一种微生物源水产动物用天然饲料添加剂及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学与生物发酵工程技术领域，尤其涉及一种微生物源水产动 物用天然饲料添加剂及应用。
【背景技术】
[0002] 随着我国水产养殖业的迅速发展，水产动物病害日趋严重，各种抗生素、杀虫剂等 药物大量的使用，不仅威胁了水产品的安全，还造成了严重的水体污染。养殖病害和环境问 题已成为制约我国水产养殖业发展的重要因素之一。以对虾为例，我国自20世纪90年代初 开始爆发病毒性病害，至今仍无有效的防治方法，这使我国的对虾养殖业蒙受巨大的损失， 国家每年因此造成的经济损失高达几十亿元。然而，目前我国的禽类，特别是水产动物病害 防治水平还较低，只能依靠抗生素等药物来治疗一些细菌性疾病，对于危害更为严重的病 毒性疾病的防治则尚无解决办法，这也是世界性的一大难题。
[0003] CpG寡核苷酸主要存在于特定的细菌和病毒基因组中，也可以人工设计合成，具有 激活机体免疫系统的作用。CpG寡核苷酸通常有一定的结构特征，即以胞嘧啶鸟嘌呤二核苷 酸为核心，5'端紧接2个嘌呤，3'端紧接2个嘧啶，一般用X 1X2CpGY1Y2 (X1S嘌呤，X 2为嘌呤 或胸腺嘧啶，Y为嘧啶）表示。由于不同动物的免疫激活对寡核苷酸结构的要求有所不同 (主要是CpG的两翼序列），因此可以针对不同动物的免疫特点，通过人工合成的含有非甲 基化的寡核苷酸序列，对寡核苷酸进行分子设计和改造，以产生具有最佳免疫激活效应的 CpG寡核苷酸。
[0004] 动物免疫系统正是通过识别寡核苷酸的特征结构来识别微生物DNA和自身DNA， 诱导产生抗菌多肽物质，从而形成针对病原体的特异免疫防护机制，起到免疫激活和抗菌 作用。CpG寡核苷酸具有优良的免疫刺激活性，可直接激活单核细胞、巨噬细胞、树突状细 胞等抗原递呈细胞，分泌多种Thl型细胞因子，如干扰素（IFN)、白细胞介素 （IL-1、IL-12) 等物质，促进机体产生抗原特异性的免疫反应，并能引发强的抗体反应和Thl型体液免疫 应答，其显著的免疫激活效应是传统多糖药物所无法比拟的。同时，CpG寡核苷酸作为天 然药物，无毒副作用，与目前广泛使用的各种抗生素等相比，无药物残留和产生抗药性等问 题，不污染环境。此外，CpG寡核苷酸是一种免疫激活制剂，它能提高机体的整体防病与抗 病能力，对各种细菌、病毒等病原微生物具有广谱的抵抗能力，而且在人、畜禽、鱼类、贝类、 虾等动物中都具有明显的作用，使用面广，功效全面，是一种具有重大开发价值的新型生物 制品。
[0005] 2001年Eastoott等将免疫刺激序列DNA与破伤风毒素和铝剂联用，通过胃插管和 唾液腺皮下注射两种途径免疫大鼠，检测发现经粘膜途径免疫的大鼠血清IgG和分泌IgA 远远高于仅破伤风毒素和铝剂联用而产生的抗体。这与经皮下注射免疫产生的抗体水平相 当。McCluskie等将免疫刺激序列DNA与破伤风毒素联用，通过口服途径免疫小鼠，发现免 疫刺激序列能诱发强烈的Thl型免疫应答，产生高滴度的IgG，而破伤风毒素不能诱导免疫 应答。这些研宄表明，CpG寡核苷酸可以通过口服的方式进入体内发挥作用而效力不受影 响，这为CpG寡核苷酸作为抗病药物饲料的研制，提供了科学依据和保证。
[0006] 目前，国际上对CpG寡核苷酸的研宄主要在医学应用开发，而且重点是针对人类 重大疾病的防治和常见脊椎动物的疫病防控，针对鱼虾等水产动物的开发和研宄应用甚 少。此外，虾蟹等无脊椎动物因缺少获得性免疫系统，主要依赖生物活体或生物代谢过程中 产生的具有生物活性的物质或从生物体提取的物质作为养殖病害的防治药物，没有安全、 有效的免疫调节物质。因此，开发一种对水产动物免疫系统有显著增强效应的无公害、无残 留的生物制品至关重要。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了 一种微生物源水产动物用天然饲料添加剂及应用，该水产动物用 饲料添加剂用于水产养殖动物的病害防治，可显著增强抗原的体液和细胞免疫反应，全面 提高水产动物的机体免疫力，具高免疫活性。
[0008] 一种水产动物用饲料添加剂，通过如下方法制备：
[0009] (1)构建包含CpG序列的重组工程菌；
[0010] (2)将所述重组工程菌扩大培养；
[0011] ⑶收集菌体，破碎、干燥，制得所述水产动物用饲料添加剂。
[0012] 具体地，步骤（1)中，所述重组工程菌的构建方法包括：
[0013] (1)将人工合成的CpG序列克隆入pMD19-T载体中，构建重组质粒pMD19-T-CpG ; 所述CpG序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0014] (2)利用同尾酶Xho I和Sal I双酶切重组质粒pMD19-T-CpG，获得两端具有相同 黏性末端的CpG片段，并将该CpG片段重组入经Xho I酶切的pYES2载体中，构建重组质粒 pYES2-CpG ；
[0015] (3)重复步骤（2)的操作，将CpG序列五次重复重组于载体pYES2中，构建重组质 粒pYES2-5CpG，电转化入毕赤酵母中，获得重组工程菌。
[0016] 其中，所述重组工程菌为毕赤酵母（Pichia pastpris)GC01。该菌株于2012年7 月20日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所内的中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，命名为毕赤酵母（Pichia pastpris)GC01，保 藏号为：CGMCC NO. 6368。
[0017] 所述重组工程菌扩大培养的方法包括：种子培养、初始培养和补料培养。其 中，初始培养即为发酵培养，发酵培养的培养基组成成分为：25g/L葡萄糖、10g/L蛋白 胨、10g/L(NH 4)2S04、7g/L KH2P04、lg/L K2HP04、0.5g/LMgS04.7H20、0.3g/L MnS04、0.3g/L FeSO4 · 7H20, ρΗ5· 0。
[0018] 作为优选，发酵培养的温度为28~30°C，时间为10~15h，可促进菌株生长。
[0019] 制备酵母粉的方法有很多种，作为优选，本发明中所述制备酵母粉的方法为：取发 酵液，5000r/min离心20min收集菌体，KKTC水浴处理15min，4°C冰浴冷却，进行超声破碎， 超声破碎条件为：超声破碎功率450W，破碎时间20min，时间间隔（工作时间：间歇时间）为 10: 8 (s/s);超声破碎后经25~30°C气流干燥，制成酵母粉；该条件下制备的酵母粉在作 为水产动物用饲料添加剂时的效果更佳。
[0020] 本发明还提供了一种包含所述水产动物用饲料添加剂的水产动物饲料。
[0021] 作为优选，以每千克水产动物饲料计，水产动物用饲料添加剂的添加量为30~ 40g/kg。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果，如下：
[0023] (1)利用同尾酶技术5次重组CpG序列，构建出具有90个CpG基序的高拷贝CpG DNA重组质粒，可有效激活鱼虾等水产动物的免疫系统，具有广谱适用性；
[0024] (2)通过工程菌的自身繁殖大量扩增免疫刺激序列，有效解决了人工合成CpG DNA 成本昂贵、生产效率低、不适于大规模生产等问题，便于工业化推广；
[0025] (3)本发明水产动物用饲料添加剂，即高免疫活性CpG DNA酵母粉，可直接添加入 水产动物养殖的饲料中，使用操作简便，并且具有安全性好、低毒、高效等优点。
【附图说明】
[0026] 图1是含不同CpG基序的重组pYES2的Hindlll/Xbal酶切电泳图，其中，泳道1 为 pYES2-CpG ;泳道 2 为 pYES2-2CpG ;泳道 3 为 pYES2-3CpG ;泳道 4 为 pYES2-4CpG ;泳道 5 为 pYES2-5CpG ;泳道 M 为 DL2000DNA Marker ;
[0027] 图2是含不同CpG基序的重组E. coli ToplO的菌落PCR鉴定结果，其中，泳道0 为含pYES2的E. coli ToplO菌落；泳道1为含pYES2-CpG的E. coli ToplO菌落；泳道2为 含 pYES2-2CpG 的 E. coli ToplO 菌落；泳道 3 为含 pYES2-3CpG 的 E. coli ToplO 菌落；泳道 4 为含 pYES2-4CpG 的 E. coli ToplO 菌落；泳道 5 为含 pYES2-5CpG 的 E. coli ToplO 菌落， 泳道 M 为 DL2000DNA Marker ;
[0028] 图3是酵母工程菌GCO1高密度培养过程曲线。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0030] 本发明实施例中所述的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 以下实施例所使用的培养基组分及其浓度如下：
[0032] IOXYNB :13. 4g YNB溶于IOOmL去离子水，加热至YNB完全溶解，过滤除菌，4°C保 存。
[0033] IOXD :200g葡萄糖溶于1000 mL去离子水中，高压灭菌15min或过滤除菌，4°C保 存。
[0034] 500X生物素 ：20mg生物素溶于IOOmL去离子水中，过滤除菌，4°C保存。
[0035] MD平板：800mL去离子水（若制平板加 20g琼脂粉），121°C灭菌20min，待温度冷 却至60°C，2mL的500X生物素、IOOmL的10XYNB、100mL的10XD，混匀，倒平板。
[0036] 种子培养基：即Yro液体培养基：蛋白胨2