专利名称：利用中波紫外线对离体皮肤消毒的方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明属于一种消毒方法，具体涉及利用中波紫外线对离体皮肤消毒的方法，还涉及用该方法制得的产品。
背景技术：
异体和异种皮肤是临床上替代自体皮肤治疗大面积烧伤的主要敷料，但异种和异体皮肤抗原性强，特别是新鲜皮肤，还带有大量的菌污染，皮肤移植后的强烈免疫排斥反应往往会导致皮肤过早的坏死。中波紫外线(UltravioletRadiationB, UVB),是到达地球表面的紫外线中引起机体生物学效应的主要光谱，波长280-320nm。 经研究表明311nm的窄谱中波紫外线(NB-UVB)在治疗银屑病具良好单一性，红斑反应、色素沉着轻微，且疗效可靠，可产生最佳治疗效果，单纯NB-UVB照射治疗银屑病有效率可达73. 3%，而290-300nm波长的UVB可致皮肤灼伤(红斑效应和角质形成细胞坏死)，而无治疗作用。目前，利用中波紫外线对离体皮肤消毒还处理空白，如何在降低离体皮肤免疫原性的同时，带菌量少，又可保持离体皮肤活性较高。是皮肤移植中亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供利用中波紫外线对离体皮肤消毒的方法，操作简单方便，条件易于控制，对离体皮肤活性影响较小，并能有效控制离体皮肤的带菌量和降低免疫原性。为实现上述发明目的，技术方案为
利用中波紫外线对离体皮肤消毒的方法，将离体皮肤用电压为18(T240V，照射剂量为10(T400J/cm2的中波紫外线照射。优选的，所述离体皮肤置于温度为(T25°C，湿度为40-70%的环境下。更优选的，所述离体皮肤置于温度为25°C，湿度为60%环境下，用电压为220V，照射剂量为300J/cm的中波紫外线照射。更优选的，波紫外线照射前还包括离体皮肤预处理，具体为将离体皮肤制成厚度为I. Omm的材料。本发明中离体皮肤可以选用临床上可接受的皮肤，优选的离体皮肤为离体猪皮，具有来源广泛，成本低的特点。本发明的目的之二在于提供由中波紫外线对离体皮肤消毒制备的离体皮肤，其免疫原性低，带菌量少，皮肤活性高。为实现上述发明目的，技术方案为
所述利用中波紫外线对离体皮肤消毒的方法制备的离体皮肤。本发明的有益效果在于本发明公开的利用中波紫外线对离体皮肤消毒的方法，操作简单，条件易于控制，对离体皮肤活性影响较小，并且制得的离体皮肤带菌量少，免疫原性低，能用于临床上替代自体皮肤治疗大面积烧伤的敷料，具有广泛的应用前景。
具体实施例方式以下将参照实施例，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。一、消毒方法
利用中波紫外线对立体猪皮进行消毒的方法，具体步骤如下
A制皮
取新鲜猪皮，然后制成厚度为O. 8-1. Omm的离体猪皮，切块，备用；
B照射
将步骤A处理的离体猪皮放置于中波紫外线(UVB)恒温箱，并保持猪皮与UVB灯管的 距离小于20cm，按照表I设计的正交试验对猪皮进行处理，得消毒猪皮。取新鲜猪皮，未经UVB处理皮为阴性对照，以25kGYCo~60照射为阳性对照。25kGYCo~60表示用25kGY钴-60的剂量，在辐射加工过程中，受照物质单位质量所吸收的能量，国际单位定义为戈瑞(Gy)，I戈瑞表示I千克(Kg)物质吸收I焦耳(J)能量，I Gy = I J/ Kg ;辐射加工中常用千戈瑞(KGy)表示吸收剂量。表I.正交实验法UVB照射猪皮因素与水平表
因素一
I,压I 温度(-ο；) MS. (%)照射_重(J/cm)
1__180__O__40__IOO_
2__200__5__BO__200_
3__220__15__60__300_
4丨 240 I 25 I 70 I400
备注V—电压；T一温度；S—湿度；Z—照射剂量处理后测定皮肤各指标，分别为UVB对皮肤表皮细胞刺激淋巴细胞增殖抑制率(YZL)；UVB照射对皮肤LC数量下降百分率(LC)5UVB对皮肤带菌量细菌下降百分率(XJ)和UVB照射后的皮肤活性百分率(HX)。二、淋巴细胞增殖实验 I)淋巴细胞的分离
将淋巴细胞分离液(购自上海研拓生物科技有限公司)与健康人全血按体积比为1:1先后加入离心管，在温度为25°c、转速为3000rpm条件下离心20分钟；吸取中间层淋巴细胞层，并用淋巴细胞分离液清洗3次，然后进行活细胞计数，并用质量分数为10%CS-RPMI1640调整细胞浓度至IXlO6 cells/ml。2)表皮细胞的分离
将消毒猪皮剪成O. 3cmX 2cm皮条，加入质量分数为O. 25%的胰蛋白酶(胰蛋白酶与消毒猪皮的体积比为5 :1)，置于4°C冰箱中消化15小时，用镊子轻轻揭下表皮。将表皮剪碎在温度为37°C条件下，用质量分数为O. 25%胰蛋白酶摇床中热消化O. 5小时，加入相当于消化液1/10体积的血清终止消化，在转速为IOOOrpm条件下离心5分钟，然后进行活细胞细胞计数，并用质量分数为10% CS-RPMI 1640调整细胞浓度至I X IO6 cells/mL。3)制板
在96孔板中每孔加入IXlO5 cells淋巴细胞和I X IO4Cells表皮细胞为实验组，空白组单独加入IXio5 cells淋巴细胞，对照组加相同数量的未经UVB处理离体猪皮分离的I X IO4ceIls表皮细胞和I X IO5 cells淋巴细胞，其余用培养液补足，每组做5个复孔。加液完毕，移96孔板在温度为37°C，体积分数为5%的CO2孵育50小时，然后在转速为IOOOrpm条件下离心5分钟，弃液加入质量分数为O. 05%氯丁胶新型交联剂(MTT) 100 μ L，继续培养4小时，培养结束后，弃液加入150 μ L 二甲基亚砜(DMSO)，吹打均匀，待紫色结晶完全溶解，置96孔平底细胞培养板于酶联反应检测仪在波长为570nm处测定OD值。根据如下公式计算抑制率抑制率=1-(实验组OD值-空白组OD值/对照组OD值-空白组OD值)X 100%,结果如表2所示。三、ATP酶染色朗格汉细胞(LC)
按照上述方法分离消毒猪皮的表皮为实验组，并以未经UVB处理的离体猪皮分离表皮作为对照组。
I) ATP 酶染色
将分离下来的表皮分别放入含30g/L的Tris和29g/L的马来酸缓冲液中展开(包括实验组和对照组)，洗涤3次，每次洗涤10分钟；放入含12. 8g/L的二甲肿酸和40g/L的福尔马林的固定液中，在温度为4°C条件下固定20分钟；将固定好的表皮放入含O. 45g/L ATP二钠和2. Og/L硝酸铅的孵育液中，在温度为37°C条件下孵育40分钟；孵育后用浓度为O. Imol/L的Tris-马来酸缓冲液(pH5. 0-8. 5)洗涤3次，每次清洗10分钟；然后在含llg/L的硫化铵中显色20分钟；再用自来水冲洗10分钟。将真皮面向上展平在载玻片上，用甘油明胶封固后，在光镜放大100倍下观察ATP酶染色阳性的树突状细胞(朗格汉细胞)的大小和分布，并显微摄影。2)表皮单位面积LC数量的测定
在光镜放大100倍下，随机选10视野，用目镜网格测微器计算每mm2面积内ATP酶染色阳性树突状细胞(朗格汉细胞)数量，UVB照射对皮肤LC数量下降百分率=(对照组LC数量-实验组LC数量)/对照组LC数量X 100%,结果如表2所示。四、带菌量检测 I)消毒猪皮处理
将消毒猪皮加入灭菌生理盐水，其中消毒猪皮的重量与生理盐水的体积比为I :2，然后将消毒猪皮培养皿用眼科剪将皮片剪成糊状。2)菌培养
以金黄色葡萄球菌和白色念珠菌为阳性对照，以生理盐水为阴性对照，具体方法参照国家药典委员会主编.中华人民共和国药典三部.2005年版，附录73-84。在灭菌营养琼脂培养基倒成培养平板上接种100 μ L消毒猪皮匀浆液，每个样本3个重复。然后在温度为30°C条件下培养48小时，用凝胶成像系统进行菌落计数。用以下公式计算消毒猪皮的带菌量，cfu/g=菌落个数/(皮片重gXlOOyL/加入生理盐水的量yL)。UVB对皮肤带菌量细菌下降百分率=(阳性对照组cfu/g-实验组cfu/g) /阳性对照组cfu/gX 100%,结果如表2所示。表2、UVB照射猪皮条件正交实验法试验的结果
~ If \τ |5 Y \yzl (%) \lc (%) \xj (%) ψχ (%)
~T80"~40 Too" I 0. 281 ~0. 1472099~O. 182168~ O. 9022 | 80 |5 |50|200 \2 |θ. 538|θ· 30253 |θ· 565851 |θ. 91权利要求
1.利用中波紫外线对离体皮肤消毒的方法，其特征在于将离体皮肤用电压为180 240V，照射剂量为10(T400J/cm2的中波紫外线照射。
2.根据权利要求I所述利用中波紫外线对离体皮肤消毒的方法，其特征在于所述离体皮肤置于温度为(T25°C，湿度为40-70%的环境下。
3.根据权利要求2所述利用中波紫外线对离体皮肤消毒的方法，其特征在于所述离体皮肤置于温度为25°C，湿度为60%环境下，用电压为220V，照射剂量为300J/cm的中波紫外线照射。
4.根据权利1-3任一项所述利用中波紫外线对离体皮肤消毒的方法，其特征在于中波紫外线照射前还包括离体皮肤预处理，具体为将离体皮肤制成厚度为O. 8-1. Omm的材料。
5.根据权利要求4所述利用中波紫外线对离体皮肤消毒的方法，其特征在于所述离体皮肤为离体猪皮。
6.权利要求1-5任一项所述利用中波紫外线对离体皮肤消毒的方法制备的离体皮肤。
全文摘要
本发明公开了利用中波紫外线对离体皮肤消毒的方法，具体为，将离体皮肤用电压为180~240V，照射剂量为100~400J/cm的中波紫外线照射，其方法简单，条件可控，消毒后的皮肤活性高，带菌量少，并且抗原性强，制备的消毒皮肤能够用于替代自体皮肤治疗大面积烧伤的敷料。
文档编号A61L2/10GK102716505SQ201210217819
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者刘宇, 商海涛, 曾本华, 王勇, 郭科男, 魏泓 申请人:中国人民解放军第三军医大学