专利名称：一种bmp2/7异源二聚体结构类似物及其表达方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种BMP2/7异源二聚体结构类似物及其表达方法与应用。
背景技术：
近年来全球的骨折发病率有不断攀升的趋势，据世界卫生组织统计，骨骼、关节疾病是全世界头号损害公众健康的疾病之一，在过去十年，全球骨折人数增长了一倍，50岁以上的妇女有40％有骨折的危险。从骨折发病的各国情况来看，发病率的差异不大这说明骨折的发生不存在地域的差别，而且越来越威胁到人们的健康。
骨组织因其自身组织结构的生长特性。一旦发生大面积缺损、骨不连、骨组织萎缩、吸收、骨折、愈合不良等病变后，其自身难以再生修复，而给患者带来极大痛苦，因此，医学界研究出多种植骨术，以使其达到理想的治疗效果，如自体骨移植，同种异体骨移植，人工骨植入，人工材料植入等，这些治疗方法虽各具优点，但因各自存在的不可完善的缺陷，而难以达到理想的治疗效果。
此外，据有关资料测算，牙病是世界上发病率最高的三种病之一，位居牙病发病率前三位的疾病分别是龋齿、牙周病与牙颌畸形。龋齿“虫牙”，在我国发病率约为50％-90％，世界卫生组织已将龋病、癌症和心血管病并列为当代危害人类健康的三大疾病，我国目前龋齿发病率在40％-50％；牙周病包括牙龈炎和牙周炎，牙龈炎患病率为72％左右，牙周炎患病率为50％左右；牙颌畸形是指最常见的前牙拥挤(牙排列不齐)、上颌前突(暴牙齿)、下颌前突(地包牙)等，有资料表明，我国目前青少年牙颌畸形发病率为40％左右。因此，寻找一种新型的治疗口腔疾病的药物也十分重要。
1965年美国的骨科医师Urist首先发现脱钙骨能在异位诱导新骨形成。经过进一步的分析实验证明这种能在异位诱导新骨形成的物质是蛋白质。为此，他将这些蛋白质命名为骨形态发生蛋白，并指出在骨组织里自然存在这种蛋白质，它们在需要时负责骨的再生和修复。1979年他领导的小组率先从兔脱钙骨中成功地分离纯化了兔的BMP-2。1988年又成功地克隆出了多个人BMP的基因，为今后用基因工程的方法大规模生产这种在天然骨中含量极微少的蛋白奠定了坚实的基础。
骨形态发生蛋白(Bone Mophogenetic Protein，BMP，又称骨形成蛋白)是动物体内细胞分泌的一种活性因子，其本质是由氨基酸组成的蛋白质，隶属于一个超家族，目前已发现的BMP有十几种，其生理活性十分广泛，参与了动物由胚胎发育成为成体的整个过程。BMP诱导成骨能力十分突出，可使断骨快速再接和缺骨快速再生，在骨科、口腔科和矫形外科具有广泛的应用前景，可为千百万伤残者恢复形态和功能提供新的治疗手段。同时，最新的报道显示，BMP还可用于白血病、乳腺癌等疾病的治疗，疗效均十分乐观。
一般认为，BMP家族中BMP-2、4、7的活性最高，其中BMP-2的产业化研究最为广泛。BMP-2基因的开放阅读框为1888bp，编码的蛋白质为396个氨基酸，氨基末端均含有一段信号肽序列，有四个可能的氨基末端连接的糖基化位点，其中三个在同一位置，成熟肽由114个氨基酸组成，通过三个二硫键维持其构象。活性形式的BMP-2以二聚体形式存在，两个游离巯基形成一个二硫键将两个单体连接。人BMP7 cDNA含有一个1293bp的开放读框，编码431个氨基酸的BMP7蛋白。在编码的第一个蛋氨酸后面是一段疏水性氨基酸信号肽序列。
但是无论哪一种形式的BMP蛋白都有一个致命的弱点rhBMP的诱骨活性需要超生理剂量，实验小鼠的剂量为微克级，对人体的用量要达到毫克级，目前市场上1mg rhBMP-2的价格在人民币3000-4000元左右，一个病人一个疗程的治疗费用可能需要数万元，显然难以推广，严重制约了产品的市场生命力。此外，采用哺乳动物细胞系统表达，虽然活性有所提高，但生产成本更高，因此，如何提高BMP的活性显得十分重要。
1990年，Sampath等人从牛脱矿骨粉分离到一种蛋白，分子量约30,000左右，体内与体外都有明显的骨生成作用。还原型SDS-PAGE电泳则发现该蛋白由两个亚基组成，分别为18,000与16,000左右，经脱糖基处理后，分子量为16,000与14,000，测序后发现前者为BMP-7，后者为BMP-2，均为糖蛋白，但糖基化对二者的活性没有影响。表明天然状况下，就有BMP-2/7异源二聚体的存在。AkiAono等人的研究表明体内组织中BMP主要以异源二聚体的形式存在，而且较同源二聚体具有更高的活性。
目前表达重组异源二聚体的方法主要有三种1.大肠杆菌表达系统中，分别表达两种BMP蛋白，将纯化后得到的包含体按一定比例混合并进行变复性处理，得到具有活性的异源二聚体；2.哺乳动物细胞或酵母表达系统中，在同一宿主细胞内同时转染两种基因，共同表达后在细胞内装配成异源二聚体；3.哺乳动物细胞表达系统中，还可以利用双顺反子载体同时表达两种蛋白，并装配成异源二聚体。但上述方法的主要问题在于产物中往往混有两种同源二聚体，而且因为同源二聚体与异源二聚体的性质相似，分离纯化十分困难，同时也降低了产量，增加了成本。
发明内容
本发明的目的是公开一种BMP2/7异源二聚体结构类似物，该结构类似物由BMP2和BMP7蛋白通过一段连接肽融合而成，具有天然BMP2/7异源二聚体的活性功能，而且活性明显优于其他BMP蛋白。
本发明的另一目的是公开了基因工程技术表达该结构类似物的方法，通过该方法可大规模稳定高效地生产得到的该结构类似物。
本发明的进一步目的是公开了该结构类似物在制备治疗组织损伤和骨骼损伤药物中的应用。
本发明公开的BMP2/7异源二聚体结构类似物，该结构类似物由BMP2和BMP7蛋白通过一段连接肽融合而成，具有天然BMP2/7异源二聚体的活性功能，而且活性明显优于其他BMP蛋白。该结构类似物，N端到C端的次序为BMP2-连接肽-BMP7，请见SEQ ID NO2，也可以为BMP7-连接肽-BMP2，请见SEQ ID NO4。
连接肽由2到50个氨基酸组成，优选采用Gly与Ser两种氨基酸，通常采用多个(GlyGlyGlyGlySer)串连起来使用，在本发明中，选择由四个即(GlyGlyGlyGlySer)4作为连接肽使用。该连接肽的侧链基团影响小，肽键的刚性很小，可以自由旋转，有极强的柔顺性，不会阻碍两侧肽链的自由折叠。通过基因重组的方式将BMP-2与BMP-7的用一段连接肽(GlyGlyGlyGlySer)4串连起来国内外是首次。
本发明还公开了基因工程技术生产该结构类似物的方法，通过该方法可在不同的表达系统大规模稳定高效地生产得到的该结构类似物。主要步骤包括(1)获得编码该结构类似物的核苷酸序列获得该序列的方法通常采用RT-PCR从人源细胞的总RNA中反转录扩增获得，考虑到大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、动物细胞等不同的表达系统对密码子有不同的偏好，因此也可以根据采用设计多对引物通过PGR方法获得不同密码子偏好的全基因，也可以交由基因合成的专业公司进行全基因的合成。一般而言，在不改变氨基酸序列的情况下，核苷酸序列的碱基突变率不超过30％。
在本发明的实施例中，该结构类似物的核苷酸序列是由具有毕氏酵母偏好的密码子组成。
(2)将所获的序列克隆到适当的表达载体构建重组表达载体采用常规的分子克隆技术，如通过限制性内切酶和连接酶可以将目的序列克隆到相应的载体中。根据不同的表达系统，可以对载体进行不同的选择，即可以是质粒载体，也可以是病毒载体。
本发明所采用表达载体是piczα质粒载体系列，优选的piczαA或piczαB或piczαC.。
(3)将重组载体转化到适当的宿主细胞中发酵表达选择的宿主细胞可以是大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本发明优选的宿主细胞为毕氏酵母、酿酒酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母或裂殖酵母等，最佳的是毕氏酵母。
(4)收集表达的目的产物，离子交换层析获得高纯度的结构类似物本发明优选的是FPLC Heparin Sepharose 4B亲和柱，Tris-HCl与NaCl组成的缓冲体系进行线性梯度洗脱，收集洗脱峰，透析除盐后冻干保存，SDS-PAGE电泳如图4所示。
本发明还公开了含有该结构类似物和医药上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物。所说的赋形剂可以是白蛋白，所说的载体可以是各种生物或人工合成材料，如胶原海绵、β磷酸三钙、骨水泥、纤维蛋白、壳聚糖等，或上述材料的各种复合物，优选地采用胶原海绵。
本发明还公开了该药物组合物在治疗组织损伤和骨骼损伤中的应用，主要是在骨组织、软骨组织和牙齿等方面的损伤和修复。
以下对本发明的技术内容进行进一步的描述1.BMP2/7异源二聚体结构类似物本发明描述了编码人BMP2与BMP7蛋白所形成的异源二聚体结构类似物为该两种蛋白通过一个柔性的连接肽连接而成的融合蛋白，其融合顺序可以是BMP2位于N端，也可以是BMP7位于N端，即BMP2-连接肽-BMP7，如SEQ ID NO2，也可以为BMP7-连接肽-BMP2，如SEQ ID NO4。连接肽的长度优选是2-100个氨基酸，更优选是5-50个氨基酸，最优选为14-30个氨基酸，长度可以短至两个蛋白大分子之间的空间位阻最小，在本发明的实施例中我们给出的是(GlyGlyGlyGlySer)4，且BMP2位于N端。
融合蛋白可以是胞内表达，例如在大肠杆菌表达系统中，但需要通过包含体变复性的方式进行。也可以是分泌型，例如酵母与哺乳动物细胞表达系统。在实施例中我们优选地采用毕赤酵母中分泌表达的方式。
在实施例中，DNA核苷酸序列编码骨形态发生蛋白异源二聚体BMP2/7，其核苷酸序列至少有90％与SEQ ID NO1同源且编码同样的氨基酸序列SEQ ID NO2。优选地，多核苷酸序列至少有95％与序列SEQ ID NO1同源且编码同样的氨基酸序列。其中，由该SEQ ID NO1核苷酸序列编码的氨基酸序列即BMP2/7异源二聚体结构类似物氨基酸序列为SEQ ID NO2。
与上述的核苷酸有一定程度的序列相似性的核苷酸是指例如，能编码一种BMP2/7蛋白异源二聚体结构类似物，并在相似的核苷酸序列之间具有至少90％的序列同源性的核苷酸，并也是编码BMP2/7蛋白异源二聚体结构类似物的核苷酸序列。其包括核苷酸链上每百个核苷酸至多有10个点突变；或是说即便有多达10％的核苷酸个体可以被替换、删除或插入等，无论是在5’或3’端，或在两端之间的任何位点发生的突变，还是以单体或二聚体的突变等；均在本发明所述的范围内，均属于本发明所指的核苷酸序列。
实践上，任何特指的核酸分子，只要具有90％至100％的相似性，优选的是95％至100％的相似性且编码如SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的所示的氨基酸序列，就在本发明的保护范围内。而且由核苷酸序列编码的BMP2/7蛋白类似物也可由常规一直的计算机软件获得。当应用软件或其它任何类似的DNA序列对比分析时，某一特定的序列如与本发明所提出的序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO3有90％以上的序列同源性，优选的是95％以上的序列同源性，均视为与本发明所述的序列相同。
2.用于表达异源二聚体结构类似物的重组细胞本发明中的异源二聚体结构类似物核苷酸序列可利用重组克隆技术引入宿主细胞，以使类似物得到表达。
一般来说，经过生物工程方法将携带有本发明中所提到的各种可能组合的类似物核苷酸序列的重组载体质粒以侵入方式转入宿主细胞中，形成重组细胞。宿主细胞包括，但不局限于，哺乳动物细胞、细菌与酵母等。重组细胞可以在含常规营养物的培养基中培养。以适当的方式控制选择转化子和扩增编码类似物的核苷酸的培养条件，如温度、pH值和选择不同的表达细胞株。
按本发明所述，重组载体携带有包含编码类似物的核苷酸。重组载体可以是一个表达载体，可以在宿主细胞内由携带的核苷酸编码来表达融合蛋白。形式可为，骨形态发生蛋白-骨形态发生蛋白或骨形态发生蛋白-连接肽-骨形态发生蛋白。宿主细胞包括，但不局限于，哺乳动物细胞、细菌与酵母等。
编码类似物的核苷酸是在适当的启动子作用下表达类似物蛋白的。可利用的适合启动子包括，但不局限于，腺病毒启动子、CMV、RSV启动子、MMT启动子、白蛋白启动子以及TK启动子或反转录病毒LTR启动子等。也可以用天然启动子来控制核苷酸编码表达类似物蛋白。
按本发明所述，重组载体携带有包含编码BMP2/7结构类似物的核苷酸。重组载体为表达载体，可以在重组细胞内由携带的核苷酸编码序列来表达融合蛋白。
在本发明中提到的BMP2/7异源二聚体结构类似物，优选地使用基因工程技术来表达。获得结构类似物蛋白的优选方法是利用重组载体，通过转化和转染或感染地方式来表达。
在本发明所提供的实施例中，给出的是利用可转化酵母的表达载体，来转化毕赤酵母(Pichia)，并使类似物蛋白分泌到培养基中。
利用酵母表达类似物的优势为，酵母系统允许产生高质量成熟的类似物蛋白，并分泌到培养基中便于纯化。利用酵母表达分泌型蛋白的优点为，但不局限于，高表达产量，蛋白质为可溶性，正确的折叠和易于大规模生产和纯化。
本发明优选的酵母包括，但不局限于，酿酒酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母、汉逊酵母(Hansenula)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)和裂殖酵母(Schizosaccharomtces Pombe)等。更优选地，宿主细胞可为毕赤酵母，而转化该宿主细胞的载体优选的为pPICZα-A、B、C。
BMP2/7异源二聚体结构类似物可经由骨形态发生蛋白天然信号分泌到酵母菌培养液中。在本发明的一实施方案中，天然的酿酒酵母的α-因子分泌信号肽使结构类似物蛋白分泌到酵母菌外的培养基中。酵母表达的类似物蛋白分泌到培养液中是可溶性的，避免了由酵母细胞抽提物中分离纯化蛋白的难题，因为酵母细胞是难于裂解的。另外，分泌出的蛋白质纯度也易于提高，因为由酵母分泌的蛋白仅占全部酵母蛋白的0.5-1％，而且酵母安全无毒。
3.BMP2/7异源二聚体结构类似物在制备骨折治疗药物方面的应用本发明还公开了用各种生物或人工合成材料为载体，携带BMP2/7异源二聚体结构类似物，治疗各种组织疾病。
根据本发明这一目的优选的实施方案，其中所说的组织主要是骨组织、软骨组织和牙齿。
根据本发明这一目的优选的实施方案，其中所说的材料主要是但不局限于胶原蛋白。
BMP2/7类似物蛋白在植入人体后，很快被扩散稀释或酶解吸收，难以在新骨形成的全过程中充分发挥其诱导成骨作用，因此需要有合适的载体，在成骨中发挥支架作用的同时使BMP得到缓慢的释放。
BMP从载体中释放速率会显著地影响骨诱导速率及功效，这是因为BMP的局部浓度主要取决于它从载体的释放动力学，合适的载体能将足够量的BMP保持于所需的部位充足的时间，诱导骨的形成。BMP的释放动力学表现为特征性的二阶段模式，第一阶段为“爆发”释放，第二阶段为持续释放。BMP的初始“爆发”释放可以形成浓度梯度，大量趋化诱导骨祖细胞至骨缺损部位，保留在局部的因子促使细胞分化为成骨细胞表型。
BMP从载体上释放的速率取决于下列四个关键因素①因子对载体的亲合性，源于静电相互作用，疏水作用力和氢键等非特异性的化学作用力；②载体的几何形状，包括载体体积(界定扩散距离)和表面积(确定于暴露于环境中的因子量)，载体的微几何特征，诸如载体孔隙率、孔隙的通孔率和孔隙尺度；③因子释放机理，包括载体的降解和经载体扩散，单一系统中可能有不同的释放规律，与载体的材料与负载因子的方法有关，比如将BMP简单地附着在载体表面，还是在载体表面固定化；④宿主局部微环境，如局部血管化，细胞密度、局部pH值、离子浓度等都会影响蛋白质释放。
根据上述四点中的前三点，本发明所用的载体材料必须具备①生物相容性，使宿主不发生或仅发生轻微的炎症反应，使骨诱导的干扰因素最小化；②生物降解性，在体内以水解的方式降解，产生天然的中间代谢产物排出体外；③可吸收性，使残余载体对于骨修复生物机制特性的影响最小化。
本发明优选的载体为胶原蛋白，它具有原有良好的组织相容性和可吸收性，用胶原作为BMP的载体，可避免复合材料的移动，防止被过快吸收，具有缓释作用。另外，胶原中含有一些生长因子，可以协同促进BMP的成骨作用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明首次在体外获得重组BMP2/7异源二聚体结构类似物，其活性不亚于天然BMP2/7异源二聚体，且优于其他BMP蛋白，生产成本更低更高效，应用范围广泛。
图1为BMP-2、BMP-7以及BMP-2/7在质粒载体pUC18中的克隆；图2为BMP-2、BMP-7以及BMP-2/7在酵母表达载体pPicZaA中的克隆；图3为BMP-2、BMP-7以及BMP-2/7在酵母中的诱导表达；图4为纯化后的BMP-2/7异源二聚体结构类似物；图5为BMP2、BMP7、BMP2/7体外诱导C2C12细胞表达ALP(n＝12)；图6为BMP2、BMP7、BMP2/7体外诱导C2C12细胞表达Osteocalcin(n＝12)；图7为小鼠后肢肌袋异位骨形成(术后14天)大体观(箭头所指为异位骨)；图8为术后14天异位骨组织结构图(HE染色)；图9为新西兰兔桡骨大尺度骨缺损修复实验X线片手术后7周时效果对比图，其中，图1中，1λDNA/HindIII；5100bp ladder；2pUC-BMP2/EcoRI+HindIII；3第二轮PCR产物；4第一轮PCR产物；5pUC-BMP7/EcoRI+HindIII；7第二轮PCR产物；8第一轮PCR产物；9pUC-BMP2/7/EcoRI+HindIII；10第二轮重叠延伸PCR产物。
图2中，1λDNA/HindIII；2pPicZaA-bmp2-7/XbaI+XhoI；3pPicZaA-bmp7/XbaI+XhoI；4pPicZaA-bmp2/XbaI+XhoI；5100bp ladder。
图3中，1GS115/bmp-7 induced；2GS115/bmp2-7 induced；3GS115/bmp-2induced；4蛋白质相对分子质量标记；5GS115/bmp2-7 uninduced；(图中星号所示为目的条带)。
图4中，1蛋白质相对分子质量标记；2BMP-2/7异源二聚体结构类似物。
图7中，A.对照侧；B.BMP2/7植入侧；C.双后肢。
图8中，肌肉组织中有骨组织形成，中间有骨小梁和大量炎症细胞A，B为不同视野中肌肉组织异位骨形成的情况。
图9中，A1BMP-2/7复合胶原组第0天；A2BMP-2/7复合胶原组第3周；A3BMP-2/7复合胶原组第7周；B1对照组第0天；B2对照组第3周；B3对照组第7周。
具体实施例方式
所有实施例中的培养基及分子生物学操作方法为该领域技术人员所熟悉，可以参照《分子克隆实验手册》(Maniatis等，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，美国，1989)及“精编分子生物学实验指南”(美/F.奥斯伯登著，颜子颖登译，北京，科学出版社，1998)。
实施例1.骨形态发生蛋白-2基因的合成(1)引物设计根据GeneBank中已公开的BMP-2蛋白成熟肽的编码基因序列，参照美国Invitrogen公司提供的毕赤酵母酵母氨基酸密码子偏好表(http//www.invitrogen.com/contentFrame.cfm？pageID＝100contentPage＝http//invitrogen.custhelp.com/)，在不改变氨基酸顺序的前提下，利用密码子第三位碱基的摇摆性，将原基因中的稀有密码子替换。具体措施是设计2对引物将整个编码基因覆盖，其序列是经过偏好性调整的，引物相互之间都有18个碱基的互补配对，序列如下F25’＞ATCGGAATTCATGCAAGCCAAGCACAAGCAGCGTAAGCGTCTGAAGTCCTCCTGTAAGAGACACCCTTTGTACGTTGACTTCTGTGACGTTGGTTGGAACGAC＜3’
F15’＞GACGTTGGTTGGAACGACTGGATTGTCGCTCCACCTGGTTACCACGCCTTCTAC TGTCACGGAGAATGTCCTTTCCCTCTGGCTGATCATCTGAACTCCACTAAC＜3’R15’＞CATAGAGATAGCAGACAGTTCAGTTGGGACACAACAAGCCTTAGGAA TCTTAG AGTTAACAGAGTTGACCAAGGTCTGAACAATGGCATGGTTAGTGGAGTT CAGATG＜3’R25’＞ATCGAAGCTTCTAACGACATCCACAACCCTCAACAACCATGTCCTGGTA GTF CTTCAAAACAACCTTTTCGTTCTCGTCCAGGTACAGCATAGAGATAGCAGACAG＜3引物合成由上海英俊生物工程公司公司完成，经PAGE纯化。
(2)应用PCR法合成全基因反应分两步进行，首先利用引物F1与R1进行首轮PCR，不加入模板，因为PCR自身得到的引物二聚体就是合成目的基因的中间部分；再利用上述反应产物作模板，以F2与R2为引物进行第二次PCR扩增，便可得到目的基因的全长。
反应组分为缓冲液2.5μl；25mM MgCl2 1.5μl；10mM dNTP 2μl；引物各1μl；高保真聚合酶pfu 5U；无菌双蒸水16μl。发应条件为95℃变性4分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，33个循环；72℃再延伸10分钟。1.5％琼脂糖检测PCR结果，电泳如图1(lane2、3)所示。
(3)目的基因片断的回收按照Qiagen公司的PCR产物回收试剂盒回收目的片断，其过程如下取50μl PCR反应产物加入5倍体积的PB液(试剂盒提供)，混合后移入吸附柱中离心15秒，弃废液；在吸附柱中加入500μl PE，离心15秒，弃废液；在离心1次，换新的收集管；在吸附柱上加入50μl无菌双蒸水，静置1分钟后，离心30秒，收集离心液，贮存于-20℃中保存。
(4)目的基因片断克隆入载体酶切过程10X酶切缓冲液5μl，EcoRI 5μl，HindIII 5μl，PCR产物20μl(或质粒载体pUC182μg)，加水补足体积为50μl。37℃酶切2小时后纯化。
目的基因克隆入pUC18载体，该载体为我单位保存。反应组分如下PCR产物5μl；pUC18载体1μl；10X T4连接酶缓冲液1μl；去离子水21μl；总体积101μl；16℃连接30分钟。
感受态细胞的制备挑取单个DH5α菌落，接种于不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50mlLB培养基中，37℃振荡3小时，待菌液OD值为0.6时，4℃5000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1M CaCl2悬浮，再5000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以适量0.1MCaCl2悬浮，分装后置冰浴内6小时备用。
连接产物的转化取上述连接产物5μl加入100μl感受态细胞冰浴60分钟，42℃热休克2分钟，加入不含氨苄青霉素的LB培养基0.9ml，37℃培养1小时，取200μl菌液加入40μl 20mg/ml 5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷)及4μl 0.1M IPTG混匀后涂布于含有氨苄青霉素的LB平皿，37℃培养16小时，挑取白色菌落快速提取质粒进行酶切鉴定。酶切产物经1％琼脂糖检测。电泳结果如图1(lane 1)所示。命名为pUC-BMP2。
质粒DNA的快速小量制备挑取单菌落接种于4ml含氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养过夜。菌液加入1.5ml离心管中，5000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀重悬于15μl悬浮液(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)，加200μl裂解液(0.2M NaOH，1％SDS)，置冰浴5分钟后，加入150μl中和液(3.0M Kac，pH4.8)，冰浴10分钟，12000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清加等体积酚/氯仿抽提1次，上清加2倍体积无水乙醇，12000rpm离心10分钟，沉淀用70％乙醇洗1次，真空干燥后20μlTE溶解，-20℃冻存备用。
(5)序列测定提取质粒DNA，用双脱氧终止法测定核苷酸序列，测序工作由上海英俊生物工程公司完成。序列测定结果与计划相符合。
实施例2.骨形态发生蛋白-7基因的合成根据GeneBank中已公开的BMP-2蛋白成熟肽的编码基因序列，参照美国Invitrogen公司提供的毕赤酵母酵母氨基酸密码子偏好表(www.invitrogen.com)，在不改变氨基酸顺序的前提下，利用密码子第三位碱基的摇摆性，将原基因中的稀有密码子替换。具体措施是设计2对引物将整个编码基因覆盖，其序列是经过偏好性调整的，引物相互之间都有18个碱基的互补配对，序列如下F25’＞ATCGGAATTCATGTCCACCGGTTCTAAGCAGCGTTCTCAGAACCGTTCCAAGACCCCAAAGAACCAGGAAGCCCTGCGTATGGCCAACGTTGCTGAGAACTCTTCTTCTGACCAGAGACAGGCCTGTAAGAA＜3’F15’＞GAGACAGGCCTGTAAGAAGCACGAGCTGTACGTCTCTTTCCGTGACCTGGGTTGGCAGGACTGGATCATCGCTCCTGAAGGTTACGCCGCCTACTACTGTGAGGGTGAGTGTGCCTTCCCTC＜3’R15’＞TCAGCTGAGTTGGAGCACAGCATGGCTTAGGAACAGTTTCTGGGTTGATGAAGTGGACCAGAGTCTGAACGATGGCGTGGTTGGTGGCGTTCATGTAGGAGTTCAGAGGGAAGGCACACTCAC＜3’R25’＞ATCGAAGCTTCTAGTGACAACCACAGGCACGGACAACCATGTTTCTGTACTTCTTCAGGATGACGTTAGAAGAGTCATCGAAGTACAGGACGGAGATGGCGTTCAGCTGAGTTGGAGCAC＜3’其余步骤均与实施例1中的描述相同。得到重组子命名为为pUC-BMP7，电泳如图1第4、5、6泳道所示。
实施例3.重叠延伸法合成骨形态发生蛋白2-连接肽-骨形态发生蛋白-7融合基因(1)引物设计BMP2_F5’＞ATCGGAATTCATGCAAGCCAAGCACAAGCAG＜3’BMP2_R5’＞ACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCCTAACGACATCCACAACC＜3’BMP7_F5’＞GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTTCCACCGGTTCTAAGCAG＜3’BMP7_R5’＞ATCGAAGCTTCTAGTGACAACCACAGGC＜3’其中，BMP2_R与BMP7_R为重叠引物，二者重叠部分包括连接肽(GGGGS)4的编码序列。
(2)重叠延伸PCR首轮PCR分别以BMP2_F与BMP2_R为引物，pUC-BMP2为模板进行PCR扩增，同时又以BMP7_F与BMP7_R为为引物，pUC-BMP7为模板进行PCR扩增，反应组成为缓冲液2.5μl；25mM MgCl2 1.5μl；10mM dNTP 2μl；引物各1μl；高保真聚合酶pfu 5U；模板1μl；无菌双蒸水15μl。发应条件为95℃变性4分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，33个循环；72℃再延伸10分钟。
产物回收按照Qiagen公司的PCR产物回收试剂盒回收目的片断，其过程如下取50μl PCR反应产物加入5倍体积的PB液(试剂盒提供)，混合后移入吸附柱中离心15秒，弃废液；在吸附柱中加入500μl PE，离心15秒，弃废液；在离心1次，换新的收集管；在吸附柱上加入50μl无菌双蒸水，静置1分钟后，离心30秒，收集离心液，贮存于-20℃中保存。
重叠PCR取上述PCR产物各1μl，缓冲液2.5μl，25mM MgCl2 1.5μl，10mM dNTP 2μl，引物各1μl，高保真聚合酶pfu 5U，无菌双蒸水14μl组成反应体系，发应条件为95℃变性4分钟；94℃变性60秒，60℃退火45秒，72℃延伸90秒，5个循环。
第三次PCR取取上述PCR产物1μl，缓冲液2.5μl，25mM MgCl2 1.5μl，10mM dNTP 2μl，引物各1μl，高保真聚合酶pfu 5U，无菌双蒸水14μl组成反应体系，发应条件为95℃变性4分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，33个循环；72℃再延伸10分钟。1.5％琼脂糖检测PCR结果，电泳如附图1第8泳道所示。
(3)目的基因片断的回收按照Qiagen公司的PCR产物回收试剂盒回收目的片断，其过程如下取50μl PCR反应产物加入5倍体积的PB液(试剂盒提供)，混合后移入吸附柱中离心15秒，弃废液；在吸附柱中加入500μl PE，离心15秒，弃废液；在离心1次，换新的收集管；在吸附柱上加入50μl无菌双蒸水，静置1分钟后，离心30秒，收集离心液，贮存于-20℃中保存。
(4)目的基因片断克隆入载体酶切过程10X酶切缓冲液5μl，EcoRI 5μl，HindIII 5μl，PCR产物20μl(或质粒载体pUC18 2μg)，加水补足体积为50μl。37℃酶切2小时后纯化。
目的基因克隆入pUC18载体，该载体为我单位保存。反应组分如下PCR产物5μl；pUC18载体1μl；10X T4连接酶缓冲液1μl；去离子水21μl；总体积101μl；16℃连接30分钟。
感受态细胞的制备挑取单个DH5α菌落，接种于不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50mlLB培养基中，37℃振荡3小时，待菌液OD值为0.6时，4℃5000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1M CaCl2悬浮，再5000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以适量0.1MCaCl2悬浮，分装后置冰浴内6小时备用。
连接产物的转化取上述连接产物5μl加入100μl感受态细胞冰浴60分钟，42℃热休克2分钟，加入不含氨苄青霉素的LB培养基0.9ml，37℃培养1小时，取200μl菌液加入40μl 20mg/ml 5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷)及4μl 0.1M IPTG混匀后涂布于含有氨苄青霉素的LB平皿，37℃培养16小时，挑取白色菌落快速提取质粒进行酶切鉴定。酶切产物经1％琼脂糖检测。结果电泳如附图1第7泳道所示。命名为pUC-BMP2/7。
质粒DNA的快速小量制备挑取单菌落接种于4ml含氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养过夜。菌液加入1.5ml离心管中，5000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀重悬于15μl悬浮液(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)，加200μl裂解液(0.2M NaOH，1％SDS)，置冰浴5分钟后，加入150μl中和液(3.0M Kac，pH4.8)，冰浴10分钟，12000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清加等体积酚/氯仿抽提1次，上清加2倍体积无水乙醇，12000rpm离心10分钟，沉淀用70％乙醇洗1次，真空干燥后20μlTE溶解，-20℃冻存备用。
(5)序列测定提取质粒DNA，用双脱氧终止法测定核苷酸序列，测序工作由上海英俊公司完成。序列测定结果与预期相符合。
实施例4 BMP2/7基因在毕赤酵母中的表达(1)BMP2/7基因的PCR扩增以pUC-BMP2/7质粒为模板，根据表达载体pPICzαA表达载体上的克隆位点设计引物为上游引物P15’＞ATCGCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCAATGCAAGCCAAGCACAAG＜3’下游引物P25’＞ATGCTCTAGACTACTAGTGACAACCACAGGC＜3’引物合成由上海英俊公司完成，经PAGE纯化。PCR反应组成缓冲液2.5μl；25mM MgCl2 1.5μl；10mM dNTP 2μl；引物各1μl；高保真聚合酶pfu 5U；pUC-BMP2/7为模板取1μl；无菌双蒸水16μl。发应条件为95℃变性4分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，33个循环；72℃再延伸10分钟。1.5％琼脂糖检测PCR结果，电泳如图1所示。
(2)穿梭载体构建提取pPICzαA表达载体，用XhoI与XbaI双酶切，同时对于上述PCR产物也用相同的酶进行酶切，反应组成10X酶切缓冲液5μl，XhoI 5μl，XbaI 5μl，PCR产物20μl(或质粒载体pPICzαA 2μg)，加水补足体积为50μl。反应条件37℃反应2小时。将上述两种酶切分别纯化后，在T4连接酶的作用下，37℃连接2小时，以得到重组表达载体pPICzαA-BMP2/7，连接物转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，扩增后，酶切鉴定，如附图2所示。
(3)转化毕赤酵母GS115方法参考Invitrogen公司的产品说明书。挑取GS115单菌落接种5mlYPD培养基，30℃250rpm摇床培养过夜，按1％接种量接种200mlYPD液体培养基，30℃250rpm摇床培养3-5小时，菌体浓度达到0.8-1.0，1500g离心10分钟，沉淀用10ml无菌双蒸水重悬，1500g离心10分钟，沉淀重悬于0.4ml 100mM的LiCl中并转移至灭菌的1.5ml离心管中，12000g离心15秒，弃上清，加入0.16ml0.1M的LiCl重悬，备用。
抽提重组质粒pPICzαA-BMP2/7，用SacI酶切成线性，同样酶切空质粒pPICzαA作为对照。
取50μl上述感受态细胞，12000g离心15秒，用移液管小心吸取上清，按照次序加入下列组分240μl 50％PEG；36μl 1MliCl；25μl 2mg/ml鲑鱼精DNA；50μl(5-10μg)线性化重组质粒pPICzαA-BMP2/7，以线性化空质粒pPICzαA为对照，剧烈振荡1分钟使完全混匀，30℃静置30分钟，42℃热激20分钟，6000-8000rpm离心15分钟，沉淀用1mlYPD重悬，30℃培养1-4小时，取25-100μl涂布于含有卓霉素(zeocin)的YPD固体培养基，30℃培养2-3天，直到有单菌落出现。
(4)筛选阳性转化子挑取10-20个单菌落于YPD液体培养基中，30℃，225rpm摇床培养至对数生长晚期，提取基因组进行重组子的PCR鉴定。
酵母基因组DNA的制备方法取1.5ml培养液4000rpm离心10分钟，菌体用液氮研磨破壁，加7mlDNA缓冲液(100mmol/L Tris-HCL，pH8.0，10mmol/L EDTA，1％SDS)混匀，65℃保温1h，10000rpm离心15分钟，上清用苯酚抽提2次，每次5000rpm，离心7分钟，再用氯仿抽提1次，5000rpm，用2.5倍乙醇沉淀(加0.3M醋酸钠，pH5.2)，10000rpm离心10分钟，70％乙醇洗涤，吹干，TE溶解，-20℃保存。
PCR鉴定方法引物为Invitrogen公司表达载体提供的通用引物，上游序列为5’＞GACTGGTTCCAATTGACAAGC＜3’，下游为5’＞GCAAATGGCATTCTGACATCC＜3’，PCR按常规方法进行。
所获得的阳性克隆命名为GS115(pPICzαA-BMP2/7)。
实施例5.重组BMP2/7异源二聚体结构类似物的表达、分离、纯化(1)诱导表达挑取重组菌的单菌落接种至20mlYPD培养基中，30℃250rpm培养活化；16小时后取10ml活化后的菌液转接至500ml BMGY液体培养基中，30℃250rpm培养；24小时后离心收集菌液，1500g于4℃离心10分钟；将收集到的菌体用1000ml BMMY液体培养基进行诱导表达，每24小时添加甲醇至终浓度为0.5％；诱导96小时后离心收集发酵液上清保存，SDS-PAGE电泳如图3所示。
(2)分离纯化表达产物的初步纯化将扩大培养的细胞培养液先干燥浓缩，然后用适当体积的20mmol/L Tris-HCl pH7.5稀释，直接上FPLC Heparin Sepharose 4B亲和柱。缓冲液A(20mmol/L Tris-HCl；0.15mol/L NaCl pH7.5)洗掉穿柱峰，再经缓冲液A+B(缓冲液B50mmol/L Tris-HCl，2mol/L NaCl pH7.5)线性梯度洗脱，收集洗脱峰，对50mmol/L NaAc液(pH5.8)透析除盐，冻干保存，SDS-PAGE电泳如附图4所示。
实施例6.重组BMP2/7异源二聚体结构类似物活性的测定(1)体外促进成肌细胞C2C12的成骨分化C2C12细胞为小鼠成肌细胞，在BMP家族蛋白的刺激下具有横向分化为成骨细胞的能力，这里我们采用成骨细胞早期分化表型碱性磷酸酶(ALP)与终末期分化表型骨钙素(Osteocalcin)为主要检测制备，并以标准品为对照比较结构类似物的活性。
C2C12细胞培养C2C12以1×104cell/cm2接种于24孔板，DMEM完全培养基，10％小牛血清，37℃5％CO2培养，48h传代。2天后以不同浓度的异源二聚体结构类似物进行诱导(5％小牛血清DMEM)，继续培养6天后(中间换一次液)收集细胞。
碱性磷酸酶的检测异源二聚体结构类似物处理C2C12细胞，吸取培养液，PBS缓冲液洗两遍，然后每106个细胞加入RIPA裂解液(含有蛋白酶抑制剂PMSF)1ml，冰上静置20分钟。将样品转移至1.5ml离心管中，高速低温离心(2000g)两分钟，收集上清，低温保存备用。ALP的检测采用临床常用的连续监测法(自动生化分析仪)，原理为在pH10.5时，ALP催化对-硝基苯酚磷酸盐水解成为对-硝基苯酚与磷酸盐，磷酸盐被转移到2-氨基-2-甲基-1-丙醇受体分子上，游离的对-硝基苯酚在碱性条件下发生分子重排形成黄色醌，在405nm波长下连续监测醌产生的速率，计算ALP的活力。一般先作出标准曲线，然后给出代测样品的参考值，以U/L形式给出。
骨钙素的检测应用酶连免疫分析(ELISA)测定C2C12细胞中骨钙素的分泌情况。所使用的osteocalcin检测试剂盒采用的双夹心法。使用山羊抗兔抗体板捕获特异的骨钙素-α抗体复合物，复合体中含有骨钙素抗体与骨钙素相结合。生物偶连的骨钙素(竞争性配体)、样品或标准品竞争骨钙素特异抗体的结合位点。因此当样品中骨钙素的浓度增加时，被抗体捕获的偶连的骨钙素量降低。用streptavidin碱性磷酸酶偶联的底物发应分析定量，样品中骨钙素的含量与标准品曲线相比较，可以计算骨钙素的含量。
结果我们用同样方法制备的BMP2、BMP7相比BMP2/7异源二聚体结构类似物的活性有较大的差异，见附图5、6。BMP2/7组ALP的表达量在16μg/ml时达到最高，为BMP2、BMP7组的5-6倍(P＜0.01)，其骨钙素的表达量也比后二者高3倍左右(P＜0.01)，表明BMP2/7异源二聚体结构类似物的活性明显提高。
(2)小鼠后股肌袋异位骨形成实验将BMP蛋白的冻干粉置于小鼠后股部肌肉中，可以诱导成肌细胞横向分化成为骨组织，即异位骨的形成，成为BMP蛋白体内活性检测的一个重要方法。
材料准备取纯化后的BMP2/7异源二聚体结构类似物按结构类似物0.5mg、1.0mg、1.5mg各分装18份，冻干、真空加盖，CO60辐照灭菌(剂量2kcGry)，4℃保存备用。另取人血清白蛋白(HSA)27mg，生理盐水溶解后，同法分装成18份，冻干、灭菌备用。
动物实验取昆明小鼠72只，均为雌性，体重17～19g，平均18g。随机分为4组，每组18只。精制颗粒饲料分笼喂养，自由饮水。手术前乙醚吸入麻醉，每只小鼠后股部去毛。常规消毒后暴露后股部肌袋。第1、2、3组动物分别植入rhBMP-20.5mg、1.0mg、1.5mg，第4组植入HAS 1.5mg作为对照组。仔细缝合肌肉、皮肤，麻醉清醒后送回笼养。
组织学检查术后各组分别于7、14d、21d各处死6只动物，取植入区组织块，10％福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜观察。
结果各剂量组小鼠在肌肉组织中均可见典型的骨诱导动态过程，间充质细胞肥大，分化出骨原细胞，7天时部分骨原细胞分化成软骨细胞并分泌软骨基质，在软骨周围形成软骨膜，随后在软骨中段出现成骨区。原始骨原细胞分化成成骨细胞，并整齐附着在软骨基质的表面，产生类骨质，14天时类骨质钙化形成骨小梁，由于破骨细胞的作用，21天时形成许多不规则的原始髓腔，腔内可见部分血细胞，见附图6、7。
实施例7.重组BMP2/7异源二聚体结构类似物治疗兔桡骨大尺度骨缺损胶原蛋白的制备新鲜成年冷冻牛腱切碎，0.05M乙酸处理，4℃冰箱48～72h，组织捣碎机中捣碎，用80～100#尼龙网过滤去除胶原颗粒。在捣碎和过滤胶原期间，置真空干燥箱内减压脱泡，即成均匀的胶原溶液。戊二醛交连处理。真空干燥后形成胶原海面。
结构类似物与胶原蛋白的复合将胶原海面浸泡在BMP2/7异源二聚体结构类似物溶液中，以负压抽吸法将二者复合。
动物实验新西兰兔20只(第四军医大学实验动物中心)随机分为2组，3％戊巴比妥钠肌注麻醉(0.3mg/kg体重)，常规脱毛、固定、消毒、铺单，取右侧前肢前外侧切口，依次切开皮肤、皮下、深筋膜，沿肌间隙分离并显露桡骨。于桡骨中上段用手持牙科打磨机截断，造成20mm骨干骨膜节段性缺损，实验组植入复合结构类似物的胶原海面，对照组植入单纯胶原海面。逐层缝合不行固定，置于相同条件下饲养。观察术后兔饮食、活动及伤口愈合情况。取材后观察缺损部位的变化，脱钙后纵向剖开观察内部结构改变。术后0、3、7周在麻醉下拍摄前肢正位片，观察各组动物骨修复情况，见图9。
X线检测结果BMP2/7异源二聚体结构类似物复合胶原海面组3周骨缺损断端已完全骨性连接，部分髓腔再通。7周新生骨塑形改建，髓腔基本再通。
单纯胶原海面组3周见骨断端间有骨性连接但连接的骨薄弱、纤细。7周骨缺损间骨形成有所增加，但未见髓腔形成。
SEQUENCE LISTING<110>暨南大学<120>一种BMP2/7异源二聚体结构类似物及其表达方法与应用<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>825<212>DNA<213>BMP2-连接肽-BMP7人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(825)<220>
<221>BMP2序列<222>(1)..(345)<220>
<221>连接肽序列<222>(346)..(405)<220>
<221>BMP7序列<222>(405)..(825)<400>1atg caa gcc aag cac aag cag cgt aag cgt ctg aag tcc tcc tgt aag 48Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys1 5 10 15aga cac cct ttg tac gtt gac ttc tgt gac gtt ggt tgg aac gac tgg 96Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Cys Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp20 25 30att gtc gct cca cct ggt tac cac gcc ttc tac tgt cac gga gaa tgt 144Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys35 40 45cct ttc cct ctg gct gat cat ctg aac tcc act aac cat gcc att gtt 192Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val50 55 60cag acc ttg gtc aac tct gtt aac tct aag att cct aag gct tgt tgt 240Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys65 70 75 80gtc cca act gaa ctg tct gct atc tct atg ctg tac ctg gac gag aac 288Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn85 90 95gaa aag gtt gtt ttg aag aac tac cag gac atg gtt gtt gag ggt tgt 336Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys100 105 110gga tgt cgt ggt ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt 384Gly Cys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly115 120 125ggt tct ggt ggt ggt ggt tct tcc acc ggt tct aag cag cgt tct cag 432Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln130 135 140aac cgt tcc aag acc cca aag aac cag gaa gcc ctg cgt atg gcc aac 480Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn145 150 155 160
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权利要求
1.一种具有BMP2/7异源二聚体活性的结构类似物，其特征在于由BMP2和BMP7蛋白通过一段连接肽融合而成，所述连接肽由2-50个Gly与Ser组成。
2.如权利要求1所述的结构类似物，其特征在于所述连接肽由4个Gly与1个Ser串联组成，从N端到C端的次序为GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。
3.如权利要求2所述的结构类似物，其融合蛋白从N端到C端的次序为BMP2-连接肽-BMP7，氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
4.如权利要求2所述的结构类似物，其融合蛋白从N端到C端的次序为BMP7-连接肽-BMP2，氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
5.生产如权利要求1所述结构类似物的方法，包括(1)获得编码BMP2/7异源二聚体的核苷酸序列；所得核苷酸序列至少有90％与SEQ ID NO1或与SEQ ID NO3同源；(2)将所获的序列克隆到表达载体构建重组表达载体；所述表达载体为piczαA或piczαB或piczαC；(3)将重组载体转化宿主细胞，发酵表达；(4)收集表达的目的产物，纯化获得高纯度的结构类似物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(3)所述宿主细胞为毕氏酵母、酿酒酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母或裂殖酵母。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(1)所述核苷酸序列至少有95％与SEQ ID NO1或与SEQ ID NO3同源。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(4)采用FPLC HeparinSepharose 4B亲和柱，Tris-HCl与NaCl组成的缓冲体系进行线性梯度洗脱，收集洗脱峰，透析除盐后冻干保存。
9.权利要求1所述结构类似物在制备治疗组织创伤、骨骼创伤的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述结构类似物可与医药上可接受的载体组成药物组合物，所述载体可以是胶原海绵、β磷酸三钙、骨水泥、纤维蛋白、壳聚糖中的一种或几种的复合物。
全文摘要
本发明公开了一种BMP2/7异源二聚体结构类似物及其表达方法与应用。该结构类似物由BMP2和BMP7蛋白通过一段连接肽融合而成，具有不亚于天然BMP2/7异源二聚体的活性功能；本发明还提供了大规模生产该结构类似物的方法，其中该结构类似物的核苷酸序列是至少有90％与SEQ ID NO1或与SEQ IDNO3同源，通过该方法可大规模稳定高效地生产得到的该结构类似物；另外本发明还公开了含有该结构类似物和医药上可接受的载体的药物组合物，并公开了该药物组合物在治疗组织损伤和骨骼损伤中的应用。
文档编号C07K14/51GK1824680SQ200610034620
公开日2006年8月30日 申请日期2006年3月24日 优先权日2006年3月24日
发明者孙奋勇, 汪炬, 董群伟, 谢秋玲, 戴云 申请人:暨南大学