0g、酵母膏10g，溶于900mL去离子水 (若制平板加20g琼脂粉），121°C灭菌30min，冷却后加入IOOmL的10XD，4°C保存。
[0037] 发酵培养基：葡萄糖25g、蛋白胨 10g、（NH4)2S0410g、KH2P0 47g、K2HP04lg、MgS04 ·7Η20 0· 5g、MnSO4O. 3g、FeSO4 · 7Η20 0· 3g，加去离子水至 1000mL，用氨水调 ρΗ5· 0，121°C 灭菌 30min〇
[0038] 发酵补料培养基：葡萄糖500g、蛋白胨70g、MgS04 ·7Η20 10g，加去离子水lOOOmL， 105°C灭菌 40min。
[0039] 实施例1水产动物CpG DNA重组质粒的制备
[0040] (1)人工设计合成对水产动物具有免疫激活效应的CpG序列，并对全链核苷酸进 行硫代修饰和聚丙烯酰胺电泳纯化（纯度99. 99% )。该序列包含18个CpG基序，并在3' 末端引入Xho I酶切位点，形成含18CpG基序的DNA片段。CpG序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0041] (2)将CpG DNA片段定向克隆于pMD19-T载体中，构建重组质粒pMD19-T-CpG，并 转入DH5a菌株中进行扩大培养；利用碱裂解法小批量提取质粒DNA，使用琼脂糖凝胶电 泳检测。
[0042] (3)利用同尾酶Xho I和Sal I双酶切重组质粒pMD19-T-CpG，获得两端具有相同 黏性末端的CpG DNA片段；利用Xho I单酶切pYES2载体，使其线性化；电泳鉴定并割胶回 收目的片段，进行连接反应；
[0043] 连接体系如下：2· 5 μ I 10XT4DNA ligase buffer、4 μ 1 目的DNA(CpG DNA)、1 μ 1 载体（pYSE2)、lyl T4DNA ligase，加无菌水至25μ1。16°C反应过夜。连接体系中质粒与 目的DNA的摩尔比约为I : 10~1 : 100 ;
[0044] 连接完成后质粒转化E. coli ToplO感受态细胞，Amp抗性筛选转化子；菌落PCR、 Hindlll/Xbal酶切电泳鉴定克隆子。
[0045] (4)重复步骤（3)的操作，将CpG DNA片段五次重复重组于载体pYES2中，构建重 组质粒pYES2-5CpG ;将重组质粒pYES2-5CpG转化到E. coli ToplO中，用Amp抗性筛选转 化子，并用菌落PCR、Hind ΙΙΙ/Xba I酶切和电泳鉴定克隆子，最后由Invitrogen公司对 pYES2-5CpG进行测序。
[0046] 实施例2 CpG DNA重组质粒的转化和工程菌的扩大培养
[0047] (1)将构建的pYES2_5CpG质粒电转化毕赤酵母（Pichia pastpris)GS115菌株，电 转化参数为V = I. 5kV，25uF，2000hms，4~IOmsec ;电转化后菌株涂布MD平板（含2mg/mL G418)，置于30°C培养，直至出现单菌落；经质粒提取，酶切和电泳等鉴定确定pYES2-5CpG 质粒已转入毕赤酵母中，获得工程菌；
[0048] (2)种子培养阶段
[0049] 取上述构建的工程菌接种于50mL种子培养基中，30°C、220r/min培养16h作为一 级种子，按10%接种量接入200mL种子培养基中，30°C、220r/min培养24h作为二级种子。
[0050] (3)初始培养阶段
[0051] 将二级种子接种到装有3L发酵培养基的发酵罐中发酵，接种量为10%，发酵时间 控制在12h左右，发酵时溶氧量在30 %以上，温度为30°C，pH控制在5. 0 (通过流加20 %氨 水调节pH值）。
[0052] (4)补料培养阶段
[0053] 初始培养结束后，进行流加补料培养基。根据发酵液中残糖浓度调节流加速率， 将葡萄糖浓度控制在I. 〇g/L以下。补料时间为30h，补料总体积为I. 6L，发酵时溶氧量在 30%以上，温度为30°C，pH控制在5.0(通过流加20%氨水调节pH值）。发酵结束时细胞 干重达到69. 4g/L。
[0054] (5)发酵结束后，取发酵液在5000r/min条件下离心20min收集菌体，用蒸馏水清 洗3遍后，按酵母泥与水的重量比为1 : 4配制酵母悬浮液；将酵母悬浮液置于100°C水浴 中处理15min，4°C冰浴冷却，进行超声破碎，超声破碎条件为：超声破碎功率450W，破碎时 间20min，时间间隔（工作时间：间歇时间）为10 : 8 (s/s);超声破碎后的酵母悬浮液经 25~30°C气流干燥，制成酵母粉。取适量酵母粉用酵母质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA， 紫外分光光度法测定浓度。结果显示，pYES2_5CpG重组质粒的含量可达到0. 6 μ g/mg酵母 粉，该酵母粉即为水产动物用饲料添加剂。
[0055] 实施例3水产动物用饲料添加剂对鲈鱼的抗病试验
[0056] 鲈鱼幼鱼：取浙江宁海万福海水养殖有限公司鲈鱼幼苗7200尾。幼鱼体重 20-30g，体长 10-15cm。
[0057] 含CpG DNA重组质粒的酵母粉：由浙江皇冠科技有限公司提供。
[0058] 试验分为2组（试验组和对照组），每组3个重复，每个重复放养鱼苗1200尾。试 验组饲喂添加含水产动物用饲料添加剂（即含CpG DNA重组质粒的酵母粉）的抗病饲料 (酵母粉添加量以重量计为30g/kg饲料），对照组饲喂常规饲料（添加正常酵母粉）。维持 水温20~25°C。每天正常投喂饲料，连续投喂4周，统计自然发病死亡率，计算免疫保护率 RPS0
[0059] 结果表明，添加含CpG DNA重组质粒的酵母粉抗病饲料可提高鲈鱼平均成活率 21.70 %，提高RPS 66. 42%。具体情况见表1。
[0060] 相对免疫保护率（Relative Percent Survival，RPS)，RPS = (1-免疫组死亡率 / 对照组死亡率）X 100%。
[0061] 表1水产动物用饲料添加剂对鲈鱼的抗病试验
[0062]
【主权项】
1. 一种水产动物用饲料添加剂，其特征在于，通过如下方法制备： (1) 构建包含CpG序列的重组工程菌； (2) 将所述重组工程菌扩大培养； (3) 收集菌体，破碎、干燥，制得所述水产动物用饲料添加剂。
2. 如权利要求1所述的水产动物用饲料添加剂，其特征在于，所述重组工程菌的构建 方法包括： (1) 将人工合成的CpG序列克隆入pMD19-T载体中，构建重组质粒pMD19-T-CpG;所 述CpG序列如SEQIDNO. 1所示； (2) 利用同尾酶XhoI和SalI双酶切重组质粒pMD19-T-CpG，获得两端具有相同黏 性末端的CpG片段，并将该CpG片段重组入经XhoI酶切的pYES2载体中，构建重组质粒 pYES2-CpG； (3) 重复步骤（2)的操作，将CpG序列五次重复重组于载体pYES2中，构建重组质粒 pYES2-5CpG，电转化入毕赤酵母中，获得重组工程菌。
3. 如权利要求1所述的水产动物用饲料添加剂，其特征在于，所述重组工程菌为毕赤 酵母（Pichiapastpris)GCOl。
4. 如权利要求1所述的水产动物用饲料添加剂，其特征在于，重组工程菌扩大培养 过程中，发酵培养基的组成成分为：25g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、10g/L(NH4)2S04、7g/L KH2P04、lg/LK2HP04、0. 5g/LMgSO4 ? 7H20、0. 3g/LMnS04、0. 3g/LFeSO4 ? 7H20,pH5. 0。
5. 如权利要求4所述的水产动物用饲料添加剂，其特征在于，发酵培养的温度为28~ 30°C，时间为10~15h。
6. 如权利要求1所述的水产动物用饲料添加剂，其特征在于，所述破碎为超声破碎，破 碎条件为功率450W，时间20min，工作时间：间歇时间为IOs:8s。
7. 如权利要求1所述的水产动物用饲料添加剂，其特征在于，所述干燥的温度为25~ 30。。。
8. -种包含如权利要求1所述水产动物用饲料添加剂的水产动物饲料。
9. 如权利要求8所述的水产动物饲料，其特征在于，以每千克水产动物饲料计，水产动 物用饲料添加剂的添加量为30~40g/kg。
【专利摘要】本发明公开了一种微生物源水产动物用天然饲料添加剂及应用，该饲料添加剂通过如下方法制备：构建包含CpG序列的重组工程菌；将所述重组工程菌扩大培养；收集菌体，破碎、干燥，制得所述水产动物用饲料添加剂。本发明利用同尾酶技术5次重组CpG序列，构建出具有90个基序的高拷贝CpG DNA重组质粒，可有效激活鱼虾等水产动物的免疫系统，具有广谱适用性；通过工程菌的自身繁殖大量扩增免疫刺激序列，有效解决了人工合成CpG DNA成本昂贵、生产效率低、不适于大规模生产等问题，便于工业化推广；该水产动物用饲料添加剂可直接添加入水产动物养殖的饲料中，使用操作简便，并且具有安全性好、低毒、高效等优点。CGMCC NO.636820120720
【IPC分类】C12N15-117, A23K1-16, A23K1-18, C12N15-81, C12R1-84
【公开号】CN104686845
【申请号】CN201510104320
【发明人】胡向东, 叶茂, 潘玲燕, 邵建忠
【申请人】浙江皇冠科技有限公司, 杭州贝姿生物技术有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月10日