专利名称：植物钠钙交换蛋白基因(AtNCL)的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说涉及一种植物钠钙交换蛋白基因(AtNCL)及 其编码蛋白的钠钙转运活性在农作物耐盐品种选育中的应用。
背景技术：
植物对外界环境变化甚至胁迫刺激有着一定的适应性和抵抗能力，这种适应性是 通过植物个体的生理生化机制来完成的。植物抗逆机理的阐明，不仅有着重要的理论意义， 而且有着重要的应用价值。其中植物耐盐性的研究是其中的热点之一。用传统遗传育种的 方式来选育耐盐碱作物难度大、周期长，很难满足我国的显示需求。随着分子生物学的发 展，分子育种开始走进人们的视野。功能基因的发掘和利用也已经成为当今世界生物资源 竞争的重要方面。植物响应盐胁迫的过程是十分复杂的，包括胁迫信号的感知以及下游相应的生理 生化反应过程。钙离子对于植物细胞的结构和生理功能有着重要的作用。钙离子不仅可以 维持细胞壁、细胞膜的稳定性，而且参与细胞内的稳态调控和生长发育的调节过程，在细胞 内起着第二信使的作用。机械刺激、植物激素、病原侵染和胁迫刺激都可以引起胞内自由钙 离子的水平发生变化，这种变化可以通过启动胞内的生理生化过程，是植物对于外界刺激 准确的产生相应的反应。盐胁迫等刺激可以引起植物细胞质中的自由钙离子浓度升高，并持续几分钟。植 物钙信号的产生主要是通过各种钙通道的开放，使钙库中的钙离子释放到细胞质中，从而 造成钙离子水平升高。在植物体内，持续高水平的钙离子会造成细胞内的磷酸盐等产生沉 淀，对植物细胞造成伤害，所以细胞质内的钙离子浓度需要维持在较低的水平，这就依赖于 植物的钙离子排除机制。在植物系统中主要有对钙离子具有高亲和力的直接依赖于腺苷三磷酸(ATP)的 钙泵和对钙离子具有低亲和力的依赖于质子梯度的钙氢离子(Ca2+Al+)反向转运体。在动 物可兴奋细胞中还广泛存在着一种钠钙反向交换蛋白(sodium-calcium exchanger,NCX),可以利用钠离子梯度转运钙离子，从而在心肌等细胞中发挥重要的调控作用。但 在植物中一直没有克隆到具有此类钠钙交换活性蛋白的编码基因。寻找植物中新的钠钙离 子转运蛋白的编码基因，利用不同类型的钙离子转运蛋白在植物对盐胁迫反应的过程中协 同作用，维持胁迫下细胞内的钙离子稳态，并将之应用于植物分子育种，这将有着重要的理 论和实践意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物钠钙交换蛋白基因(AtNCL)的应用。本发明的构思如下本发明所涉及的模式植物拟南芥钠钙交换蛋白基因(AtNCL) 在拟南芥基因组数据库(TAIR)中编号为Atlg53210，该基因开放阅读框全长1758bp (附图 1)，编码585个氨基酸残基组成的蛋白质(附图2)。
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模式植物拟南芥钠钙交换蛋白基因(AtNCL)编码框序列的获得以拟南芥叶片为 材料，提取信使核糖核酸(mRNA)，反转录为cDNA，以其为模板，采用正向5 ‘ -GCTAGCGCCACC ATGAGATTCAGATCTCTCATCTCTC-3，和反向 5，-ACCGGTGGCGACCAGCCAAACCAGTAATC-3，为引物， 聚合酶链式反应扩增获得约1758bp的特异产物(如附图3)，经测序获得碱基序列组成如附 图1。模式植物拟南芥钠钙交换蛋白基因的功能实验首先采用体外培养的动物细胞系 CHO-Kl检测AtNCL蛋白的钠钙转运活性，将附图3扩增获得的1758bp目的条带，用限制性 内切酶NheI和AgeI双酶切连入pDsRedl-Nl载体，获得AtNCL-DsReD融合基因，将其转染 入CHO-Kl细胞，通过荧光显微镜检测DsRed红色荧光蛋白荧光，确定是否为转染阳性细胞， 进而检测在培养介质中存在不同浓度盐条件下，钙离子荧光探针Fluo3荧光指示的细胞内 钙离子的浓度变化，确定转染AtNCL-DsReD融合基因阳性细胞存在钠钙转运活性，而空载 体对照细胞没有检出钠钙交换活性(如附图4)。这一结果表明异源细胞表达的重组AtNCL 蛋白具有钠钙离子反向转运活性。从来源于SAIL突变体库的拟南芥T-DNA插入突变体中筛选鉴定得到AtNCL基因 的缺失突变体，转基因获得超表达株系(附图5A) ,RT-PCR鉴定突变体中没有AtNCL基因全 长转录本而超表达体中转录本增加(附图5B)，在高盐胁迫处理实验中，可以观察到AtNCL 缺失突变体atncl的幼苗与野生型对照相比，存活率和叶绿素含量都显著偏高，而超表达 体略差于野生型(附图5C-D)。这表明AtNCL对模式植物拟南芥幼苗盐胁迫反应中发挥负 调节作用。利用原子吸收光谱法分析AtNCL缺失突变体植株和野生型植株的钠、钙元素含 量，发现在突变体植株中钠含量比野生型低而钙含量相对野生型偏高。在200mM NaCl胁迫 处理1小时后，再测定钠钙元素含量，发现突变体依然维持了较低的钠元素含量(附图6A)。 利用水母发光蛋白监测植株细胞内的钙离子浓度，我们发现在盐胁迫刺激后细胞内的钙离 子浓度都表现出升高，但是AtNCL缺失突变体的钙离子浓度升高的程度比野生型要显著偏 高(附图6B)。利用离子选择性电极扫描技术(SIET)植株的根尖生长点处的钙离子流动情 况，我们发现50mM NaCl刺激后，植株都表现出钙离子外流增强，野生型在10分钟内可以恢 复静息状态而突变体在将近30分钟时才恢复到静息状态(附图6C)。这些实验结果证实了 AtNCL在植物响应盐胁迫下的钙离子的动态变化过程中发 挥着一定的作用，利用该性能，可以将其应用于农作物耐盐品种选育。本发明取得的有益效果是拟南芥AtNCL是拟南芥中存在的一类具有NCX样钠钙 转运活性的蛋白，它参与到植株响应盐胁迫的钙信号消除过程，同时证实了植物中存在一 种新的离子转运机制，通过农作物转基因技术，调节植物钠钙交换蛋白基因的表达，有望获 得耐盐性提高的农作物新品种。
附图1附图2附图3附图4
植物钠钙交换蛋白编码基因(AtNCL)的开放阅读框序列图。 植物钠钙交换蛋白(AtNCL)分析推测的氨基酸序列图。 植物钠钙交换蛋白编码基因(AtNCL)的开放阅读框片段的扩增。 植物钠钙交换蛋白基因(AtNCL)转化CHO-Kl细胞钠钙转运活性测定。
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附图5 植物钠钙交换蛋白(AtNCL)基因缺失或超表达拟南芥幼苗对盐敏感性的 实验。附图6 植物钠钙交换蛋白基因缺失突变体(Atncl)对钠钙离子浓度及转运的影 响。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明。实施例1基因的获得以野生型Col-O叶片为材料，小量提取RNA。实验所用的玻璃器皿在180°C干 烤7-10小时，水、塑料制品、溶液均用DEPC处理后高压灭菌。参照上海华舜生物工程有 限工司的RNARose试剂盒说明书步骤进行。将约IOOmg组织加液氮研磨，置于离心管 中，加入Iml RNARose振荡混勻，室温静止5_10min ；4°C 12000g离心IOmin ；取新EP管 加入200 μ L氯仿，小心将上清移入，用力颠倒离心管充分混勻，静止5-lOmin，待分层后 40C 12000g离心15min ；将上层水相小心转移至一新离心管中，加入等体积异丙醇轻轻混 勻，室温放置5-10min，4°C 12000g离心IOmin ；小心去上清，加入Iml 75%乙醇震荡片刻， 40C 7500g离心5min，小心去上清(尽力吸干)；室温静止使RNA恰好干燥，加入适量DEPC 水。用Nano-DroplOOO微量紫外分光光度计，以双蒸水为对照，分别读出260nm和280nm 的光密度，和RNA样品的浓度。纯度根据A260/A280确定，比值在1. 8-2. 0之间，纯度较 好。用 TAKARA RT-PCR 试剂盒反转录并用引物 5，-ATGAGATTCAGATCTCTCATCTCTCTCCT-3，和 5，-CTACGACCAGCCAAACCAGTAATC-3，，进行 PCR 扩增，即可得到 AtNCL 的全长 CDS 序列。AtNCL的钠钙转运活性用引物5-GCTAGCGCCACCATGAGATTCAGATCTCTCATCTCTC-3，和 5，-ACCGGTGGCGACCAG CCAAACCAGTAATC-3，PCR 扩增 AtNCL 基因，用 NheI 和 AgeI 酶切连入 pDsRedl-Nl 载体。转 染CH0-K1细胞后，培养24小时。用荧光显微镜在543nm激发，可以观察到DsRed的荧光， 则认为AtNCL已经表达。细胞用寡霉素和2-DG抑制能量代谢，并孵入Fluo-3后，以莫能星 导入钠离子，同时以乌苯苷抑制钠钾泵的活性。此时，在细胞外加入含有2毫摩尔钙离子的 缓冲液，利用ZEISS 510-META激光共聚焦显微镜在488nm激发Fluo_3，在505_530nm监测 Fluo-3的荧光，可以得知细胞内的钙离子浓度变化。实验证实，表达AtNCL的细胞可以检测 到细胞内的钙离子浓度升高4-5倍，而空载对照细胞内钙离子浓度几乎没有变化。T-DNA突变体鉴定从SAIL突变体库索取SAIL_791_D12和SAIL_770_A10两个突变体，分别命名 为 atncl-Ι 禾Π atncl-2 禾Ij 用 atncl_l_F 5 ‘ -AGAGAAGAAACGAAACCACGC-3 ‘，atncl_l_ R 5 ‘ -CAATTGATGCAAACAATGACG-3 ‘和 atncl_2_F 5 ‘ -TGCTTAATTCCACGGACAAAC-3 ‘， atncl-2_R 5' -CTTTTGGCTTTCAGTGTCTGG-3‘以及 LB3:5, -TAGCATCTGAATTTCATAACCAATC TCGATACA-3 ‘弓丨物进行PCR鉴定。F和R引物可以扩增跨T-DNA插入位点两侧的DNA序列， 而R引物和LB3引物可以扩增T-DNA和基因组DNA的序列。如果F和R可以扩增出预期条 带，则说明有未插入T-DNA的拷贝存在，如果R和LB3能够扩增出预期条带，则说明存在插 入T-DNA的拷贝，如果两者都能扩增出目的条带，则说明植株是杂合体。通过PCR鉴定出纯和T-DNA插入的植株，小量提取RNA，并进行RT-PCR鉴定AtNCL的RNA水平表达。可以发现 两个突变体植株都没有AtNCL全长mRNA的表达。拟南芥幼苗对盐敏感性的实验野生型和两个突变体的种子经75%乙醇表面消毒后，经4摄氏度72小时冷处理， 点种在1/2MS培养基上，16小时光照，8小时黑暗光周期下，22摄氏度，培养7天后，将幼苗 在无菌条件下移植到含有150mmol/L NaCl的1/2MS培养基上竖直培养，继续培养7天后， 统计存活率并测定叶绿素含量。幼苗以真叶完全白化为标准，统计存活率。样品量大于30 棵，重复3次以上。叶绿素含量测定参照Arnon的方法(Arnon，1949)。将拟南芥幼苗从胚轴部分剪 断，取地上部分，用分析天平称重。每个样品取30株苗，浸泡于2-4mL 80%丙酮中，室温避 光保存，24h后，植株完全失绿，溶有叶绿素的丙酮避光保存，用于叶绿素含量测定。预热HITACHI-U2001分光光度计，设置为双波长模式，两个波长分别为645nm和 663nm。用80%丙酮调0后，逐一测定每个样品的吸光度，按下述公式计算叶绿素含量Cchlor。phyll_a = 10-1*0· 1272*Α663-1(Γ2*0· 2585*A645 (g/L)Cchlor。phyll_b = -1(Γ2*0· 4671*A663+10_1*0. 2288*A645 (g/L)Ctotal 一 Cchlorophyll_a+Cchlorophyll_b (g/L)然后换算为每克鲜重所含叶绿素的量。统计显示，突变体幼苗比野生型幼苗存活率和叶绿素含量都显著偏高。说明在盐 胁迫条件下，AtNCL的基因缺失可以缓解植株的盐害。原子吸收光谱法测定植株钠钙元素含量取生长10天的拟南芥幼苗，迅速在纯水中清洗3-5次以除去可能带有的外源离 子；放入电热鼓风干燥箱中70度烘干后称重，加入一定体积的硝酸，室温静置过夜，然后按 照硝酸高氯酸=4 1的比例补加高氯酸。混勻后在电炉上缓慢加热进行湿法消解，直到 溶液颜色完全变为无色澄清状，再继续加热至酸溶液有大量白烟冒出，体积逐渐减少至0. 4 毫升左右为止，此时应保证溶液中已无大量烟雾冒出时停止加热；待溶液冷却后加入纯水 按比例稀释，在AA240FS+240Z原子吸收分光光度计上利用火焰原子吸收法来测量其吸收 谱线，随之根据稀释被数来确定样品中各种离子的含量。利用水母发光蛋白测定植株细胞内钙离子变化atncl-Ι植株和转水母发光蛋白基因的拟南芥植株(Knight MR, et al.，1987 ； Knight H,et al. ,1998)做杂交，并筛选纯合体，用于测定植株细胞内钙离子变化。测定方 法参考 Knight MR 方法(Knight MR, et al.，1991)。拟南芥种子消毒后铺在MS平板上，4°C避光放置3天后，置22°C光照培养箱中以 16h光照，8h黑暗光周期培养。4天后用于测钙。每10株幼苗为1组，用(^+measurement buffer(0. OlmM KC1,0. ImM CaCl2, ImM MES, ρΗ5· 5)洗涤 3 次后，加入含有 5μΜ coelenterazine-hcp (Promega)的 Ca2+ measurement buffer，室温避光摇动孵育 5h，然后 用Ca2+ measurement buffer洗涤3次后，将幼苗转移到测定生物发光的96孔板中，每孔10 株幼苗，加入IOOyL Ca2+ measurement buffer，上机测定钙信号。Centro LB 960微孔板生物发光检测仪(Berthold，Germany)开机后，用ddH20冲 洗管道3次，每次10个循环。设定每次测定两个孔，一个孔为atncl-Ι背景下的水母发光蛋白转基因株系，另一孔为野生型背景下的水母发光蛋白转基因株系。每个孔每个循环计 数时间为ls，每个循环2. 5s，约2-10分钟后钙信号基本稳定，静息状态下的本底信号值记 作 Lbasal，用泵以缓慢速度泵入 IOOmMNaCl (in Ca2+ measurement buffer) 100 μ L，使 NaCl 终浓度为50mM，继续监测发光信号约lOmin，实时信号值记作Lrt。发光信号用公式计算实验数据并归一化处理AL/L = (Lrt-Lbasal)/Lbasal。Δ L/L表示在NaCl处理前后胞质钙信号的相对变化。离子选择性微电极技术SIET测定植株根尖生长点处钙离子流动SIET (ion-Selective Electrode Technique)是一种可以在不接触实验材料的情 况下测定特定离子的浓度和流动状况的技术。本发明中SIET实验部分在旭月(北京)科 技有限公司完成。以Ca2+浓度梯度和Ca2+微电极为例说明非损伤微测技术离子选择性微电极的工作 原理。Ca2+离子选择性微电极通过前端灌充液态离子交换剂实现选择性。该微电极在待测 离子浓度梯度中以已知距离dx进行两点测量，并分别获得电压Vl和V2。两点间的浓度差 dc则可以从V1、V2及已知的该微电极的电压/浓度校正曲线计算获得。D是离子特异的扩 散常数(单位cm_2. sec"1)，将它们代入Fick第一扩散定律公式=Jtl = D (dc/dx)，可获得该 离子的移动速率(picomol. cnT2· sec-1)。钙选择性电极制备1.5mm玻璃毛细管拉制成2μπι尖端的玻璃电极，内部灌充 100mMCaC12,电极尖端灌充钙离子选择性cocktail (Fluka)。电极用含有lmM，0. ImM和 0. OlmMCaCl2的校正液校正后，Nernstian斜率大于25mV方可使用。氢选择性电极制备1.5mm玻璃毛细管拉制成2μπι尖端的玻璃电极，内部灌充 15mMNaCl和40mM KH2PO4,电极尖端灌充氢离子选择性cocktail (Fluka)。电极用含有pH分 别为5. 5，6. 0，6. 5的校正液校正后方可使用。Nernstian斜率大于50mV方可使用。测定缓冲液按如下配置0. ImM KCl,0. ImM CaCl2,0. ImM MgCl2,0. 5mM NaCl,0. 3mM MES，0. 2mM Na2SO4, and 6% sucrose, pH 6. 0.校正液分别增减相应离子，pH用HCl或NaOH调整。拟南芥种子消毒后，点种在MS平板上铺设的滤纸条上，竖直培养，4天后取下，在 测定缓冲液中平衡30min后，用于SIET测定。监测离子流动相对稳定后，加入4M NaCl至 终浓度50mM，继续检测离子流动大约35min。测定时电极运动距离dX = 30 μ m。数据利用旭月公司在线分析工具(http://xuyue.net/maReflux)计算得到离子 移动速率，然后用Prism4软件统计数据。
权利要求
一种植物钠钙交换蛋白基因(AtNCL)的应用，其特征在于其编码的蛋白具有反向转运钠离子与钙离子的生化活性，在盐等逆境胁迫引起的植物细胞内钙信号的消除中发挥作用，用于耐盐植物的品种的基因改良及农作物耐盐品种选育。
全文摘要
本发明公开了一种植物钠钙交换蛋白基因(AtNCL)及其编码蛋白的钠钙转运活性在农作物耐盐品种选育中的应用。模式植物拟南芥钠钙交换蛋白基因(AtNCL)在拟南芥基因组数据库(TAIR)中编号为Atlg53210，该基因开放阅读框全长1758bp，编码585个氨基酸残基组成的蛋白质。本发明经实验证明，AtNCL参与到植株响应盐胁迫的钙信号消除过程，同时证实了植物中存在一种新的离子转运机制。利用AtNCL上述特性，通过农作物转基因技术，调节植物钠钙交换蛋白基因的表达，可以获得耐盐性提高的农作物新品种。
文档编号A01H5/00GK101955947SQ20101024587
公开日2011年1月26日 申请日期2010年8月5日 优先权日2010年8月5日
发明者孙大业, 崔素娟, 李朝炜, 王鹏 申请人:河北师范大学