专利名称：一种细菌传递的非注射型dna疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和疫苗学领域，具体的说是ー种细菌传递的非注射型DNA疫苗。
背景技术：
DNA疫苗也称为核酸疫苗或基因疫苗。这种疫苗是将编码病原的某种抗原基因克隆于ー个真核表达载体，由此获得重组表达质粒，即DNA疫苗。DNA疫苗注射到所要免疫的动物体内后，其携帯的抗原基因即可在动物体内表达，由此产生的抗原即可诱发机体的免疫反应，使得受免动物获得特定的免疫保护。DNA疫苗的优点是安全，并且免疫效应较好，因此是ー种具良好发展潜力的疫苗形式。然而，由于DNA疫苗的导入方式通常是注射，因此在 应用上具有注射型疫苗的所有局限。如何既保持DNA疫苗的优点又克服其注射应用的缺点是ー个需要解决的问题。迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)是重要的水产养殖病原菌。这两种细菌皆能感染多种海水和淡水鱼类，包括我国重要的经济品种牙鲆和大菱鲆，从而给养殖业造成严重的经济损失。
发明内容
本发明目的在于提供一种细菌传递的非注射型DNA疫苗。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种细菌传递的非注射型DNA疫苗，以迟缓爱德华氏菌减毒株TX5RM作为传递载体，传递海豚链球菌DNA疫苗pCNSilO菌株的细菌传递的非注射型DNA疫苗。所述细菌传递的非注射型DNA疫苗为将海豚链球菌DNA疫苗pCNSilO菌株转化入迟缓爱德华氏菌减毒株TX5RM中，得DNA疫苗菌株TX5Si。所述DNA疫苗菌株TX5Si可作为制备迟缓爱德华氏菌和/或海豚链球菌的DNA疫苗。本发明具有如下优点I.制备简単。本发明的疫苗只需简单的常规细菌培养，无需任何提取、纯化过程。2.非注射型应用。本发明的疫苗具有减毒疫苗和DNA疫苗的共同优点，可以通过浸泡和ロ服方法导入，从而避免了常规的注射型DNA疫苗的缺点。3.交叉保护效应。本发明疫苗能够同时保护鱼类抵抗迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌感染。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进ー步说明。实施例g在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。实施例I
非注射型DNA疫苗的构建
步骤I)海豚链球菌DNA疫苗pCNSilO的构建以质粒pACYC184(购于北京NewEngland Biolabs公司)为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR条件为94°C 60s预变性模板 DNA，然后 94°C 40s, 55 °C 60s, 72 °C 60s，5 个循环后改为 94°C 40s, 63 °C 60s，72°C 60s, 25个循环后再在72°C延伸反应IOmin。PCR产物用“天根生化科技(北京)有限公司” DNA产物纯化试剂盒纯化。PCR产物纯化后与载体pBS-T (购于“天根生化科技(北京)有限公司”)于室温连接4-6小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5ci，在含有氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBSSi。将质粒pBSSi和质粒 pSialO (pSialO 构建见參考文献 Cheng S, Hu Y, Jiao X, Sun L. Identification andimmunoprotective analysis of a Streptococcus iniae subunit vaccine candidate.Vaccine 2010 ；28 :2636-41)用限制性内切酶BamHI酶切，分别回收O. 9kb和6kb片段，将这ニ片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5a，在含有氨苄青霉素(IOOug/ml)的LB培养基上培养，筛选转化子提取质粒，即为质粒pCNSilO。所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，O. 5%酵母粉，1.0%氯化钠，97. 5%蒸懼水；所述弓丨物为Fl : 5 ’ -ATGGATCCAGGAGGGACAGCTGATA-3，和 Ri : 5 ’ -GGATCCGAATGCACCAATAACTGCCT-3，。步骤2) TX5Si疫苗菌株的构建将质粒pCNSi 10按照Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular し丄oning A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001)转化入迟缓爱德华氏菌减毒株TX5RM(TX5RM具体见參考文献Sun Y, Liu C，SunL. Isolation andanalysis of the vaccine potential of an attenua ted Edwardsiellatarda strain. Vaccine 2010 ；28 :6344-50)，得菌株TX5S i，即为对迟缓爱德华氏菌和/或海豚链球菌有保护作用的非注射型DNA疫苗菌株。实施例3TX5Si疫苗的应用步骤I)疫苗海藻酸钠微球饲料和对照海藻酸钠微球饲料的制备在LB培养基中于28°C培养DNA疫苗菌株TX5Si至OD6tltl为0.8-1，然后离心(5000g，4°C ) lOmin。收集菌体，将其悬浮于海水中至终浓度为lxl09cfu/ml，即为DNA疫苗菌株TX5Si悬浮液。将50ml海藻酸钠(3%)与30mlDNA疫苗菌株TX5Si悬浮液或PBS (对照)混合，随后加入2000ml石蜡、10ml S-80乳化剂(皆购于美国Sigma公司)以及50ml氯化钙(0. 15M)(购于“Sangon生物工程(上海)有限公司”)；将含有DNA疫苗菌株TX5Si和PBS対照的混合液分别离心(lOOOg, IOmin)，收集沉淀；将含有DNA疫苗菌株TX5Si和PBS的沉淀分别与IOOOg鱼饲料(购于“山东升索渔用饲料研究中心”)混合，用F(II)-26双螺杆挤条制粒机(华南理工大学，广州)加工制成颗粒饲料(I. 5mmX 2. 0mm)，即为疫苗海藻酸钠微球饲料和对照海藻酸钠微球饲料。步骤2)疫苗浸泡液的制备将疫苗菌株TX5Si在LB液体培养基中培养至0D_为
0.8-1，而后将培养液离心(5000g，4°C，IOmin)，收集菌体，将其悬浮于海水中至终浓度为lxl07cfu/ml,即为疫苗浸泡液。步骤3)疫苗的导入将100条牙鲆(每条重约12. 4g)随机分为4组，每组25条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组(样品组)的每条鱼喂食上述步骤I)的疫苗海藻酸钠微球饲料，持续3天；将B和D组(对照组)的每条鱼喂食上述步骤I)的对照海藻酸钠微球饲料，持续3天。随后将A和C组鱼(样品组)在上述步骤2)的疫苗浸泡液中浸泡8小时，将B和D组鱼(对照组)在普通海水中浸泡8小时。步骤4)迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌悬液的制备在LB培养基中分别培养迟缓爱德华氏菌TXl和海豚链球菌G26至OD6tltl为O. 9，然后离心(5000g，4°C，IOmin)，收集菌体。将迟缓爱德华氏菌菌体悬浮于海水中至终浓度为lxl08cfU/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液；将海豚链球菌菌体悬浮于海水中至终浓度为2xl08cfu/ml，即为海豚链球菌悬液。所述菌株TXl保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 2330，分类命名为迟缓爱德华氏菌( Edwardsiella tarda)，保藏时间2008年I月9日。所述菌株G26保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 1984，分类命名为海豚链球菌(Streptococcus iniae)，保藏时间2007年3月22日。步骤5)疫苗的免疫保护效应检测在步骤3)免疫后的第30天，将A和B组鱼在上述步骤4)的迟缓爱德华氏菌悬液中浸泡2h，将C和D组鱼腹腔注射上述步骤4)的海豚链球菌悬液(IOOul/每条鱼)。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情況。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，4条；B组，18条；C组，3条；D组，20条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)RPS = 100x(l-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)故TX5Si针对迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的相对免疫保护效率分别为78%和85%。由此得出TX5Si通过非注射免疫可诱发对迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的良好的免疫保护效应。
权利要求
1.一种细菌传递的非注射型DNA疫苗，其特征在于以迟缓爱德华氏菌减毒株TX5RM作为传递载体，传递海豚链球菌DNA疫苗pCNSilO菌株的细菌传递的非注射型DNA疫苗。
2.按权利要求I所述的细菌传递的非注射型DNA疫苗，其特征在于所述细菌传递的非注射型DNA疫苗为将海豚链球菌DNA疫苗pCNSilO菌株转化入迟缓爱德华氏菌减毒株TX5RM中，得DNA疫苗菌株TX5Si。
3.按权利要求I所述的非注射型DNA疫苗，其特征在于所述DNA疫苗菌株TX5Si可作为制备迟缓爱德华氏菌和/或海豚链球菌的DNA疫苗。
全文摘要
本发明涉及基因工程和疫苗学领域，具体的说是一种细菌传递的非注射型DNA疫苗的构建和应用方法。其构建方法为利用一种迟缓爱德华氏菌减毒株为载体传递一种海豚链球菌DNA疫苗，由此获得细菌传递的DNA疫苗TX5Si。TX5Si通过口服和浸泡途径免疫鱼类即可诱发针对迟缓爱德华氏菌和海豚链球菌的免疫保护效应。该发明的非注射型DNA疫苗为解决DNA疫苗的注射应用问题提供了一种可行方法。
文档编号A61K48/00GK102698288SQ201210165259
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者孙云, 孙黎, 胡永华 申请人:中国科学院海洋研究所