专利名称：胃泌素在阴离子交换蛋白2中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、细胞生物学、药理学领域，具体是指胃泌素作为调节剂在阴离子交换蛋白2中的应用。
背景技术：
胃泌素又称为促胃液素，其基因位于17号染色体g区，长度为4. lkb，是ー种重要的肽类胃肠激素，它主要由胃幽门部黏膜的G细胞分泌。人体产生的胃泌素肽类按长度分有三种其中活性最高的是由17个氨基酸合成的多肽，称小胃泌素，它是胃窦提取物的主要形式I. Gastrin-34 有 34 个氨基酸，称作 biggastrin ；2. Gastrin-17 有 17 个氨基酸，称作 Iittlegastrin ；3. Gastrin-14有14个氨基酸,称作minigastrin,而此14个氨基酸就有全部的生理活性。人体正常胃泌素的生理值为空腹血清胃泌素为20 160ng/L ;餐后将增高2 3倍。目前市场上已经有五肽胃泌素用于临床诊断，但仅用于胃液分析，并非治疗用药，对于慢性萎縮性胃炎等疾病的治疗多局限于饮食调整和中医调理，无法达到标本兼治的目的，如中国专利文献号CN101890157A中记载的“胃泌素在抑制胃肠肿瘤细胞中的应用”，该文献公开了胃泌素在抑制胃肠肿瘤细胞中的新的应用，即胃癌靶基因阴离子交換蛋白I与肿瘤抑制蛋白P16相互作用，诱发胃癌，而胃泌素能够有效地抑制胃癌靶基因AEl和pl6的表达，从而达到治疗胃癌的目的。阴离子交換蛋白2(AE2)在人的肾、肠、血管、肺、胆管上皮细胞、小肠黏膜隐窝细胞、绒毛细胞的刷状缘及早孕绒毛中存在，其中以胃AE2表达最为丰富。一旦AE2表达异常，则会导致众多病理变化。AE2-/-小鼠，则表现为瘦弱、牙无法萌出和严重生长迟缓，大部分死于断乳期。此外，该种小鼠还表现无胃酸症。可见，AE2是机体不可或缺的重要成分。阴离子交换蛋白2是介导胃泌素调节细胞内pH值的重要因子。AE2调节细胞内PH值、细胞内Cl—和HCO3-的代谢，AE2在多种细胞中均有分布，但是在壁细胞含量最高。病理情况下，免疫组化发现在胃体癌和胃底癌患者中AE2表达缺乏或降低，血清胃泌素水平也下降，并且血清胃泌素水平和胃癌大小负相关。正常胃液pH參考值为O. 8 I. 8 ;空腹胃液游离酸0 30U ;总酸度10 50U ；基础胃酸分泌量(BAO) :1. 92 5. 88mmol/h ;最大胃酸分泌量(MAO) 3 23mmol/h (女性略低)；高峰胃酸分泌量(PAO) 12. 23 28. 97mmol/h。胃酸缺乏症的诊断标准ρΗ3· 5 7. O为低酸，ρΗ7.0为无酸。胃酸缺乏的病因精神紧张、发热、植物神经功能紊乱等，能引起交感神经神经兴奋的因素，可暂时抑制胃酸分泌，导致胃酸減少。刺激性食物和药物长期服用对胃粘膜有強烈刺激的饮食及药物，如浓茶、烈酒、辛辣或水杨酸盐类药物直接作用于胃粘膜导致胃酸分泌減少。萎縮性胃炎、胃癌、恶性贫血等疾病，可引起胃酸明显减少或缺乏。十二指肠液的反流，胰液中的磷脂与胆汁和胰消化酶一起，能溶解粘液，并破坏胃粘膜屏障，促使H+及胃蛋白酶反弥散入粘膜，引起损伤。免疫因素免疫功能的改变能够引起萎缩性胃炎导致胃酸分泌減少。胃切除术后，也可引起胃酸分泌減少。甲状腺功能减低50%患者胃酸缺乏或无胃酸，这因有抗胃泌素抗体存在之故，糖尿病患者常伴有免疫缺陷，可引起胃酸缺乏。现有技术中有采用奥美拉唑进行胃壁细胞中酸泵的抑制，是ー种弱碱性物质，抑制H+/K+JVTP酶(质子泵)的活性。这种对胃酸形成的抑制作用呈剂量相关性，并高度抑制基础胃酸分泌和刺激性胃酸分泌。人体静脉给予奥美拉唑能够迅速降低胃内酸度，24小时内平均下降90%。幽门螺杆菌是导致胃炎的主要因素。幽门螺杆菌和胃酸一起是导致消化性溃疡的主要因素。奥美拉唑与抗生素合用可根除幽门螺杆菌，这与迅速缓解症状、胃粘膜修复率高及消化性溃疡病的长期缓解相关，并因此减少了胃肠道出血等并发症。质子泵抑制剂所致胃酸減少，可増加胃肠道内正常菌群的数量，如沙门菌和弯曲杆菌属感染胃肠道的危险性可能増加。由于奥美拉唑在抑制胃酸的同时会影响消化功能，引起腹胀等不适症状，甚至发生萎縮性胃炎，影响患者生活质量，且慢性萎縮性胃炎及胃酸缺乏与胃癌发生相关。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种胃泌素在阴离子交換蛋白2中的应用，将其作为阴离子交換蛋白的调节剂，纠正了以往的错误观点即认为胃酸分泌增多造成胃黏膜损伤及反复修复，并由此诱发胃癌，所以大量应用奥美拉唑等质子泵抑制剂以抑制胃酸分泌。通过胃泌素适量促进胃酸的分泌及胃黏膜修复以产生保护胃黏膜的有益效果，目前并没有能够用于刺激胃酸分泌的药物问世，在此背景下，胃泌素具有良好的临床应用前景。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及一种胃泌素在阴离子交換蛋白2中的应用，即将胃泌素作为调节剂用于阴离子交換蛋白2(AE2)的表达。所述的应用进ー步包括用于促进细胞内的离子转运活性。所述的促进采用ΙΟ,-ΙΟ'οΙ/Ι的胃泌素培养或皮下注射胃泌素实现。所述的培养时间为24小时-30天。所述的应用进ー步包括用于制备治疗胃酸缺乏症的药物。所述的胃酸缺乏症包括但不限于慢性胃炎。所述的药物用于促进胃酸分泌。本发明的关键在于胃泌素通过调节ΑΕ2蛋白促进离子交換，刺激胃酸的分泌，对于胃酸缺乏患者(尤其是胃炎、胃癌导致的胃酸缺乏患者)具有胃粘膜保护作用。本发明为胃泌素应用于胃酸缺乏提供依据，将为胃酸缺乏症的患者带来新的希望。
图I为实施例中胃泌素刺激小鼠胃黏膜增厚示意图。
图2为实施例中胃泌素通过ΑΕ2作用保护小鼠胃黏膜示意图。
图3为实施例中胃泌素刺激小鼠AE2的表达示意图。
图4为实施例中胃泌素促进细胞内AE2的表达示意图。
图5为实施例中胃泌素促进离子转运示意图。
图6为实施例中胃泌素通过胆囊收缩素B受体(CCKBR)调节AE2的表达示意图。
图7为实施例中胃泌素刺激胃酸分泌示意图。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例I
(I)胃泌素刺激小鼠胃黏膜增厚
利用化学刺激法构建慢性萎缩性胃炎动物模型取成年健康雌性C57BL/6小鼠50只，随机分为实验组对照组，实验组给予氨水(O. 05% O. 1% )，采用ロ服给药法取代小鼠饮用水；こ醇(40% )，每双周一、四空腹灌胃一次，毎次8ml/kg;脱氧胆酸钠(20mmol/L)，单周每日灌胃一次，毎次8ml/kg。对照组给予双蒸水为饮用水，生理盐水取代脱氧胆酸钠、酒精灌胃，每次8ml/kg。
化学建模四个月后，胃泌素组给予皮下注射胃泌素(0.4mg/ml)，每天两次，每次2mg/kg (血中胃泌素浓度约l(T7mol/L);连续给药30天。通过样本全胃的石腊切片、HE染色观察发现利用化学刺激法成功构建慢性萎縮性胃炎动物模型，胃泌素可治疗慢性萎缩性胃炎，减轻胃粘膜萎縮症状，通过镜下測量小鼠胃粘膜厚度，发现胃泌素治疗组小鼠的胃粘膜相对于对照组明显增厚(图1A)，经过统计分析发现胃泌素治疗组和对照组的小鼠胃粘膜厚度具有显著性差异(图1B)。
⑵胃泌素通过AE2作用保护小鼠胃黏膜。
对模型小鼠胃组织HE染色显示正常胃粘膜组织，在分泌胃酸的壁细胞细胞膜和胞浆中可见明显的AE2阳性分布(棕色)，(图2A和B) ；HE染色显示胃组织呈慢性萎縮性胃炎表现，部分腺体萎縮，单箭头显示腺体肠化明显，AE2表达阴性，而双箭头显示相对正常的胃泌酸腺体，AE2表达阳性(图2C和D) ；HE染色显示胃粘膜腺体萎縮，星号显示明显的炎细胞浸润表现，提示胃粘膜炎症反应明显，但是由于给予了 10_7mol/L胃泌素干渉后，胃粘膜腺体仍表达丰富的AE2蛋白(图2E和F)。
(3)胃泌素刺激小鼠AE2的表达。
重复化学刺激法构建慢性萎縮性胃炎动物模型模型，给予不同浓度的胃泌素处理，取小鼠胃组织进行石蜡包埋、切片，用免疫组织化学的方法进行AE2表达的检测，发现相对于给予生理盐水的对照组，在血中10_1(1，10_9，10_8，10_6mol/L浓度的胃泌素作用下，均可见AE2的表达增加(图3)。
(4)胃泌素促进AE2的表达。
SGC7901细胞系用含有10,、10_9、10_8、10' 10_6mol/L五种不同浓度的胃泌素的培养液培养24小时,提取蛋白进行western blot检测，随着胃泌素浓度的增加，AE2表达升高(图4A)。动物试验中，C57小鼠随机分为四组，分别给予生理盐水，胃泌素，胃泌素和DIDS，DIDS静脉注射，15分钟后，注射胃泌素组小鼠的AE2mRNA和蛋白表达均明显升高，而AE2的阻断剂能够抑制胃泌素对AE2表达的促进作用(图4B)。
(5)胃泌素促进离子转运。
将SGC7901细胞用l(T7mol/L胃泌素培养24小时，其细胞内PH值由7.86±0. 30降至7.22±0.25，而每分钟pH值的变化率(dpHi/dt)由O. 091 ±0.031每分钟增至0.23±0.066毎分钟。说明了胃泌素促进了细胞内的离子转运活性(图5)。
(6)胃泌素通过胆囊收缩素B受体(CCKBR)调节AE2的表达
设计并构建SSKBR干扰载体并验证其有效性，选择干扰效果最佳的载体进行后续试验(见图6A左)。选择I号干扰载体转染SGC7901细胞,提取蛋白进行western blot分析，可见AE2表达降低(见图6A右)，说明CCKBR介导了胃泌素上调AE2的作用。此外， SGC7901经过不同浓度的CCKBR的阻断剂丙谷胺处理，AE2表达呈现出依次递减的表现(图6B)，进ー步证实胃泌素通过胆囊收缩素B受体调节AE2。
(7)胃泌素刺激胃酸分泌
SGC7901细胞系用含有胃泌素的培养液培养8、10、12、24小时，细胞内pH值随时间延长而递减，证明其具有刺激胃酸分泌的作用(图7A)。C57小鼠分为四组，分别给予生理盐水、胃泌素、胃泌素和DIDS、DIDS静脉注射，15分钟后测量胃酸分泌情況，结果显示，胃泌素刺激了胃酸的分泌，而DIDS通过抑制AE2的功能而使胃泌素对胃酸的分泌作用受到抑制(图7B)。
具体实现细胞培养和处理SGC7901细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，用含有10%胎牛血清的DMEM培养液，在37°C，含5% CO2的空气的条件下进行培养。在进行实验的时候，细胞以2-5xl05个/mL的密度接种，加入指定浓度的胃泌素或者AE2蛋白特异性抑制剂DIDS(Sigma).免疫印迹法将处理过的细胞用SDS裂解，提取全蛋白备用，配制10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，将此前裂解的蛋白质分别加入上样孔中，并开始电泳，电泳结束后，将蛋白通过电转移到硝酸纤维膜上(AmershamBioscience,UK)。硝酸纤维膜用含5%的脱脂牛奶封闭以后,分别孵育AE2的ー抗和相应ニ抗。最用用辣根过氧化物酶(CellSignaling，MA, U. S. A)按照使用说明检测信号。所有实验均重复至少三次。离子交换活性的检测将HEK-293T细胞以及用胃泌素、胃泌素+DIDS、单独使用DIDS按照相应浓度处理的细胞分别接种在35mm的培养皿上，用不含血清的培养液洗过之后用ImL含2 μ MBCECF-AM的不含血清的培养液在37°C孵育20分钟。然后用不含血清的培养液洗两遍，再用含Cl-的 Ringer ' s 缓冲液(5mMglucose, 5mMpotassiumgluconate, ImMcalciumgluconate,ImMMgSO4, 2. 5mMNaH2P04, 25mMNaHC03, IOmMHepes, pH7. 4)避光孵育 20 分钟。在培养皿中对不同细胞爬片分别用含HOmMNaCl的Ringer' s缓冲液和含140mMsodiumgluconate的Ringer' s 缓冲液交替的进行灌流。用装备有 NIK0NTE2000EMicroscope ,HAMAMATSUIRCCDJVCcoIorvideomonitor, DAD-8VCPP8pinchvalve 灌流系统(激发波长 440and490nm,发射波长528.7nm)的离子成像仪来获得并记录下荧光图象。然后用高何尼日利亚菌素法通过在四个pH值6. 5,7. 0,7. 5和8. O的荧光强度校正来得到pH曲线。在单个HEK293T细胞内的C1_/HC03_交換活性通过Cl—的渗出以及重新渗入时引起的与pH曲线线形相关变化得到。胃酸测定C57小鼠分为四组，分别给予生理盐水、単一胃泌素、胃泌素和DIDS共同、単一DIDS静脉注射，15分钟后进行胃酸分泌情况测试。结果分析由于胃泌素在体内的作用存在级联放大效应，因此相对胃癌细胞系，短时间内即显现出效果，在人胃癌SGC7901细胞系用含有胃泌素的培养液培养8、10、12、24小吋，提取蛋白进行westernblot检测，结果表明AE2的表达明显升高。 在动物试验中，C57小鼠分为四组，分别给予生理盐水、10,至10_6mol/L単一胃泌素、胃泌素和DIDS共同、单ー DIDS静脉注射，15分钟后，注射胃泌素组小鼠的AE2mRNA和蛋白表达均明显升高，而AE2的阻断剂DIDS能够抑制胃泌素对AE2表达的促进作用。将SGC7901细胞用10_7mol/L的胃泌素培养24小时以内，其细胞内pH值由7. 86±0· 30降至7. 22±0· 25，而每分钟pH值的变化率(dpHi/dt)由0. 091 ±0. 031每分钟增至0. 23±0. 066毎分钟。说明胃泌素促进了细胞内的离子转运活性。胃泌素通过胆囊收缩素B受体(CCKBR)调节AE2的表达设计并构建针对SSKBR的干扰载体，转染SGC7901细胞,提取蛋白进行westernblot分析,可见AE2表达降低(见图3上)，SGC7901经过不同浓度的CCKBR的阻断剂丙谷胺处理，AE2表达呈现出依次递减的表现。C57小鼠分为四组，分别给予生理盐水、10,至10_6mol/L単一胃泌素、胃泌素和DIDS共同、単一 DIDS静脉注射，15分钟后进行胃酸分泌情况测试，測量小鼠的胃酸分泌情况，结果显示，胃泌素刺激了胃酸的分泌，而DIDS通过抑制AE2的功能阻断胃泌素促进胃酸分泌的作用(见图3上)。SGC7901细胞系用含有胃泌素的培养液培养8、10、12、24小吋，细胞内PH值不断下降。
权利要求
1.一种胃泌素在阴离子交换蛋白2中的应用，其特征在于，将胃泌素作为调节剂用于阴离子交换蛋白2的表达。
2.—种胃泌素在阴离子交换蛋白2中的应用，其特征在于，用于促进细胞内的离子转运活性。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征是，所述的促进采用10_1(l-10_6mOl/L的胃泌素培养或皮下注射胃泌素实现。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述的培养时间为24小时-30天。
5.一种胃泌素的应用，其特征在于，用于制备治疗胃酸缺乏症的药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是，所述的胃酸缺乏症包括但不限于慢性胃炎。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征是，所述的药物用于促进胃酸分泌。
全文摘要
一种医药领域的胃泌素在阴离子交换蛋白2中的应用，将胃泌素作为调节剂用于阴离子交换蛋白2的表达以及用于制备治疗胃酸缺乏症的药物。本发明将胃泌素作为阴离子交换蛋白2的调节剂，纠正了以往的错误观点即认为胃酸分泌增多造成胃黏膜损伤及反复修复，并由此诱发胃癌，所以大量应用奥美拉唑等质子泵抑制剂以抑制胃酸分泌。通过胃泌素适量促进胃酸的分泌及胃黏膜修复以产生保护胃黏膜的有益效果，目前并没有能够用于刺激胃酸分泌的药物问世，在此背景下，胃泌素具有良好的临床应用前景。
文档编号A61P1/04GK102847140SQ201210376849
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者索文昊, 王美乔 申请人:上海博奥德医药科技有限公司