专利名称：一种制备酵母β- 1,3- D-葡聚糖衍生物的制备方法
技术领域：
本发明属于生化制备领域。涉及到利用膨化技术与酸碱溶液处理相结合制备酵母β- 1,3- D-葡聚糖生物的エ艺。
背景技术：
酵母是ー种重要的食品エ业微生物，其细胞壁从外向内分三层，分别为甘露聚糖、蛋白质和葡聚糖。最里层的葡聚糖有三类碱溶性葡聚糖，碱不溶、酸可溶性葡聚糖，酸碱不溶性葡聚糖，其中酸碱不溶性葡聚糖即为活性多糖，除含有少量的β- 1，6键外，几乎都是β _ 1，3键，因此也称(I, 3)-匍聚糖。酵母β _1，3- D-匍聚糖能增强哺乳动物的免疫力、抗癌、抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、降低胆固醇和血脂、促进伤ロ愈合等，是ー种良好的生物效应调节剂。酵母β -I, 3-D-葡聚糖因其难溶性在抗肿瘤等的临床应用上受到限制，其高度的粘性、持水性和热稳定性以及制备エ艺简单等优点，在食品、医药、化妆品、农业、造纸和建筑材料等行业中广泛应用。从酵母细胞中提取β_1，3- D-葡聚糖就是要从细胞壁中去除甘露聚糖和蛋白质。酵母细胞壁是β -I, 3-D-葡聚糖的ー个主要来源，早在1939年人们就提出啤酒酵母具有免疫增强特性，但直到I960年才研究发现提供免疫特性的主要因素是存在于酵母细胞壁的葡聚糖成分，约占啤酒酵母干重的15%。葡聚糖构象对其活性的影响并非主要的，β -I, 3-糖苷键才是其具有抗肿瘤活性的关键。碱不溶性葡聚糖的低水溶性限制了它在临床上的应用。虽然ロ服通常不会产生毒副作用，但静脉注射就可能产生ー些无法估计的毒副作用，例如肝脾肿大，微血栓形成，循环系统崩溃、炎性肉芽肿形成等。因此需要对β-l，3-D-葡聚糖进行衍生化改性，获得水溶 性良好且具有免疫活性的羧甲基葡聚糖。β -I, 3-D-葡聚糖的衍生化就是在分子表面取代一定的亲水基团，增加水溶性并且保持或加强其免疫活性。目前所应用的衍生化手段很多，主要有羧甲基化，羧こ基化，乙基化，磺基化，羧基化等。其方法是选择不同的底物，在一定的介质中，控制一定的反应条件使葡萄糖基上的羟基被底物基团所取代。难点是控制得到一定取代度葡聚糖，使该衍生物能够溶于水而且不破坏它原来的螺旋结构，正是这种构型，使得它具有特殊的活性。比较各种衍生化方法，羧甲基化条件比较容易控制。羧甲基化衍生物在取代度DS=O. 75时，显示出最高的活性，当DS>1.0或分子量较低时，则没有活性。羧甲基葡聚糖与葡聚糖相比具有更强的溶解性和免疫激活效应，能够加强机体的非特异性防御功能如巨噬细胞活化功能，促进TNF-α合成，同时对动物机体也显示了潜在的抗病毒，防辐射和抗突变的能力，能保护大鼠肝细胞免受氧化损伤。葡聚糖水溶性衍生物同时具有显著的抗肿瘤活性。羧甲基葡聚糖可以使内毒素血症动物肿瘤坏死因子水平显著降低，能够抑制小鼠肉瘤细胞的转移。目前国内外采取的提取方法主要有酸法、碱法、酸碱综合法等，这些方法的提取条件一般都比较剧烈，酸碱试剂容易腐蚀仪器设备、对环境污染严重，得到的葡聚糖成品纯度不高，需要进ー步纯化。碱破壁法构成酵母细胞壁的葡聚糖有两层一层是可以被碱水解的，另ー层则不溶于碱。当利用碱溶液对酵母进行破壁吋，碱可以溶解掉酵母细胞壁中的碱可溶性葡聚糖层，同时溶解部分脂类，从而使酵母细胞壁的通透性变大，胞内物质容易析出。本实验采用自溶后的酵母残渣，外加膨化解除去大量的蛋白质及其它杂质，降低后续碱处理工序中碱液浓度和用量，以便在较温和的条件下尽量保持葡聚糖的分子结构完整，提高碱不溶性葡聚糖成品的得率及纯度，为啤酒废酵母的综合利用提供理论依据。在国内外报道中，关于β- 1，3- D-葡聚糖的制备，多采用酸、碱或与有机溶剂相结合的方法。曾有人分别用Sevage法、酸法和碱法进行对比、测试，发现用Sevage法难以从啤酒酵母中提取i3-l，3_D-葡聚糖；酸法浸提所得的粗多糖得率高，但含大量甘露聚糖及蛋白质，纯度不高，エ艺过于复杂，且酸法腐蚀设备，危害工人健康；碱法浸提エ艺简单，产品为较高纯度的β_1，3-D-葡聚糖，是从废酵母中有效β- 1,3- D-葡聚糖的理想途径。
发明内容
本发明的目的正是为了提供一种制备酵母β- 1,3- D-葡聚糖的方法，本发明的方法利用膨化技术与酸碱溶液处理相结合制备酵母β -I, 3-D-葡聚糖生物，不仅可大大节约制备1，3- D-葡聚糖的时间，而且降低提取成本。本发明的目的可通过下述技术措施来实现
本发明的方法是通过以下步骤来实现的
Α、采用下列(a)或(b)方法进行碱处理和膨化；
a、碱处理取啤酒酵母IOOg加入200-300ml的IM氢氧化钠，在温度80_100°C条件下作,2h后,在3000r/min的速度下离心15min,水洗2遍,过滤离心,收集沉淀物；膨化将所述沉淀物放入微波炉中膨化，微波处理火力为高火，微波处理时间为10分钟；
b、双螺杆膨化机膨化以啤酒酵母为原料，按每IOOg啤酒酵母加1-1.5M氢氧化钠15—20ml，在拌匀条件下缓缓加入膨化机，螺杆转速30HZ，膨化温度120_130°C;所述膨化机为双螺杆膨化机；
B、中和处理将步骤I所得膨化进行降温处理，当其温度低于50°C吋，缓慢加入体积分数为20%的こ酸进行中和，こ酸加入量为使提取物的pH值降低至7.0时为止。C、分离将步骤2所得中和液在转速4 000 r/min下进行离心分离，收集、合并离心液；加热真空浓缩至原体积的一半，然后加入2倍体积的体积分数为95%的こ醇；
D、羧甲基化制备将步骤3得到的提取液，按每IOOg啤酒酵母加入15g的氢氧化钠混合均匀，35°C下搅拌O. 5 h ;然后按每IOOg啤酒酵母加入一氯こ酸20g，在50°C条件下搅拌反应3 h，反应产物用95%こ醇洗涤，沉淀24 h，得到羧甲基葡聚糖生成物，生成物干燥；
E、按质量质量体积=1:1.25:1. 25取葡聚糖、氢氧化钠、ー氯こ酸，，放入2倍体积的体积分数为95%的こ醇溶液中，在醚化温度50°C、醚化时间3h、碱化温度35°C、碱化时间
O.5 h条件下进行反应；在此エ艺条件下，所得羧甲基葡聚糖的取代度为O. 79。本发明的有益效果
本发明的方法采用膨化辅助提取明显地缩短了提取时间，并且提高了多糖的提取率，优于其它提取方法；采用辅助法提取多糖产量较其他エ艺高，优化工艺科学可行，这样加快了羧甲基葡聚糖的制备速度，为啤酒废酵母多糖的药物开发和保健品的应用提供帮助；不仅可大大节约制备1，3- D-葡聚糖的时间，而且可降低提取成本。
具体实施例方式本发明以下将结合实施例作进ー步描述
本发明的エ艺如下
啤酒废酵母碱溶解一微波破碎(或双螺杆膨化机膨化破碎)一离心一上清液浓缩一加醇沉淀一羧甲基化一真空干燥一羧甲基葡聚糖。实施例I :
1、碱处理取IOOg酵母加IM氢氧化钠200-300ml，在温度80_100°C条件下作用2h后， 在3000r/min的速度下离心15min,水洗2遍,过滤离心,收集沉淀；
2、微波膨化将沉淀收集的碱处理过的酵母放入微波炉中膨化，微波处理火力为高火，微波处理时间为8分钟；注意控制微波处理火力和时间，膨化期间，用微波专用勺翻动酵母，使其受热均匀；
3、中和处理将步骤2所得膨化进行降温处理，当其温度低于50°C吋，缓慢加入体积分数为20%的こ酸进行中和，こ酸加入量为使提取物的pH值降低至7.0吋；
4、分离将中和液在转速4000 r/min下进行离心分离，收集、合并离心液，加热真空浓缩至原体积的一半,然后加入其2倍体积的体积分数为95%的こ醇；
5、羧甲基化制备将步骤3得到的提取液，按每IOOg啤酒酵母加入15g的氢氧化钠混合均匀，35で下搅拌0.5 h ;然后按每IOOg啤酒酵母加入一氯こ酸20g，在50°C条件下搅拌反应3 h，反应产物用95%こ醇洗涤，沉淀24 h，得到羧甲基葡聚糖生成物，生成物干燥；
6、取葡聚糖、氢氧化钠、ー氯こ酸投料比为I:I. 25:1. 25 (质量/质量/体积)，放入2倍体积的体积分数为95%的こ醇溶液中，在醚化温度50°C、醚化时间3 h、碱化温度35°C、碱化时间O. 5 h条件下进行反应；在此エ艺条件下，所得羧甲基葡聚糖的取代度为O. 79。实施例2:
1、碱处理100g酵母加IM氢氧化钠200-300ml，温度80-100°C，作用2h后3000r/min离心15min,水洗2遍,过滤离心,收集沉淀；
2、双螺杆膨化机膨化沉淀收集的酵母，缓缓加入膨化机膨化，螺杆转速30HZ，膨化温度120-130°C。膨化机为双螺杆膨化机，螺杆转速30HZ，膨化温度可控；
3、中和处理将1，2上述提取物进行降温处理，当其温度低于50°C吋，缓慢加入体积分数为20%的こ酸进行中和，こ酸加入量为使提取物的pH值降低至7.0时为止；
4、分离将中和液在转速4000 r/min下进行离心分离，收集、合并离心液，加热真空浓缩至原体积的一半,然后加入其2倍体积的体积分数为95%的こ醇；
5、羧甲基化制备将步骤3得到的提取液，按每IOOg啤酒酵母加入15g的氢氧化钠混合均匀，35°C下搅拌O. 5 h ;然后按每IOOg啤酒酵母加入一氯こ酸20g，在50°C条件下搅拌反应3 h，反应产物用95%こ醇洗涤，沉淀24 h，得到羧甲基葡聚糖生成物，生成物干燥；
6、取葡聚糖、氢氧化钠、ー氯こ酸投料比为I:1.25 1.25 (质量/质量/体积)，放入2倍体积的体积分数为95%的こ醇溶液中，在醚化温度50°C、醚化时间3h、碱化温度35°C、碱化时间O. 5 h条件下进行反应；在此エ艺条件下，所得羧甲基葡聚糖的取代度为O. 79。
权利要求
1.一种制备酵母β- 1,3- D-葡聚糖衍生物的制备方法，其特征在干所述方法是通过以下步骤来实现的 Α、采用下列(a)或(b)方法进行碱处理和膨化； a、碱处理取啤酒酵母IOOg加入200-300ml的IM氢氧化钠，在温度80_100°C条件下作用2h后,在3000r/min的速度下离心15min,水洗2遍,过滤离心,收集沉淀物；膨化将所述沉淀物放入微波炉中膨化，微波处理火力为高火，微波处理时间为10分钟； b、双螺杆膨化机膨化以啤酒酵母为原料，按每IOOg啤酒酵母加1-1.5M氢氧化钠15-20ml，在拌匀条件下缓缓加入膨化机，螺杆转速30HZ，膨化温度120_130°C ； B、中和处理将步骤I所得膨化进行降温处理，当其温度低于50°C吋，缓慢加入体积分数为20%的こ酸进行中和，こ酸加入量为使提取物的pH值降低至7.0时为止； C、分离将步骤2所得中和液在转速4000 r/min下进行离心分离，收集、合并离心液；加热真空浓缩至原体积的一半，然后加入2倍体积的体积分数为95%的こ醇； D、羧甲基化制备将步骤3得到的提取液，按每IOOg啤酒酵母加入15g的氢氧化钠混合均匀，35で下搅拌0.5 h ;然后按每IOOg啤酒酵母加入一氯こ酸20g，在50°C条件下搅拌反应3 h，反应产物用95%こ醇洗涤，沉淀24 h，得到羧甲基葡聚糖生成物，生成物干燥； E、按质量质量体积=1:1. 25:1. 25取葡聚糖、氢氧化钠、ー氯こ酸，放入2倍体积的体积分数为95%的こ醇溶液中，在醚化温度50°C、醚化时间3h、碱化温度35°C、碱化时间O.5 h条件下进行反应；在此エ艺条件下，所得羧甲基葡聚糖的取代度为O. 79。
全文摘要
本发明公开了一种制备酵母β-1,3-D-葡聚糖衍生物的制备方法，所述方法利用膨化技术与酸碱溶液处理相结合制备酵母β-1,3-D-葡聚糖生物，不仅可大大节约制备β-1,3-D-葡聚糖的时间，而且降低提取成本。
文档编号A61P31/12GK102690368SQ201210199499
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者郭宏昌 申请人:郭宏昌