专利名称：奶山羊pitx1基因单核苷酸多态性位点及其检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物分子遗传育种技术领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测及其应用，具体涉及奶山羊PITXl (成对同源异型结构域蛋白转录因子I)基因(以序列Accession No. NW_003104033为參考)单核苷酸多态性位点及其检测方法和应用。
背景技术：
与奶牛相比，奶山羊更适用于在恶劣环境条件下饲养，因为它具有较强抗逆性；与牛奶相比，羊奶具有更高的营养价值，因为它的脂肪球小，不含过敏原，酸值低，比牛奶更易为人体吸收，在国际营养界被誉为“奶中之王”。然而目前，我国奶山羊产业相对滞后，利用 优良奶山羊群体获得羊奶的数量与质量，与发达国家相比差距巨大，与目前国内主流的奶牛业发展“不可同日而语”。为此，作为我国“十二五”规划中奶业发展计划的重要组成部分，奶山羊业的发展迫在眉睫，但是目前，我国该产业发展滞后，其根本原因在于我国奶山羊品种种源不足和种群遗传品质较差。因此，如何提高奶山羊种群遗传品质，从而增加奶山羊的产奶量并改善乳品质，是目前我国奶山羊遗传育种专家尚待解决的关键问题。奶山羊泌乳性能主要包括产奶量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量、乳固体物含量等，属于具有重要经济价值的数量性状位点(QTL)，由微效多基因控制，且遗传カ较低。在奶山羊育种方面，仅靠传统育种手段对这些泌乳性状进行改良，无疑是非常缓慢的，而且效果也不会很理想，因此，应用DNA标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加奶山羊的产奶量和改善乳品质的先进的有效的方法。因为DNA标记具有多态性丰富、遗传稳定、不受组织、生理发育阶段及环境影响等诸多优点。此外，随着DNA标记的种类与数目的增多，基因图谱密度与精度在不断提高，为遗传改良提供了新的策略，使DNA标记辅助选择(MAS)成为ー种具有广阔前景的分子育种技木。由此可见，利用DNA标记介导的MAS方法和传统育种方法对奶山羊泌乳性状进行改良、提高，必将极大地加速选择进展，提高选择准确性。目前，利用DNA标记进行MAS育种的主要步骤如下首先，在DNA水平上快速筛查与检测影响奶山羊泌乳性状的密切相关的基因；其次，建立基因多态与泌乳性状的关联分祈，确定与泌乳性状显著关联的DNA标记或SNP位点；最后，实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。具体而言，关于DNA标记与奶山羊泌乳性状之间关系的研究，主要有两种基本方法候选基因分析和连锁标记分析。在奶山羊研究中，候选基因分析比连锁标记分析更易操作，且不需要进行特意实验设计、费用低、统计功效强，被广泛采用，适用于任何可取得基因型和表型数据的群体。该方法通过统计方法建立相应的数学模型，从而确定该候选基因与未知基因的关系或效应。通常来说，候选基因是ー些与泌乳性状有关的重要基因，可能是结构基因、调节基因或是在生化代谢途径中影响该性状表达的基因。众所周知，生长激素(GH)能够促进哺乳动物生长、泌乳、细胞増殖。泌乳素(PRL)也能够显著地影响哺乳动物的生长、泌乳以及免疫系统；而且，已有研究表明，GH和PRL基因突变能够显著影响哺乳动物的泌乳期和泌乳性能。因此，GH基因、PRL基因以及它们的正调控因子基因均可作为影响泌乳性能的关键候选基因。同源异型结构域蛋白转录因子(PITX)类转录因子成员在基因活化、垂体发育中的的关键性作用，启发此类基因与泌乳性能的关联性研究。作为PITX家族的重要成员，同源异型结构域蛋白转录因子I(PITXl)基因被分别定位在人类第5号染色体、小鼠和原鸡第13号染色体、牛第7号染色体，但山羊的相应信息尚未公布。序列比对结果表明，PITXl在人类、黒猩猩、狗、鼠、鸡、斑马鱼和牛中的序列高度保守，在许多发育通路中发挥重要作用，包括影响脑垂体的器官发生，影响GH、PRL、促甲状腺激素(TSH)的表达从而影响动物的泌乳性能。值得ー提的是，PITXl是在发育中的小鼠、鸡的胚胎的后肢、口腔上皮组织、臂弓等处被发现的，其决定着肌肉、骨骼等的形态。此外，敲除PITXl基因的小鼠表现出在垂体、后肢和味觉发育上的缺陷和障碍。因此，PITXl基因是垂体-下丘脑轴相关激素基因(如PRL和GH)的重要的调节器，是已知的代表垂体发育的重要标记基因之一。所谓单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/ G)的变化而引起的多态性，其变异形式主要有颠换、转换、插入和缺失等。近年来，已发展出了许多用于探寻基因SNP的方法，例如DNA序列測定法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、PCR-RFLP法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些检测技术中，DNA序列測定法是最为准确检测SNP的方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的有经验的技术人员，所以，DNA序列測定法不是ー种应用于生产实践的理想的SNP检测方法；利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP，可以适当降低检测费用，但是，其实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为ー种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而用引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。综上所述，PCR-RFLP法是当前检测SNP最为理想的遗传标记方法。最新研究表明，关于PIXl基因SNP研究多见于人、小鼠等生物的体外表达分析，且常被作为器官机能缺陷和重要的疾病预测相关的候选基因，而鲜见于家畜和家禽SNP分析。截至目前，关于奶山羊PITXl基因SNP研究尚未见相关报道。中国奶山羊PITXl基因SNP领域的研究匮乏，基因位点的功能研究及其遗传变异与泌乳性能(如产奶量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量、乳固体物含量等)的关联研究仍是空白。由于PITXl基因SNP位点在动物生产实践中对形成胚胎、调控生长激素和促进垂体分泌激素等具有重要的作用，本发明提供的检测方法为PITXl基因SNP与奶山羊泌乳性状之间关系的建立奠定了基础，以便用于中国奶山羊泌乳性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的奶山羊种群，从而提高种群遗传品质，増加奶山羊的产奶量和改善乳品质，为我国奶山羊业的发展提供理论与实践资料。
发明内容
本发明解决的问题是，利用PCR-RFLP方法快速检测奶山羊PITXl基因SNP，并将其与奶山羊泌乳性状进行关联分析，验证其作为奶山羊分子育种中辅助选择的DNA标记，从而加快良种选育速度。为了实现上述发明的目的，本发明采取如下的技术方案奶山羊PITXl基因单核苷酸多态性位点，其中，该基因单核苷酸多态性位点包括奶山羊PITXl基因第201位为G或A的单核苷酸多态性位点，基因型为GG、GA、AA。
ー种检测奶山羊PITXl基因单核苷酸多态性位点的方法，包括下述步骤(I)、以包含PITXl基因的DNA序列为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊PITXl基因；(2)、然后利用限制性内切酶MspI对步骤(I)获得的PCR产物进行酶切；(3)、再通过琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)获得的酶切产物即可鉴定奶山羊PITXl基因的单核苷酸多态性位点包括第201位为G或A的单核苷酸多态性位点，基因型为GG、GA、AA ；所述的引物对P为上游引物F:5' -CCGCCTTCCACCTAGCCCGCAC-3'；下游引物R:5' -TCGTCCATGTCCACGTTCATCG-3'。上述技术方案中所述的ー种检测奶山羊PITXl基因单核苷酸多态性位点的方法，其中，所述的PCR扩增反应程序为94°C预变性 5min ;35 个循环(94°C变性 30s，65. 2°C退火 30s，72°C延伸 30s) ；72°C延伸IOmin0上述技术方案中所述的ー种检测奶山羊PITXl基因单核苷酸多态性位点的方法，其中，所述的琼脂糖凝胶电泳为2. 0%琼脂糖凝胶电泳。上述技术方案中所述的奶山羊PITXl基因单核苷酸多态性位点在作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高乳脂量和乳固体物含量的DNA遗传标记中的应用。上述技术方案中所述的应用，其中，奶山羊PITXl基因单核苷酸多态性位点的GA基因型作为提高奶山羊泌乳性能的DNA遗传标记的应用。在本发明中检测奶山羊PITXl基因单核苷酸多态性位点的方法中，以奶山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、Buffer (缓冲环境)、Mg2+、dNTPs存在的情况下，利用引物对P进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶对扩增得到的DNA片段进行酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定奶山羊PITXl基因第201位即内含子I第41位(NW_003104033 g. 201G > A(IVS1+41G > A)的单核苷酸多态性；本发明的buffer中不含有Mg2+。本发明中奶山羊PITXI基因第201位为G或A的单核苷酸多态性位点中，A等位基因表现为230bp，G等位基因表现为121bp和109bp，相应地，GG基因型表现121bp，109bp ；GA基因型表现230bp，121bp, 109bp ；AA基因型表现230bp。本发明根据牛PITXl 基因的序列(GenBank Accession number NW_003104033)设计引物对P(由于NCBI未公布山羊基因组序列)，以关中奶山羊基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到奶山羊PITXl基因的部分序列。与NCBI公布的序列进行比较后，发现在第201位(内含子I的第41位)存在SNP。针对上述第201位的SNP，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物，PCR扩增目的片段，然后用特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸多态性。本发明具有以下有益效果I、本发明公开了奶山羊PITXl基因单核苷酸多态性位点的筛查和检测方法，通过设计特定的PCR引物扩增片段，能够用RFLP方法简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性；2、本发明对关中奶山羊该SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与奶山羊的泌乳性能(包括羊奶的乳脂含量和乳固体物含量)进行关联分析，结果表明该位点可以作为提高奶山羊泌乳性能的分子标记；3、本发明公开的检测方法为奶山羊PITXl基因的SNP与奶山羊的泌乳性状关系的建立奠定了基础，以便用于奶山羊泌乳性状的标记辅助选择(MAS)育种中用于快速建立遗传资源优良的奶山羊种群。
I、图I为奶山羊PITXl基因第201位GA基因型个体的测序图；2、图 2 为 MspI PCR-RFLP方法检测山羊PITXl 基因第 I 内含子 SNP(NW_003104033 :g. 201G > A or IVS1+41G > A)序列分析图；3、图3为MspI PCR-RFLP方法检测奶山羊PITXl基因第201位(内含子I第41位)SNP酶切电泳分型图。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明作进ー步的说明。本发明下述实施例中所用的主要试剂及其来源如下I、生化试剂与生物学试剂①Taq DNA聚合酶(购自MBI公司)；②限制性内切酶MspI (购自MBI公司)；③dNTPs (购自MBI公司)；@ Marker I :(购自北京天根生化科技有限公司)； 蛋白酶K(购自华美生物工程公司)。2、普通试剂普通试剂从华美生物工程公司购买，为进ロ分装产品柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris, EDTA, NaCl, NaOH, KC1、Na2HPO4, KH2PO4, Tris 饱和酚、氯仿、异戊醇、无水こ醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化こ锭(EB)、溴酚蓝、ニ甲基苯氰FF、こ酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。3、溶液与缓冲液所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in (I. 034 X IO5Pa), 25min。试剂配制方法均參考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。(I)、样品采样所用溶液抗凝剂ACD :梓檬酸0. 48g ;柠檬酸钠I. 32g ;葡萄糖I. 47g。把它们定容于IOOmL水中，高压灭菌。每6mL新鲜血液中加入ImL的A⑶液。这ー抗凝剂优于EDTA，在血液贮存过程中能更好地保存高分子的DNA，经其抗凝的血液可以在0°C保存数天或_70°C长期保存(2)、血样基因组DNA分离所用溶液①、PBS缓冲液NaCl 8g，KCl 0. 2g, Na2HPO4 I. 44g, KH2PO4 0. 24g，加超纯水至IOOOmL,调pH至7. 4,高压灭菌；②、10% SDS 10g SDS溶解于90mL的超纯水中，68°C水浴溶解，用HCl调pH至7. 2，定容至IOOmL ；③、0.5mol/LEDTA :EDTA 186. lg，溶于 800mL 的超纯水中，用 NaOH 调 pH 至 8. 0，定容至IOOOmL，高压灭菌，4°C保存；④、lmol/LTris Cl :121. 14g Tris，溶于 800mL 超纯水中，HCl 调节 pH 至 8.0，定容至IOOOmL，高压灭菌，4 °C保存；⑤、5mol/LNaCl=NaCl 292. 2g 溶于 IOOOmL 超纯水中；⑥、DNA抽提缓冲液取 0. Smmol /T, EDTA 40mL, Immol /T, Tris Cl 10mT,；⑦、5mmol/LNaCl 4mL, 10% SDS IOmL 定容至 100mL。实际浓度为 200mmol/LEDTA，pH 8. 0 ；IOOmmoI/L Tris HCl，pH 8. 0 ;200mmol/L NaCl,2% SDS ；RNase 20 u g/mL ；⑧、NaAc缓冲液=NaAc 3H20 20. 4g ;超纯水 40mL ;稀 HAc 调 pH 至 7. 4 ;定容至50mL ；⑨、TE缓冲液Tris .Cl 缓冲液(pH 8. 0) 10mmol/L，EDTA 缓冲液(pH8. 0) 0. lmmol/L,高压灭菌,4°C保存；⑩、蛋白酶K :用超纯水配成20mg/mL，_20°C保存；(3)、组织样DNA提取所用溶液除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配置以下试剂①、2mol/L NaCl :11. 688g溶于水,定容至IOOmL,高压灭菌；②、组织DNA 提取液(IOOmL) :ImoI/L Tris-Cl (pH 8.0)1 mL，0.5mol/LEDTA (pH8. 0)20mL,2mol/L NaCl 5mL，定容至 IOOmL ;(4)、琼脂糖电泳分析所用溶液①、0.5 X TBE 缓冲液取 10XTBE 50mL 定容至 IOOOmL ；②、上样缓冲液0.25%溴酚蓝，0.25% ニ甲苯青FF，40.0% (w/v)蔗糖水溶液。实施例一奶山羊PITXl基因部分DNA序列的克降与DNA测序一、奶山羊样品的采集提取DNA所用血样(静脉采血)和耳组织样均采自658只健康且无血缘关系的2-4岁关中奶山羊，采自陕西省三原县奶山羊育种场。ニ、血样基因组DNA的提取与分离(I)、冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500 ii L至I. 5mL Eppendorf管，加入等体积PBS液,充分混勻，12000r/min离心IOmin (4°C )，弃去上清液，重复上述步骤至
上清液透明、沉淀呈淡黄色。(2)、在离心管中加入DNA抽提缓冲液500 U L，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37°C水浴Ih。(3)、加蛋白酶K至30iiL(20mg/mL)并混匀，55°C过夜至澄清，尚未澄清者，可补加10 y L蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。
(4)、将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500 U L，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4°C，12000r/min离心lOmin，将上清液转入另一 I. 5mL离心管中，重复一次。
(5)、加氯仿500mL,充分混勻20min, 4°C, 12000r/min离心IOmin,将上清液转入另一 I. 5mL离心管中。(6)、加氯仿、异戍醇混合液(24 : l)500mL,充分混勻20min,4°C, 12000r/min离心lOmin，将上清液转入另一 I. 5mL离心管中。(7)、加0. I倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水こ醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20°C保存30 60min。(8)、4°C，12000r/min离心lOmin，弃去上清液，用70 %冰冷こ醇漂洗DNA沉淀2次。(9)、4°C, 12000r/min离心lOmin,弃去上清液,室温下使こ醇挥发干净。(10)、干燥后的DNA溶于80 100 y L的TE液，4°C保存直至DNA完全溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，_80°C保存。三、组织样品DNA的提取与分离(I)、取奶山羊耳组织样约IOmg的组织样品，放于I. 5mL的离心管中，用小剪刀尽
量剪碎。(2)、加入600 ii L组织提取液，10% SDS至终浓度为I %，蛋白酶K至终浓度为100 u g/mL, 55. (TC消化过夜，最好保证组织样较均匀地分布在组织提取液中。(3)、将溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续IOmin以上，12000r/min离心15min。(4)、取上清液，加入等体积的酚氯仿(I I)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续IOmin以上，12000r/min离心15min。(5)、取上清液，加入等体积的氯仿异戊醇(24 I)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续IOmin以上，12000r/min离心15min。(6)、取上清液，加入2倍体积的冰冷无水こ醇和1/10体积的3mol/Lこ酸钠，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至出现白色絮DNA。(7)、挑出DNA，放进ー个1.5mL的离心管中，加入500iiL 70%こ醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3 5min，小心倒掉こ醇，将管倒置于吸水纸上。(8)、再一次向离心管中加入500 ii L 70 %こ醇，盖紧管盖，缓慢颠倒，然后12000r/min离心3 5min，小心倒掉こ醇，将管倒置于吸水纸上。(9)、待干燥后,加入60 U L灭菌超纯水,4°C保存过夜,待检测。四、DNA的纯化(I)、500 ii L的DNA溶液中加入10% SDS使其终浓度为0. 1%，加入蛋白酶K至终浓度达到100 Ii g/mL。(2)、5°C保温 IOh 左右。(3)、等体积苯酚氯仿异戊醇(25 24 I)和氯仿分别抽提一次。(4)、12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另ー离心管中。(5)、加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水こ醇沉淀DNA。
(6)、倒掉液体，70%こ醇洗涤后凉干，加入60 U L灭菌超纯水溶解，4°C待检测。五、分光光度法检测DNA用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD26tl/OD280的比值。如OD26tlAD28tl比值小于I. 6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于I. 8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA 浓度(ng) = 50 X OD26tl 值 X 稀释倍数DNA检测完毕后，取适量稀释至50ng/ U L，存于_20°C备用，其余的存放于_80°C。六、DNA池的构建DNA检测完毕后，从100个浓度为50ng/ U L的关中奶山羊DNA样品中各取10 y L混合，构建关中奶山羊群体DNA池。七、引物的设计由于目前美国国立医学图书馆(NCBI)网站上并未公布奶山羊PITXl基因的序列，为此，以NCBI上公布的牛PITXl基因(GenBank accession No. NW_003104033)序列为參考，利用软件Primer 5. 0设计了扩增奶山羊PITXl基因第I内含子的230bp片段的PCR引物对P，其引物对P的序列信息如下上游引物F:5' -CCGCCTTCCACCTAGCCCGCAC-3' (nt50_71);下游引物R:5' -TCGTCCATGTCCACGTTCATCG-3' (nt 259-279)八、PCR克隆奶山羊PITXl基因以构建好的关中奶山羊群体DNA池为模板，用上述设计的引物进行PCR扩增，PCR反应体系见表I。表I PCR反应体系
权利要求
1.奶山羊PITXl基因单核苷酸多态性位点，其特征在于该基因单核苷酸多态性位点包括奶山羊PITXl基因第201位为G或A的单核苷酸多态性位点，基因型为GG、GA、AA。
2.ー种检测奶山羊PITXl基因单核苷酸多态性位点的方法，包括下述步骤 (1)、以包含PITXl基因的DNA序列为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊PITXl基因; (2)、然后利用限制性内切酶MspI对步骤(I)获得的PCR产物进行酶切； (3)、再通过琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)获得的酶切产物即可鉴定奶山羊PITXl基因的单核苷酸多态性位点包括第201位为G或A的单核苷酸多态性位点，基因型为GG、GA、AA ； 所述的引物对P为 上游引物F :5' -CCGCCTTCCACCTAGCCCGCAC-3'； 下游引物R : 5' -TCGTCCATGTCCACGTTCATCG-3'。
3.如权利要求2所述的ー种检测奶山羊PITXl基因单核苷酸多态性位点的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为 94°C预变性5min ;94°C变性30s, 65. 2°C退火30s，72°C延伸30s，35个循环；72°C延伸IOmin。
4.根据权利要求I所述的ー种检测奶山羊PITXl基因单核苷酸多态性位点的方法，其特征在于所述的琼脂糖凝胶电泳为2. 0%琼脂糖凝胶电泳。
5.权利要求I所述的奶山羊PITXl基因单核苷酸多态性位点在作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高乳脂量和乳固体物含量的DNA遗传标记中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于奶山羊PITXl基因单核苷酸多态性位点的GA基因型作为提高奶山羊泌乳性能的DNA遗传标记的应用。
全文摘要
本发明奶山羊PITX1基因单核苷酸多态性位点及其检测方法和应用，属于动物分子遗传育种技术领域。该基因单核苷酸多态性位点包括奶山羊PITX1基因第201位为G或A的单核苷酸多态性位点，基因型为GG、GA、AA。通过以包含PITX1基因的DNA序列为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊PITX1基因；然后利用限制性内切酶MspI对PCR产物进行酶切；再通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物即可鉴定奶山羊PITX1基因的单核苷酸多态性位点。本发明的方法具有能在奶山羊的标记辅助选择(MAS)育种中，有利于快速建立遗传资源优良的奶山羊种群，而且该方法操作简单、快速，成本低，而且检测的精确度高的优点。
文档编号C12N15/11GK102649956SQ20121011496
公开日2012年8月29日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者李转见, 潘传英, 蓝贤勇, 赵海谕, 陈宏 , 雷初朝 申请人:西北农林科技大学