血斑标本采集和处理方法及其采集卡干血斑dna提取方法

专利名称：血斑标本采集和处理方法及其采集卡干血斑dna提取方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体是一种血斑标本采集和处理方法及其采集卡干血斑DNA提取方法。
背景技术：
目前，用于地中海贫血基因诊断的DNA是从抗凝全血中提取的。该方法用柠檬酸钠或EDTA抗凝管保存静脉血，需在_20°C冰箱中低温保存，不耐运输，送检不方便。因些，急需一种方便运输的样本采集方法和高提取率的DNA提取方法
发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种血斑标本采集和处理方法及其采集卡干血斑DNA提取方法。本发明是通过以下技术方案实现的
一种血斑标本采集和处理方法，包括以下步骤
(1)米血
Φ ·婴儿采血
()用热毛巾温浴采血部位不超过41°C，3 5分钟；
(i i)酒精消毒，用无菌纱布垫擦干；
(iii)针刺，无菌纱布垫擦去第一滴血；
(Iv )用血样标本采集卡蘸取单个血滴，让血滴充分浸润采血圈，形成血斑；至少采集3个米血圈；
上述婴儿米血，6周 4月或小于5kg的婴儿米用脚后跟米血法；4 10月或5 IOkg的婴儿采用脚大拇指采血；大于10月或大于IOkg的婴儿采用手指采血；
②·采用静脉采血，用柠檬酸钠或EDTA抗凝管静脉血，采集的抗凝全血用移液器移取
75 80ul全血，对准血样标本采集卡采血圈中心缓慢将血液滴加在采集卡上，形成血斑，避免气泡产生；至少采集3个血圈；
上述静脉采血用于婴儿之外的人群；
(2)采集卡血斑处理
血样采集完毕后，将制成的采集卡在干燥桌面放置3 4小时风干，形成干血斑，不要放在太阳下晾晒或用任何人工方法(如烘干机)加速干燥；(3)采集卡干血斑的保存
采集卡风干后，将每张采集卡分装入封口袋中，并在封口袋中放入干燥剂，轻轻将封口袋的空气挤压出去在封口，遵循一袋一卡的原则，以避免交叉污染；
(4)采集卡干血斑的递送
准确填写样本信息卡后，将采集卡和信息卡一同放入大信封，采用常温运输。上述采集卡干血斑DNA提取方法，包括以下步骤
(1)将采集卡上的2个或以上血斑用打孔器打孔3*3mm(或将圆形的血斑剪下后，剪为约3*3_的样品)，置于I. 5ml离心管中；
(2)加入300 400ul的TissueLysis Buffer,加入20ul蛋白酶K，震荡混匀；
(3)56°C温浴lh，期间颠倒混匀3 5次；
(4)取200ul上清液转入新的I.5ml离心管中，加入200ul的溶液L，70°C温浴IOmin,期间颠倒2 3次；
(5)加入200ul4°C的无水乙醇，室温放置5min ；
(6)将液体转入带硅胶柱的2ml离心管中，IOOOOrpm离心lmin，倒掉离心管的收集管中的废液，将硅胶柱放入收集管中；
(7)在硅胶柱中加入500ul溶液Wl，10000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱放入收集管中；
(8)在娃胶柱中加入500ul溶液W2,IOOOOrpm离心lmin,倒掉收集管中的废液；
(9)重复步聚8；
(10)将硅胶柱放入收集管中，12000rpm空管离心3min，倒掉收集管中的废液；
(11)将硅胶柱放入新的I.5ml离心管中，开盖静置I 2min，往硅胶柱中心加入60ul的TE洗脱液，静置2 5min, 12000rpm离心2min,弃柱得DNA ；
所述溶液L为含有10% GuSCN、10% Tris的水溶液，溶液Wl为含有10%GuSCN、P/oEDTA、25%无水乙醇的水溶液，溶液W2为含有75%无水乙醇的水溶液，TE洗脱液为含有l%Tris、1%EDTA的水溶液，以上溶液除无水乙醇是体积浓度外，其他的皆为质量百分比浓度。本发明采用过柱法的提取DNA，操作简单，快速省时，获得的DNA纯度高。血斑标本可在常温保存，耐运输，方便送检，可代替抗凝全血作为基因诊断的DNA提取标本。


图I为本发明所采用的血样标本采集卡。图2为采集卡干血斑。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明进行详细的说明。实施例
一、对22个成年人进行本发明的血斑标本采集和处理 I.静脉采血用柠檬酸钠抗凝管静脉血，采集的抗凝全血用移液器移取80ul全血，对准如图I所示的血样标本采集卡采血圈中心缓慢将血液滴加在采集卡上，形成血斑，避免气泡产生；采集3个血圈；2.采集卡血斑处理
血样采集完毕后，将制成的采集卡在干燥桌面放置4小时风干，形成如图2所示的干血
斑；
3.采集卡干血斑的保存
采集卡风干后，将每张采集卡分装入封口袋中，并在封口袋中放入干燥剂，轻轻将封口袋的空气挤压出去在封口，遵循一袋一卡的原则，以避免交叉污染；
4.采集卡干血斑的递送
准确填写样本信息卡后，将采集卡和信息卡一同放入大信封，采用常温运输。 上述采集卡干血斑DNA提取
1.将采集卡上的2个圆形的血斑剪下后，剪为3*3mm的样品，置于I. 5ml离心管中(每处理完一个样本后，剪刀均需用75%乙醇擦拭，晾干后在酒精灯上烧热)；
2.加入300ul的Tissue Lysis Buffer,加入20ul蛋白酶K,震荡混勻；
3.56°C温浴lh，期间颠倒混匀4次；
4.取200ul上清液转入新的I.5ml离心管中，加入200ul的溶液L，70°C温浴lOmin，期间颠倒3次；
5.加入200ul4°C的无水乙醇，室温放置5min ；
6.将液体转入带硅胶柱的2ml离心管中，IOOOOrpm离心lmin，倒掉离心管的收集管中的废液，将硅胶柱放入收集管中；
7.在硅胶柱中加入500ul溶液Wl (使用前先检查是否加入无水乙醇)，IOOOOrpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱放入收集管中；
8.在硅胶柱中加入500ul溶液W2 (使用前先检查是否加入无水乙醇)，IOOOOrpm离心lmin，倒掉收集管中的废液；
9.重复步聚8；
10.将硅胶柱放入收集管中，12000rpm空管离心3min，倒掉收集管中的废液；
11.将硅胶柱放入新的I.5ml离心管中，开盖静置2min，往硅胶柱中心加入60ul的TE洗脱液(55°C预热)，静置5min，12000rpm离心2min，弃柱得血斑DNA。二、对上述22个成年人进行传统的抗凝全血DNA采集和处理
使用传统检测手段对同样的22个成年人进行抗凝全血DNA的采集和处理，得到抗凝全血 DNA。三、样品检测
将上述提取的血斑DNA和抗凝全血DNA采用潮州凯普生物化学有限公司生产的α -和β-地中海贫血基因检测试剂盒进行地贫基因检测。22例抗凝全血DNA和血斑DNA的地贫基因检测结果如下
权利要求
1.一种血斑标本采集和处理方法，包括以下步骤 (1)米血 X .婴儿采血 G )用热毛巾温浴采血部位不超过41°C，3 5分钟； Gi)酒精消毒，用无菌纱布垫擦干； Gii)针刺,无菌纱布垫擦去第一滴血； (IV )用血样标本采集卡蘸取单个血滴，让血滴充分浸润采血圈，形成血斑；至少采集3个米血圈； 上述婴儿米血，6周 4月或小于5kg的婴儿米用脚后跟米血法；4 10月或5 IOkg的婴儿采用脚大拇指采血；大于10月或大于IOkg的婴儿采用手指采血； I ·采用静脉采血，用柠檬酸钠或EDTA抗凝管静脉血，采集的抗凝全血用移液器移取75 80ul全血，对准血样标本采集卡采血圈中心缓慢将血液滴加在采集卡上，形成血斑，避免气泡产生；至少采集3个血圈； 上述静脉采血用于婴儿之外的人群； (2)采集卡血斑处理 血样采集完毕后，将制成的采集卡在干燥桌面放置3 4小时风干，形成干血斑； (3)采集卡干血斑的保存 采集卡风干后，将每张采集卡分装入封口袋中，并在封口袋中放入干燥剂，轻轻将封口袋的空气挤压出去在封口，遵循一袋一卡的原则，以避免交叉污染； (4)采集卡干血斑的递送 准确填写样本信息卡后，将采集卡和信息卡一同放入大信封，采用常温运输。
2.权利要求I所述采集卡干血斑DNA提取方法，包括以下步骤 (1)将采集卡上的2个或以上血斑用打孔器打孔3*3mm，或将圆形的血斑剪下后，剪为3*3_的样品，置于I. 5ml离心管中； (2)加入300 400ul的TissueLysis Buffer,加入20ul蛋白酶K，震荡混匀； (3)56°C温浴lh，期间颠倒混匀3 5次； (4)取200ul上清液转入新的I.5ml离心管中，加入200ul的溶液L，70°C温浴IOmin,期间颠倒2 3次； (5)加入200ul4°C的无水乙醇，室温放置5min ； (6)将液体转入带硅胶柱的2ml离心管中，IOOOOrpm离心lmin，倒掉离心管的收集管中的废液，将硅胶柱放入收集管中； (7)在硅胶柱中加入500ul溶液Wl，10000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将硅胶柱放入收集管中； (8)在娃胶柱中加入500ul溶液W2,IOOOOrpm离心lmin,倒掉收集管中的废液； (9)重复步聚8； (10)将硅胶柱放入收集管中，12000rpm空管离心3min，倒掉收集管中的废液； (11)将硅胶柱放入新的I.5ml离心管中，开盖静置I 2min，往硅胶柱中心加入60ul的TE洗脱液,静置2 5min, 12000rpm离心2min,弃柱得DNA ； 所述溶 液L为含有10% GuSCN、10% Tris的水溶液，溶液Wl为含有10%GuSCN、P/oEDTA、25%无水乙醇的水溶液，溶液W2为含有75%无水乙醇的水溶液，TE洗脱液为含有l%Tris、1%EDTA的水溶液，以上溶液除无水乙醇是体积浓度外，其他的皆为质量百分比浓度。
全文摘要
本发明公开了一种血斑标本采集和处理方法及其采集卡干血斑DNA提取方法。所述血斑标本采集和处理方法，包括以下步骤(1)采血；(2)采集卡血斑处理；(3)采集卡干血斑的保存；(4)采集卡干血斑的递送。本发明的血斑标本可在常温保存，耐运输，方便送检，可代替抗凝全血作为基因诊断的DNA提取标本。
文档编号A61B5/153GK102866038SQ20121036429
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者苏彬峰, 邱美兰, 卢敏 申请人:广东凯普生物科技股份有限公司