专利名称：一种水产养殖动物细菌性病害口服疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种水产养殖动物细菌性病害预防用疫苗的制备方法，具体说涉及一种水产养殖动物细菌性病害口服疫苗的制备方法。
背景技术：
目前细菌病原已成为水产养殖动物的主要病原之一，水产养殖业细菌性病害的威胁是世界性的，几乎侵害所有的水产养殖动物，危害特别大，一定程度上限制了水产养殖的可持续性发展。引起水产养殖动物的细菌性病害的病原菌有几十种，如何有效的防治，是困扰整个养殖业的难题。
水产养殖动物中的鱼类等高等生物具有完整的免疫系统，借鉴疫苗在人类和家禽畜的病害预防的成功经验，通过利用免疫接种来预防水产养殖动物的细菌病原的侵染将是控制病害发生的有效途径。通常水产养殖动物的免疫接种方式主要有注射，浸泡/喷雾以及口服等方式，由于口服免疫操作方便，对养殖动物无伤害，并且免疫接种不受时间、地点、鱼体大小的限制等优点，普遍被看好。由于口服免疫过程中抗原很容易被破坏，不能有效到达鱼的肠道刺激机体产生较强的免疫应答。另外口服免疫要求的抗原剂量远远大于注射和浸泡免疫。如何改善口服疫苗的特性，防止疫苗的抗原性被破坏和提高疫苗的有效性是口服免疫成败的关键。
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种水产养殖口服弧菌疫苗的制备方法，可减少口服疫苗被消化系统降解，同时又添加免疫促进剂，可大大提高疫苗的使用效率，提高口服疫苗保护率。本发明的应用减轻水产细菌性病害的危害，减少养殖风险，提高养殖的成活率。推动水产养殖的健康发展。
本发明的制备方法，向病原菌发酵液中加入甲醛灭活，离心弃取上清，加入无菌生理盐水悬浮沉淀，菌体终浓度为40～100亿/ml左右。按1∶9体积比例将灭活菌液加入到制备的0.2～2g％海藻酸纳、0.3～10％淀粉、0.1～2％的β-1-3D葡聚糖和0.1～2％壳聚糖混合液中，制成水产养殖动物细菌性病害的口服疫苗，此疫苗使用时的剂量为与水产养殖动物饲料以1∶9的比例混匀后使用，并可通过造粒，干燥后使用。口服此疫苗可同时提高特异性和非特异性免疫，用来投喂水产养殖动物(如鱼类，鳖，等)，免疫保护率可达20％～60％。
本发明通过加入海藻酸纳和壳聚糖可以减少抗原过早在消化道内被破坏，增强抗原的刺激时间，提高抗原的有效性，并且相对于注射和浸泡免疫用疫苗，口服疫苗具有实用和方便的特点。
本发明的具体方法是(1)病原菌的灭活将发酵后的养殖动物病原菌(如病原鳗弧菌，哈维氏弧菌，爱德华氏菌，副溶血弧菌，病海鱼弧菌，嗜水气单胞菌等)菌液中加入0.4～0.9％甲醛，室温放置24～120小时以完全灭活病原菌。(2)菌液中甲醛的去除将甲醛灭活后的菌液通过离心机以3000g～10000g离心30～10分钟，除去上清液后，加入无菌生理盐水冲洗沉淀，然后再3000g～10000g条件下离心30～10分钟，除去上清，目的是除去溶液中的甲醛，最后加入无菌0.3-0.5％生理盐水定溶到菌体浓度为40～100亿/ml左右。(3)口服疫苗用溶液的制备量取90ml蒸馏水，通过加入3mol的NaOH调节pH为8～11，并加热到45℃，搅拌同时缓慢加入0.2～2g海藻酸钠，待海藻酸钠完全溶解后，用HCl将溶液pH调回到pH6～7，向溶液中加入0.3～10克的淀粉、0.1～2g的β-1-3D葡聚糖以及0.1～2g甲壳素搅拌使其充分溶解混合，加热煮沸3～5分钟使其充分溶解，无菌环境下冷却到37℃以下。(4)制备口服疫苗在无菌操作下将已经准备好的40～100亿/ml灭活弧菌菌体10毫升加入到已经制备好的口服疫苗用溶液中，37-45℃水浴条件下搅拌使菌体和溶液充分混匀，此便是水产养殖细菌性病害用的液态的口服疫苗。(5)疫苗的使用制备好的液态口服疫苗使用前以1∶9的比例加相应的水产养殖动物的饲料。或者将液态的口服疫苗以1∶9的比例加相应的水产养殖动物的配方饲料，混合均匀后通过造粒机造粒，干燥成不同大小的颗粒料来投喂水产养殖动物。制备的口服疫苗用来投喂水产养殖动物(如鱼类，鳖，等)，免疫保护率20％～60％。
具体实施例实施例1将鳗弧菌的2216E发酵后的菌液中加入终浓度0.5％的甲醛，室温放置40小时以完全灭活病原菌。将甲醛灭活后的菌液通过离心机以3000g离心30分钟后，除去上清液后，加入0.85％的无菌生理盐水冲洗沉淀，然后再3000g条件下离心30分钟，除去上清，最后加入无菌0.35％NaCl水溶液定溶到50亿/ml鳗弧菌菌体浓度。同时制备口服疫苗用溶液的制备量取90ml蒸馏水，通过加入3mol/l的NaOH调节pH为10，并加热到45℃，搅拌同时缓慢加入0.7g海藻酸钠，待海藻酸钠完全溶解后，用HCl将溶液pH调回到pH6，向溶液中加入3克的淀粉、0.4g的β-1-3D葡聚糖以及0.5g甲壳素搅拌使其充分溶解混合，加热煮沸3分钟使其充分溶解，无菌环境下冷却到37℃以下。制备口服疫苗要在无菌操作下将已经准备好的50亿/ml灭活弧菌菌体10毫升加入到已经制备好的口服疫苗用溶液中，37℃水浴条件下搅拌使菌体和溶液充分混匀，此便是水产养殖细菌性病害用的液态的口服疫苗。将液态的口服疫苗以1∶9的比例加相应的水产养殖动物的配方饲料，混合均匀后通过造粒机造粒，干燥成不同大小的颗粒料来投喂水产养殖动物。2004年利用制备的口服疫苗用来投喂海水养殖的30克和150克左右大菱鲆和牙鲆连续投喂14天，服用疫苗后一个月，利用108cfu/ml的鳗弧菌进行人工攻毒检测免疫后鱼的免疫保护率结果如下
实施例2将哈维氏弧菌的2216E发酵后的菌液中加入终浓度0.5％的甲醛，室温放置40小时以完全灭活病原菌。将甲醛灭活后的菌液通过离心机以3000g离心30分钟后，除去上清液后，加入0.85％的无菌生理盐水冲洗沉淀，然后再3000g条件下离心30分钟，除去上清，最后加入无菌0.35％NaCl水溶液定溶到50亿/ml鳗弧菌菌体浓度。同时制备口服疫苗用溶液的制备量取90ml蒸馏水，通过加入3mol/l的NaOH调节pH为10，并加热到45℃，搅拌同时缓慢加入0.7g海藻酸钠，待海藻酸钠完全溶解后，用HCl将溶液pH调回到pH6，向溶液中加入5克的淀粉、0.6g的β-1-3D葡聚糖以及1g甲壳素搅拌使其充分溶解混合，加热煮沸3分钟使其充分溶解，无菌环境下冷却到37℃以下。制备口服疫苗要在无菌操作下将已经准备好的50亿/ml灭活弧菌菌体10毫升加入到已经制备好的口服疫苗用溶液中，37℃水浴条件下搅拌使菌体和溶液充分混匀，此便是水产养殖细菌性病害用的液态的口服疫苗。将液态的口服疫苗以1∶9的比例加相应的水产养殖动物的配方饲料，混合均匀后通过造粒机造粒，干燥成不同大小的颗粒料来投喂水产养殖动物。利用制备的口服疫苗用来投喂海水养殖的30克和150克左右牙鲆和鲈鱼连续投喂14天，服用疫苗后一个月，利用108cfu/ml的哈维氏弧菌进行人工攻毒检测免疫后鱼的免疫保扩率结果如下
权利要求
1.一种水产养殖动物细菌性病害口服疫苗的制备方法，其特征在于它的制备步骤(1)病原菌的灭活向发酵后的水产养殖动物病原菌菌液中加入甲醛，室温放置24～120小时灭活；(2)将甲醛灭活后的菌液通过离心机离心除去上清液后，加入无菌生理盐水冲洗沉淀，然后再离心除去上清，最后加入无菌生理盐水使菌体浓度为40～100亿/ml左右；(3)按重量百分比，将0.2-2％海藻酸钠，0.3～10％淀粉、0.1～2％β-1-3D葡聚糖以及0.1～2％甲壳素，84％-99.2％的蒸馏水混合成口服疫苗用溶液，37℃水浴条件下搅拌使40～100亿/ml的菌液和口服疫苗用溶液以1∶9的比例充分混匀，此时便是水产养殖细菌性病害液态的口服疫苗。
2.如权力要求1所述的一种水产养殖动物细菌性病害预防用疫苗的制备方法，其特征在于，制备好的液态口服疫苗使用前以1∶9的比例加相应的水产养殖动物的饲料中使用。
3.如权力要求1所述的一种水产养殖动物细菌性病害预防用疫苗的制备方法，其特征在于，将液态的口服疫苗以1∶9的比例加相应的水产养殖动物的配方饲料，混合均匀后通过造粒机制造成不同大小的颗粒，干燥后的成口服疫苗饵料。
4.如权力要求1所述的一种水产养殖动物细菌性病害预防用疫苗的制备方法，其特征在于，上述的病原菌为鳗弧菌，哈维氏弧菌，爱德华氏菌，副溶血弧菌，病海鱼弧菌，嗜水气单胞菌。
全文摘要
一种水产养殖动物细菌性病害口服疫苗的制备方法。本发明通过在病原菌发酵液中加入甲醛灭活，离心后加入无菌生理盐水，将灭活菌液按1∶9体积比例加入到制备的含有0.2～2g％海藻酸纳、0.3～10％淀粉、0.1～2％β－1－3D葡聚糖和0.1～2％壳聚糖混合液中，制成水产养殖动物细菌性病害的口服液态疫苗，此疫苗与水产养殖动物饲料以1∶9的比例混匀后使用，并可通过造粒，干燥后使用。制备的口服疫苗用来投喂水产养殖动物(如鱼类，鳖，等)，免疫保护率20％～60％。本发明可以减少抗原过早在消化道内被破坏，使抗原更有效，并且具有使用方便的特点。
文档编号A61K39/116GK1931364SQ20061006892
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月8日 优先权日2006年9月8日
发明者陈刚 申请人:陈刚