R-T411E和S400R-K392E。实验数据显示>95%的纯度和74°C的Tm。参见，表4和实施例6。此外，尽管AZ94与初始支架2变体(纯度〈90%，Tm71°C)相比具有相当高的纯度和稳定性，但是与AZ70变体中鉴定的“最佳”疏水核心突变相比，AZ94的疏水核心突变是次优选的(图33)。由于AZ70中疏水核心的突变(T366V_L351Y)在环399-400处的AZ94的盐桥突变的远端，所以预期AZ70氨基酸突变和额外的AZ94突变的组合具有比AZ70或AZ94更高的熔解温度。可以如实施例1_4中所述测试该组八口o[0054]图35说明同源二聚的IgGlFe、异源二聚的变体hetl(对照I):A:Y349C_T366S_L368A_Y407V/B:S354C_T366ff和het2(对照4):A:K409D_K392D/B:D399K_D356K与六种Fcy受体结合的结合常数(Ka(M—1))。与野生型IgGlFe相比，异源二聚的Fe变体趋向于显示与Fey受体结合的轻微改变。参见,实施例7。[0055]图36A显示基于野生型结合强度作为参考，野生型IgGlFe和它的各种同源二聚体和不对称突变体形式与IlbF、IIBY和IIaR受体的相对结合强度。(HomoFe+S267D)是指同源二聚的Fe与两条链上的S267D突变的结合强度。(HetFe+asymS267D)是指同源二聚的Fe与Fe中两条链之一中引入S267D突变的结合强度。报道了通过在两条Fe链中任一条上引入突变而获得的结合强度的平均值。在一条链上引入该突变将结合强度降低至对于同源二聚形式中相同突变观察到强度的约一半。(HetFe+asymS267D+asymE269K)是指同源二聚的Fe与两条Fe链之一上以不对称方式中引入S267D和E269K突变的结合强度。E269K突变阻断了FcGR与Fe的一个面的相互作用，且能够将结合强度降低对于不对称S267D变体(HetFc+S267D)本身所观察到的结合强度的约一半。此处的HetFe是由图35中对于变体het2(对照4)所指出的CH3突变构成。[0056]图36B显不各种Fe及其变体与多种FcgRIIa、FcgRIIb和FcgRIIIa同种异型的结合常数(Ka(Ml)。野生型IgGlFe对于各种Fcg受体的Ka以具有水平阴影的柱表示。具有垂直阴影的条(同源二聚体基础2)代表异源二聚体Fe与突变S239D/D265S/I332E/S298A的Ka。具有倾斜阴影的柱代表同源二聚体Fe与CH2结构域中不对称突变A:S239D/D265S/I332E/E269K和B:S239D/D265S/S298A的Ka。不对称突变的引入能够实现IIIa和Ila/IIb受体之间的增加的选择性。此处的异源二聚体Fe是由图35中对于变体het2(对照4)所指出的CH3突变构成。[0057]图36C显示野生型IgGl和Fe区的CH2结构域中涉及同源二聚或不对称突变的三种其他变体的结合常数(Ka(if1))。野生型IgGl的Ka以网格阴影的柱表示。Fe变体与在Fe的两条链上以同源二聚方式(同源二聚体基础I)中引入的基础突变S239D/K326E/A330L/I332E/S298A的Ka以倾斜模式的柱显示。在异源二聚的Fe(异源二聚基础I)的链A和B中以不对称方式引入相关突变以水平线显示。具有垂直阴影线的柱代表包括E269K突变的不对称变体(异源基础1+PD)。此处的异源二聚体Fe是由图35中对于变体het2(对照4)所指出的CH3突变构成。[0058]图37-表6是基于如实施例5中对于支架I所述的第三设计阶段的变体CH3结构域的列表。[0059]图38-表7是基于如实施例6中对于支架2所述的第三设计阶段的变体CH3结构域的列表。`[0060]4.详述本发明提供了包含促进异源二聚体形成的特定氨基酸修饰的修饰的CH3结构域。在一个实施方案中，修饰的CH3结构域包含促进异源二聚体形成的特定氨基酸修饰(参见，例如表I)。在另一个实施方案中，修饰的CH3结构域包含具有增加稳定性的促进异源二聚体形成的特定氨基酸修饰(参见，例如表4、表6和表7)。将稳定性测量作为CH3结构域的熔解温度(Tm)，并且增加的稳定性是指约70°C或更高的Tm。CH3结构域形成异源多聚体或双特异性抗体的Fe区的部分。因此，在一个实施方案中，本文提供了包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含修饰的或变体CH3结构域，所述修饰的或变体CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述变体CH3结构域选自表I所列变体。在第二个实施方案中，提供了包含异源二聚体Fe区的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区包含具有增加稳定性的变体CH3结构域，所述变体CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述变体CH3结构域具有约70°C或更高的熔解温度(Tm)。[0061]可以用来生成修饰的CH3结构域的氨基酸修饰包括，但不限于，氨基酸插入、缺失、取代、和重排。CH3结构域的修饰和修饰的CH3结构域在本文中被统称为“CH3修饰”、“修饰的CH3结构域”、“变体CH3结构域”或“CH3变体”。可以将这些修饰的CH3结构域并入选择的分子。相应地，在一个实施方案中，提供了分子，特别是多肽，更具体地免疫球蛋白(例如，抗体)和其他结合蛋白，其包含并入修饰的CH3结构域的Fe区(如本文所使用的“Fe区”和类似术语包括包含CH3结构域的至少部分的任何重链恒定区结构域)。包含含有修饰的CH3结构域(例如，包含一个或多个氨基酸插入、缺失、取代、或重排的CH3结构域)的Fe区的分子在本文被称为“Fe变体”、“异源二聚体”或“异源多聚体”。本Fe变体包含已经不对称修饰的CH3结构域以产生异源二聚体Fe变体或区域。Fe区是由两个重链恒定结构域多肽-链A和链B-构成，所述链A和链B可以交换使用，条件是每个Fe区包含一个链A和一个链B多肽。将氨基酸修饰以不对称方式引入CH3，当两个修饰的CH3结构域形成Fe变体时导致异源二聚体(见，例如，表I)。如本文所使用的，不对称的氨基酸修饰是其中在一种多肽(例如，“链A”)上特定位置的氨基酸不同于异源二聚体或Fe变体的相同位置的第二种多肽(例如，“链B”)上的氨基酸的任何修饰。这可以是来自对Fe变体的链A和链B的两个不同氨基酸的两个氨基酸中仅一个的修饰或两个氨基酸的修饰的结果。可以理解的是，变体CH3结构域包含一个或多个不对称的氨基酸修饰。[0062]除非另有说明，在本说明书中，任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值，适当时也包括其分数值(如整数的十分之一和百分之一)。除非另有说明，本文所使用的“约”指所述范围、数值、序列或结构的±10%。应理解，除非另有说明或上下文注明，本文所用术语“一个”和“一种”指“一个或多个”所列举的组分。替代物的使用(例如“或”)应理解为所述替代物中的一个、两个或其任何组合。本文所使用术语“包括”和“包含”可以作为同义词使用。此外，应理解衍生自本文所述结构和取代物(如变体CH3结构域)的各种组合的单个单链多肽或异源二聚体就好像各单链多肽或异源二聚体单独列出那样相同的程度被本申请所公开。因此，特定组分形成单个单链多肽或异源二聚体的选择属于本发明范围内。[0063]“第一多肽”是与第二多肽结合的任何多肽，在本文中也称为“链A”。第一和第二多肽在“接口”处相遇。“第二多肽”是经由“接口”与第一多肽结合的任何多肽，在本文中也称为“链B”。“接口”包含在第一多肽中与第二多肽的接口中的一个或多个“接触”氨基酸残基相互作用的那些“接触”氨基酸残基。如本文所使用的，接口包含Fe区的CH3结构域，其优选源自IgG抗体,最优选人IgG1抗体。[0064]如本文所使用，“分离的”异源多聚体意味着已经鉴定和从其天然细胞培养环境的组分中分离和/或回收的异源多聚体。其天然环境的污染组分是可干扰所述异源多聚体的诊断或治疗性用途的物质，可以包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶质。[0065]变体Fe异源二聚体一般纯化至基本上同质性。短语“基本上同质”、“基本上同质形式”和“基本上同质性”用来表明产物基本上没有源自不需要的多肽组合的副产物(例如，同源二聚体)。在纯度的方面表示，基本上同质性是指副产物的量不超过10%，优选为低于5%，更优选低于I%，最优选低于0.5%，其中所述百分比以重量计。[0066]抗体【
技术领域：
】技术人员理解的术语各自具有所述领域获得的含义，除非本文作明确的不同定义。已知抗体具有变体区、铰链区和恒定结构域。有关免疫球蛋白结构和功能的综述参见例如Harlow等人编，Antibodies:ALaboratoryManual,第14章ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,1988)。[0067]在通过平衡稳定性相比于特异性的蛋白工程改造的背景中通过阳性和阴性设计的概念显示从野生型同源二聚体设计变体Fe异源二聚体，其中以当多肽在细胞培养条件中表达时驱动异源二聚体形成超过同源二聚体形成为目标引入突变。通过在一条链引入大侧链且在另一条链引入小侧链，例如Genentech开发的把手进孔(Knobs-1nto_holes)策略(RidgwayJB,PrestaLG,CarterP.‘Knobs-1nto-holes’engineeringofantibodyCH3domainsforheavychainheterodimerization.ProteinEng.1996Jul;9(7):617-21;AtwellS,RidgwayJB,WellsJA,CarterP.Stableheterodimersfromremodelingthedomaininterfaceofahomodimerusingaphagedisplaylibrary.JMolBiol.270(1):26-35(1997)))，或通过导致排斥同源二聚体形成的静电工程改造，例如Amgen开发的静电转向策略(GunaskekaranK，等人.EnhancingantibodyFeheterodimerformationthroughelectrostaticsteeringeffects:applicationstobispecificmoleculesandmonovalentIgG.JBC285(25):19637-19646(2010))阴性设计策略使对同源二聚体形成不利的相互作用最大化。在这两个实例中，将阴性设计不对称点突变引入野生型CH3结构域以驱动异源二聚体形成。迄今为止，只有阴性设计策略已经用于开发Fe异源二聚体。公开的结果显示，仅使用阴性设计方法设计的异源二聚体导致具有>95%异源二聚体的高特异性，但是使复合物相当不稳定(同上)。这些阴性设计异源二聚体具有69°C或更低的修饰的CH3结构域的熔解温度，与野生型相比，不存在额外的二硫键。参见下面的表A。[0068]表A:公开的Fe异源二聚体抗体【权利要求】1.分离的异源多聚体，其包含异源二聚体Fe区，其中所述异源二聚体Fe区包含具有增加稳定性的变体CH3结构域，所述CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述变体CH3结构域具有约70°C或更高的熔解温度(Tm)。2.分离的异源多聚体，其包含异源二聚体Fe区，其中所述异源二聚体Fe区包含变体CH3结构域，所述CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，其中所述异源二聚体Fe区进一步包含变体CH2结构域，所述变体CH2结构域包含不对称氨基酸修饰以促进Fey受体的选择性结合。3.根据权利要求2所述的分离的异源多聚体，其中与野生型CH2结构域相比，所述变体CH2结构域选择性结合FeYIIIa受体。4.根据权利要求2或权利要求3所述的分离的异源多聚体，其中所述变体CH3结构域具有约70°C或更高的熔解温度(Tm)。5.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中相对于野生型Fe区，所述异源二聚体Fe区在CH3结构域中不包含额外二硫键。6.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中相对于野生型Fe区，所述异源二聚体Fe区在变体CH3结构域中包含额外二硫键，条件是所述约70°C或更高的熔解温度(Tm)是在不存在额外二硫键的情况下。7.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中相对于野生型Fe区，所述异源二聚体Fe区在变体CH3结构域中包含额外二硫键，且其中所述变体CH3结构域具有约77.5°C或更高的熔解温度(Tm)。8.根据权利要求1-3中任一项`所述的分离的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区具有大于约90%的纯度。9.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区具有约95%或更高的纯度。10.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区具有约98%或更高的纯度。11.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中所述Tm为约71°C或更闻。12.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中所述Tm为约74°C或更闻。13.根据权利要求1-3中任一项所述的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区具有约98%或更高的纯度，且所述Tm为约73°C。14.根据权利要求1-3中任一项所述的异源多聚体，其中所述异源二聚体Fe区具有约90%或更高的纯度，且所述Tm为约75°C。15.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体，其中第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y和Y407A且第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366A和K409F。16.根据权利要求15所述的分离的异源多聚体，其中所述第一CH3结构域多肽或所述第二CH3结构域多肽在位置T411、D399、S400、F405、N390、或K392包含进一步氨基酸修饰。17.根据权利要求16所述的分离的异源多聚体，其中所述T411位的氨基酸修饰选自T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W。18.根据权利要求16所述的分离的异源多聚体，其中所述D399位的氨基酸修饰选自D399R、D399W、D399Y或D399K。19.根据权利要求16所述的分离的异源多聚体，其中所述S400位的氨基酸修饰选自S400E、S400D、S400R、或S400K。20.根据权利要求16所述的分离的异源多聚体，其中所述F405位的氨基酸修饰选自F4051、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W。21.根据权利要求16所述的分离的异源多聚体，其中所述N390位的氨基酸修饰选自N390R,N390K或N390D。22.根据权利要求16所述的分离的异源多聚体，其中所述K392位的氨基酸修饰选自K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E。23.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y和Y407A且第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366V和K409F。24.根据权利要求1中任一项所述的分离的异源多聚体，其中第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰Y407A且第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366A和K409F。25.根据权利要求24所述的分离的异源多聚体，其中所述第一CH3结构域多肽或所述第二CH3结构域多肽包含进一步氨基酸修饰K392E、T411E、D399R和S400R。26.根据权利要求24所述的分离的异源多聚体，其中所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰D399R、S400R和Y407A且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366A、K409F,K392E和T411E。27.根据权利要求24-26中任一项所述的分离的异源多聚体，其中所述变体CH3结构域具有约74°C或更高的熔解温度(Tm)且所述异源二聚体具有约95%或更高的纯度。28.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体，其中第一CH3结构域多肽在L351和Y407位包含氨基酸修饰且第二CH3结构域多肽包含T366位的氨基酸修饰和氨基酸修饰K409F。29.根据权利要求28所述的分离的异源多聚体，其中所述L351位的氨基酸修饰选自L351Y、L3511、L351D、L351R或L351F。30.根据权利要求28所述的分离的异源多聚体，其中所述Y407位的氨基酸修饰选自Y407A,Y407V或Y407S。31.根据权利要求28所述的分离的异源多聚体，其中所述T366位的氨基酸修饰选自T366A、T3661、T366L、T366M、T366Y、T366S、T366C、T366V或T366W。32.根据权利要求28-31中任一项所述的分离的异源多聚体，其中所述变体CH3结构域具有约75°C或更高的熔解温度(Tm)且所述异源二聚体具有约90%或更高的纯度。33.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体，其中第一CH3结构域多肽包含F405位的氨基酸修饰和氨基酸修饰L351Y和Y407V且第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T394W。34.根据权利要求33所述的分离的异源多聚体，其中所述第一CH3结构域多肽或所述第二CH3结构域多肽在位置K392、T411、T366、L368或S400包含氨基酸修饰。35.根据权利要求33所述的分离的异源多聚体，其中所述F405位的氨基酸修饰是F405A、F4051、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W。36.根据权利要求34所述的分离的异源多聚体，其中所述K392位的氨基酸修饰是K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E。37.根据权利要求34所述的分离的异源多聚体，其中所述T411位的氨基酸修饰是T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W。38.根据权利要求34所述的分离的异源多聚体，其中所述S400位的氨基酸修饰是S400E、S400D、S400R、或S400K。39.根据权利要求34所述的分离的异源多聚体，其中所述T366位的氨基酸修饰是T366A、T3661、T366L、T366M、T366Y、T366S、T366C、T366V或T366W。40.根据权利要求34所述的分离的异源多聚体，其中所述L368位的氨基酸修饰是L368D、L368R、L368T、L368M、L368V、L368F、L368S和L368A。41.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体，其中第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V且第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T394W。42.根据权利要求41所述的分离的异源多聚体，其中所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366L或T366I。43.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰F405A和Y407V且第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T3661、K392M和T394W。44.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰F405A和Y407V且第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366L、K392M和T394W。45.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰F405A和Y407V且第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366L和T394W。46.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰F405A和Y407V且第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366I和T394W。47.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中变体CH3结构域包含选自表4中所列变体的氨基酸突变。48.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中变体CH3结构域包含选自表6中所列变体的氨基酸突变。49.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的异源多聚体，其中变体CH3结构域包含选自表7中所列变体的氨基酸突变。50.分离的异源多聚体，包含异源二聚体Fe区，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y和Y407A且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366A和K409F。51.根据权利要求50所述的分离的异源多聚体，其中所述第一CH3结构域多肽或所述第二CH3结构域多肽在位置T411、D399、S400、F405、N390、或K392包含进一步氨基酸修饰。52.根据权利要求51所述的分离的异源多聚体，其中所述T411位的氨基酸修饰选自T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W。53.根据权利要求51所述的分离的异源多聚体，其中所述D399位的氨基酸修饰选自D399R、D399W、D399Y或D399K。54.根据权利要求51所述的分离的异源多聚体，其中所述S400位的氨基酸修饰选自S400E、S400D、S400R、或S400K。55.根据权利要求51所述的分离的异源多聚体，其中所述F405位的氨基酸修饰选自F4051、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W。56.根据权利要求51所述的分离的异源多聚体，其中所述N390位的氨基酸修饰选自N390R,N390K或N390D。57.根据权利要求51所述的分离的异源多聚体，其中所述K392位的氨基酸修饰选自K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E。58.分离的异源多聚体，包含异源二聚体Fe区，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y和Y407A且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366V和K409F。59.分离的异源多聚体，包含异源二聚体Fe区，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰Y407A且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366A和K409F。60.根据权利要求59所述的分离的异源多聚体，其中所述第一CH3结构域多肽或所述第二CH3结构域多肽包含进一步氨基酸修饰K392E、T411E、D399R和S400R。61.根据权利要求59所述的分离的异源多聚体，其中所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰D399R、S400R和Y407A且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366A、K409F,K392E和T411E。62.根据权利要求59-61中任一项所述的分离的异源多聚体，其中所述变体CH3结构域具有约74°C或更高的熔解温度(Tm)且所述异源二聚体具有约95%或更高的纯度。63.分离的异源多聚体，包含异源二聚体Fe区，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含L351位的氨基酸修饰和氨基酸修饰Y407A且所述第二CH3结构域多肽包含T366位的氨基酸修饰和氨基酸修饰K409F。64.根据权利要求63所述的分离的异源多聚体，其中所述L351位的氨基酸修饰选自L351Y、L3511、L351D、L351R或L351F。65.根据权利要求63所述的分离的异源多聚体，其中所述Y407位的氨基酸修饰选自Y407A,Y407V或Y407S。66.根据权利要求63所述的分离的异源多聚体，其中所述T366位的氨基酸修饰选自T366A、T3661、T366L、T366M、T366Y、T366S、T366C、T366V或T366W。67.根据权利要求63-66中任一项所述的分离的异源多聚体，其中所述变体CH3结构域具有约75°C或更高的熔解温度(Tm)且所述异源二聚体具有约90%或更高的纯度。68.分离的异源多聚体，包含异源二聚体Fe区，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含F405位的氨基酸修饰和氨基酸修饰L351Y和Y407V且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T394W。69.根据权利要求68所述的分离的异源多聚体，其中所述第一CH3结构域多肽或所述第二CH3结构域多肽在位置K392、T411、T366、L368或S400包含氨基酸修饰。70.根据权利要求68所述的分离的异源多聚体，其中所述F405位的氨基酸修饰是F405A、F4051、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W。71.根据权利要求69所述的分离的异源多聚体，其中所述K392位的氨基酸修饰是K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E。72.根据权利要求69所述的分离的异源多聚体，其中所述T411位的氨基酸修饰是T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W。73.根据权利要求69所述的分离的异源多聚体，其中所述S400位的氨基酸修饰是S400E、S400D、S400R、或S400K。74.根据权利要求69所述的分离的异源多聚体，其中所述T366位的氨基酸修饰是T366A、T3661、T366L、T366M、T366Y、T366S、T366C、T366V或T366W。75.根据权利要求69所述的分离的异源多聚体，其中所述L368位的氨基酸修饰是L368D、L368R、L368T、L368M、L368V、L368F、L368S和L368A。76.分离的异源多聚体，包含异源二聚体Fe区，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T394W。77.根据权利要求76所述的分离的异源多聚体，其中所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366L或T366I。78.分离的异源多聚体，包含异源二聚体Fe区，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰F405A和Y407V且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T3661、K392M和T394W。79.分离的异源多聚体，包含异源二聚体Fe区，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰F405A和Y407V且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366L、K392M和T394W。80.分离的异源多聚体，包含异源二聚体Fe区，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰F405A和Y407V且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366L和T394W。81.分离的异源多聚体，包含异源二聚体Fe区，其中所述异源二聚体Fe区包含第一CH3结构域多肽和第二CH3结构域多肽，所述第一CH3结构域多肽包含氨基酸修饰F405A和Y407V且所述第二CH3结构域多肽包含氨基酸修饰T366I和T394W。82.根据权利要求1-3、50、58、59、63、68、76、78、79、80或81中任一项所述的异源多聚体，其中所述异源多聚体是双特异性抗体。83.根据权利要求1-3、50、58、59、63、68、76、78、79、80或81中任一项所述的异源多聚体，其中所述异源多聚体是多特异性抗体。84.组合物，包含根据权利要求1_3、50、58、59、63、68、76、78、79、80或81中任一项所述的异源多聚体和药学可接受的载体。85.宿主细胞，包含编码根据权利要求1_3、50、58、59、63、68、76、78、79、80或81中任一项所述的异源多聚体的核酸。86.根据权利要求1-3、50、58、59、63、68、76、78、79、80或81中任一项所述的分离的异源多聚体，其中所述异源多聚体包含至少一种治疗性抗体。87.根据权利要求1所述的分离的异源多聚体，其中所述异源多聚体包含至少一种选自下列的治疗性抗体:阿巴伏单抗、阿达木单抗、阿伦珠单抗、aurograb、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐珠单抗、briakinumab、卡那单抗、卡妥索单抗、塞舍珠单抗、西妥昔单抗、达克珠单抗、地舒单抗、依法珠单抗、加利昔单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、戈利木单抗、替伊莫单抗、英利昔单抗、伊匹木单抗、鲁昔单抗、美泊利单抗、莫他珠单抗、莫罗单抗、mycograb、那他珠单抗、尼妥珠单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、培妥珠单抗、雷珠单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗、替利珠单抗、托珠单抗/atlizumab、托西莫单抗、曲妥珠单抗、ProxiniumTM、RencarexTM、优特克单抗和扎芦木单抗。88.治疗患有由癌抗原表征的癌症的患者中的癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求86的异源多聚体施用于所述患者。89.治疗患有由免疫抗原表征的免疫病症的患者中的免疫病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求86的异源多聚体施用于所述患者。90.分离的异源多聚体，包含异源二聚体Fe区，其中所述异源二聚体Fe区包含具有增加稳定性的变体CH3结构域，所述变体CH3结构域包含促进异源二聚体形成的氨基酸突变，且其中所述变体CH3结构域选自表1、表6或表7中所列的变体。【文档编号】A61K39/395GK103429620SQ201180064119【公开日】2013年12月4日申请日期:2011年11月4日优先权日:2010年11月5日【发明者】E.E.卡雷拉,T.S.冯克罗伊登施泰因,S.B.迪克西特,P.I.拉里奥,D.K.Y.潘,I.E.P.德安吉洛申请人:酵活有限公司