专利名称：miR-214在制备预防或治疗老年痴呆症产品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种miR-214在制备预防或治疗老年痴呆症产品中的应用。
背景技术：
老年性痴呆(Alzheimer，AD)是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。AD的病因及发病机制尚未阐明。老年痴呆症作为退化疾病，必须在尸检时才能发现。
发明内容
本发明的一个目的是提供miR-214的新用途。本发明提供了 miR-214在制备如下I)和/或2)产品中的应用I)预防和/或治疗老年痴呆症的产品；2)降低老年痴呆症的神经元细胞死亡数量的产品；所述miR-214的核苷酸序列为序列表中的序列I。上述应用中， 所述老年痴呆症的神经元细胞死亡为由异氟醚诱导引起。上述应用中，所述产品为药物；所述老年痴呆症的神经元细胞为离体细胞。本发明的另一个目的是提供一种产品。本发明提供的产品，为miR-214或miR-214类似物；所述产品为如下I)和/或2) :1)预防和/或治疗老年痴呆症；2)降低老年痴呆症的神经元细胞死亡数量；所述miR-214的核苷酸序列为序列表中的序列I。上述miR-214 类似物为 Syn-mmu-miR-214_3p miScript miRNA Mimic (QIAGENMSY0000661)。上述产品中，所述老年痴呆症的神经元细胞死亡为由异氟醚诱导弓I起。上述广品中，所述广品为药物；所述老年痴呆症的神经元细胞为离体细胞。提高miR-214表达的物质在制备如下I)和/或2)产品中的应用也是本发明保护的范围I)预防和/或治疗老年痴呆症；2)降低老年痴呆症的神经元细胞死亡数量；所述miR-214的核苷酸序列为序列表中的序列I。上述提高miR-214表达的物质为miR-214或miR-214类似物。上述miR-214 类似物为 Syn-mmu-miR-214_3p miScript miRNA Mimic (QIAGENMSY0000661);上述miR-214的核苷酸序列为序列表中的序列I。
上述应用中，所述老年痴呆症的神经元细胞死亡为由异氟醚诱导引起；所述产品为药物；所述老年痴呆症的神经元细胞为离体细胞。本发明的实验证明，与m1-214抑制剂、Scramble相比，miR-214和mi_214类似物可以降低老年痴呆症的神经元细胞的死亡率，说明miR-214具有预防和/或治疗老年痴呆症的作用；在异氟醚的伤害处理下，老年痴呆症的神经元细胞的死亡率增加，但是在miR-214和m1-214类似物租用下仍然可以降低老年痴呆症的神经元细胞的死亡率，说明即使在异氟醚的伤害处理下，miR-214仍具有预防和/或治疗老年痴呆症的作用。
图1为在大鼠神经元中显微注射miR-214或者mimic miR-214 (M_miR-214)抵消了培养基中外源性的Αβ 1-42预处理情况下异氟醚引起的细胞死亡图2为在大鼠神经元中显微注射miR-214或者mimic miR-214 (M_miR-214)抵消了细胞内Aβ 1-42毒性作用下异氟醚引起的细胞死亡
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、miR-214在预防或治疗老年痴呆症中的应用一、老年痴呆症神经元细胞模型的建立对分离培养的神经元进行淀粉样蛋白beta的处理可以很好地模拟老年痴呆症，具体如下1、分离培养获得神经元细胞I)、包被培养前晚上将培养瓶(板)用多聚赖氨酸包被lOmin，吸除，无菌操作台上15min自然晾干,置于培养箱中备用；2)、取脑选取新生24h的SD大鼠(维通立华，名称SD大鼠24小时乳鼠)数只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，D-hanks液洗数次；(预先准备至少4把眼科剪刀，分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第3步的剪组织这4个操作)3)、分离以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，置于冰浴的D-hanks液中，仔细剔除微血管，充分剪碎组织；4)、消化加入同体积O. 125%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，37°C培养箱内消化20min左右，期间轻摇数次；5)过滤加入数滴胎牛血清终止消化，用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即停止吹打，动作要轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液；6)、接种以IlOOrpm离心5min，倾去上清，用DMEM/F12培养液重悬细胞，轻轻吹打，台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为100000个/ml，加入终浓度为10%胎牛血清后接种于培养瓶(板)中，置于37°C、含5%C02培养箱中培养；12小时内禁止晃动
7)、换液接种后24h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液，第48h时加入终浓度为10 μ mol/L的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长，随后每3d半量换无血清DMEM/F12培养液，得到离体神经元细胞。2、淀粉样蛋白beta的处理神经元细胞得到老年痴呆症的神经元细胞模型θΑβ 1-42的处理直接向培养离体神经元细胞的培养液中加入终浓度为I μ m的Αβ 1-42 (BACHEM Η-1368)，培养I天，得到θΑβ 1-42处理老年痴呆症的神经元细胞，即为老年痴呆症的神经元细胞模型。 Αβ 1-42的处理通过显微注射的方法向离体神经元细胞内注射浓度为IOnmA β 1-42水溶液(25Fl/cell)，培养I天，得到iA β 1_42处理老年痴呆症的神经元细胞，即为老年痴呆症的神经元细胞模型。二、miR-214在预防或治疗老年痴呆症中的应用异氟醚，是一种带乙醚样气味的无色澄明液体，用于各种手术全身、半身麻醉。miR-214的核苷酸序列为ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU (序列I);注射前溶于生理盐水(O. 9%氯化钠水溶液)中，得到IOnM的miR-214溶液。Syn-mmu-miR-214~3p miScript miRNA Mimic (QIAGEN MSY0000661 ；又称为 m1-214 类似物或 M-m1-214)、Ant1-mmu-miR-214_3p miScript miRNA Inhibitor(QIAGEN MIN0000661 ;又称为 m1-214 抑制剂或1-m1-214). Scramble 均购自 QIAGEN 公司购买 https://www. qiagen. com/geneglobe/searchresults. aspx hits=10&usedlinktype=link。注射前M-m1-214(mi_214 类似物)、1-m1-214(mi_214 抑制剂)、Scramble 分别溶于生理盐水(0. 9%氯化钠水溶液)中，得到IOnM的M-m1-214 (m1-214类似物)溶液、1-m1-214(m1-214抑制剂)溶液、Scramble溶液。1、miR-214对θΑβ 1-42处理老年痴呆症的神经元细胞模型的影响1)方法分为异氟醚处理组和对照处理组Α、异氟醚处理组(isof Iurane):将eA β 1-42处理老年痴呆症的神经元细胞中加入终浓度为0.5% (异氟醚占细胞培养液的体积百分含量)异氟醚(GuoyaoGroup, Beijing, China)后，在5%C02、37度培养3h得到异氟醚处理组细胞；将异氟醚处理组细胞再进行如下5个小组处理无RNA处理小组不经过任何处理的异氟醚处理组细胞37度5%C02培养；miR-214小组将终浓度IOnM的miR-214溶液按照25fL/cell注射到50个异氟醚处理组细胞中，37度5%C02培养；为提高miR-214表达小组；M-m1-214 (m1-214 类似物)小组将终浓度 IOnM 的 M-m1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50个异氟醚处理组细胞中，37度5%C02培养；为提高miR-214表达小组；1-m1-214 (m1-214 抑制剂)小组将终浓度 IOnM 的 Ii1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50个异氟醚处理组细胞中，37度5%C02培养；为抑制miR-214表达小组；Scramble小组将终浓度IOnM的Scramble溶液按照25fL/cell注射到50个异氟醚处理组细胞中，37度5%C02培养；B、对照处理组(Ctrl):将θΑβ 1-42处理老年痴呆症的神经元细胞在5%C02，37度培养3h得到对照处理组细胞；再将对照处理组细胞进行如下5个小组处理 无RNA处理小组不经过任何处理的对照处理组细胞在37度5%C02培养；miR-214小组将终浓度IOnM的miR-214溶液按照25fL/cell注射到50个对照处理组细胞中，37度5%C02培养；为提高miR-214表达小组；M-m1-214 (m1-214 类似物)小组将终浓度 IOnM 的 M-m1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50个对照处理组细胞中，37度5%C02培养；为提高miR-214表达小组；1-m1-214 (m1-214 抑制剂)小组将终浓度 IOnM 的 Ii1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50个对照处理组细胞中，37度5%C02培养；为抑制miR-214表达小组；Scramble小组将终浓度IOnM的Scramble溶液按照25fL/cell注射到50个对照处理组细胞中，37度5%C02培养；2)细胞死亡率检测(I)上述各小组培养24h时间后，取培养在玻片上的细胞，4%多聚甲醛固定25min，PBS浸洗二次，每次5min ；(2)将吸附细胞的载玻片在O. 2%的Triton X-100中处理15min，PBS浸洗二次，每次5min ；(3)制备TUNEL反应混合液，处理组用50 μ I TdT+450 μ I荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50 μ I荧光素标记的dUTP液。(4)玻片干后，加50 μ I TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50 μ I荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37°C X lh, PBS漂洗3次。(5)玻片干后加50μ1 converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 V X30min, PBS漂洗3次。在培养了细胞的玻片上加50-100 μ IDAB底物，反应15-250C X lOmin, PBS 漂洗 3 次。(6)封片，将已经处理好的玻片倒扣在滴有甘油PBS混合液的载玻片上，用指甲油封片，放在显微镜下观察，有凋亡情况的细胞被染色。统计各小组死亡细胞数量，计算细胞死亡率结果如图1所示。图1的左边柱形图组为对照处理组(ctrl)，右边柱形图组为异氟醚处理组(isof Iurane),具体结果如下对照处理组中的无RNA处理小组、miR-214小组、M-m1-214 (m1-214类似物)小组、1-m1-214 (m1-214抑制剂)小组、Scramble小组中的细胞死亡率分别为52%、27%、30%、86%、54% ;可以看出，与m1-214抑制剂、Scramble和无RNA处理相比，miR-214和m1-214类似物可以降低老年痴呆症的神经元细胞(外源性θΑβ 1-42处理)的死亡率，说明miR-214具有预防和/或治疗老年痴呆症的作用。异氟醚处理组中的无RNA处理小组、miR-214小组、M-m1-214 (m1-214类似物)小组、1-m1-214 (m1-214抑制剂)小组、Scramble小组中的细胞死亡率分别为75%、24%、25%、91%,76% ;可以看出，异氟醚处理组中的无RNA处理细胞死亡率高于对照处理组中的无RNA处理小组，说明异氟醚可以促进老年痴呆症的神经元细胞死亡；而miR-214和m1-214类似物仍然可以降低老年痴呆症的神经元细胞(外源性eA β 1-42处理)的死亡率，说明即使在异氟醚的伤害处理下，miR-214仍具有预防 和/或治疗老年痴呆症的作用。因此，在大鼠神经元中显微注射miR-214或者mimic miR-214 (M_mi R-214)抵消了外源性的θΑβ 1-42处理得到老年痴呆症的神经元细胞模型在异氟醚处理引起的细胞死亡。2、iA β 1-42处理老年痴呆症的神经元细胞模型进行异氟醚处理I)方法分为异氟醚处理组和对照处理组Α、异氟醚处理组(isofIurane):将 Αβ 1-42处理老年痴呆症的神经元细胞中加入终浓度为0.5% (异氟醚占细胞培养液的体积百分含量)异氟醚(GuoyaoGroup, Beijing, China)后，在5%C02、37度培养3h得到异氟醚处理组细胞；将异氟醚处理组细胞再进行如下5个小组处理无RNA处理小组不经过任何处理的异氟醚处理组细胞37度5%C02培养；miR-214小组将终浓度10nM的miR-214溶液按照25fL/cell注射到50个异氟醚处理组细胞中，37度5%C02培养；M-m1-214 (m1-214 类似物)小组将终浓度 10nM 的 M-m1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50个异氟醚处理组细胞中，37度5%C02培养；1-m1-214 (m1-214 抑制剂)小组将终浓度 10nM 的 Ii1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50个异氟醚处理组细胞中，37度5%C02培养；Scramble小组将终浓度10nM的Scramble溶液按照25fL/cell注射到50个异氟醚处理组细胞中，37度5%C02培养；B、对照处理组将eA β 1_42处理老年痴呆症的神经元细胞5%C02，37度培养3h得到对照处理组细胞；再将对照处理组细胞进行如下5个小组处理无RNA处理小组不经过任何处理的对照处理组细胞在37度5%C02培养；miR-214小组将终浓度10nM的miR-214溶液按照25fL/cell注射到50个对照处理组细胞中，37度5%C02培养；M-m1-214 (m1-214 类似物)小组将终浓度 10nM 的 M-m1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50个对照处理组细胞中，37度5%C02培养；1-m1-214 (m1-214 抑制剂)小组将终浓度 IOnM 的1-m1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50个对照处理组细胞中，37度5%C02培养；Scramble小组将终浓度IOnM的Scramble溶液按照25fL/cell注射到50个对照处理组细胞中，37度5%C02培养；2)细胞死亡率检测(I)上述各小组培养24h时间后，取培养在玻片上的细胞，4%多聚甲醛固定25min，PBS浸洗二次，每次5min ；(2)将吸附细胞的载玻片在0.2%的Triton X-100中处理15min，PBS浸洗二次，每次5min ；(3)制备TUNEL反应混合液，处理组用50 μ I TdT+450 μ I荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50 μ I荧光素标记的dUTP液。(4)玻片干后，加50 μ I TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50 μ I荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37°C X lh, PBS漂洗3次。(5)玻片干后加50μ1 converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 V X30min, PBS漂洗3次。在培养了细胞的玻片上加50-100 μ IDAB底物，反应15-250C X lOmin, PBS 漂洗 3 次。(6)封片，将已经处理好的玻片倒扣在滴有甘油PBS混合液的载玻片上，用指甲油封片，放在显微镜下观察，有凋亡情况的细胞被染色。统计各小组死亡细胞数量，计算细胞死亡率结果如图2所示。图2的左边柱形图组为对照处理组(ctrl)，右边柱形图组为异氟醚处理组(isofIurane),具体结果如下对照处理组中的无RNA处理小组、miR-214小组、M-m1-214 (m1-214类似物)小组、1-m1-214 (m1-214抑制剂)小组、Scramble小组中的细胞死亡率分别为51%、22%、36%、89%、51% ;可以看出，与m1-214抑制剂、Scramble和无RNA处理相比，miR-214和m1-214类似物可以降低老年痴呆症的神经元细胞(内源性 Αβ 1-42处理)的死亡率，且miR-214更好的降低细胞死亡率，说明miR-214具有预防和/或治疗老年痴呆症的作用。异氟醚处理组中的无RNA处理小组、miR-214小组、M-m1-214 (m1-214类似物)小组、1-m1-214 (m1-214抑制剂)小组、Scramble小组中的细胞死亡率分别为80%、24%、34%、90%,74% ;可以看出，异氟醚处理组中的无RNA处理细胞死亡率高于对照处理组中的无RNA处理小组，说明异氟醚可以促进老年痴呆症的神经元细胞死亡；而miR-214和m1-214类似物仍然可以降低老年痴呆症的神经元细胞(内源性iAi3 1-42处理)的死亡率，说明即使在异氟醚的伤害处理下，miR-214仍具有预防和/或治疗老年痴呆症的作用。
因此，在大鼠神经元中显微注射miR-214或者mimic miR-214(M_miR-214)抵消了内源性的 Αβ 1-42处理得到老年痴呆症的神经元细胞模型在异氟醚处理引起的细胞死亡。
权利要求
1.miR-214在制备如下I)和/或2)产品中的应用 1)预防和/或治疗老年痴呆症的产品； 2)降低老年痴呆症的神经元细胞死亡数量的产品； 所述miR-214的核苷酸序列为序列表中的序列I。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于 所述老年痴呆症的神经元细胞死亡为由异氟醚诱导引起。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述产品为药物； 所述老年痴呆症的神经元细胞为离体细胞。
4.ー种产品，为miR-214 ; 所述产品为如下I)和/或2) :1)预防和/或治疗老年痴呆症；2)降低老年痴呆症的神经元细胞死亡数量； 所述miR-214的核苷酸序列为序列表中的序列I。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在干 所述老年痴呆症的神经元细胞死亡为由异氟醚诱导引起。
6.根据权利要求4或5所述的产品，其特征在于 所述产品为药物； 所述老年痴呆症的神经元细胞为离体细胞。
7.提高miR-214表达的物质在制备如下I)和/或2)产品中的应用 1)预防和/或治疗老年痴呆症； 2)降低老年痴呆症的神经元细胞死亡数量； 所述miR-214的核苷酸序列为序列表中的序列I。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述提高miR-214表达的物质为miR-214或miR-214类似物。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于 所述老年痴呆症的神经元细胞死亡为由异氟醚诱导引起； 所述产品为药物； 所述老年痴呆症的神经元细胞为离体细胞。
全文摘要
本发明公开了一种miR-214在制备预防或治疗老年痴呆症产品中的应用。本发明提供了miR-214在制备如下1)和/或2)产品中的应用1)预防和/或治疗老年痴呆症；2)降低老年痴呆症的神经元细胞死亡数量；所述miR-214的核苷酸序列为序列表中的序列1。本发明的实验证明，提高miR-214表达的物质可以预防和/或治疗神经退行性疾病如老年痴呆症。而在早期的临床诊断中，miR-214也可以作为诊断神经退行性疾病的生物指标，通过检测病人中miR-214水平的检测，结合其他有效指标，医生可以对病人进行及时的神经退行性疾病早期诊断，进而对神经退行性疾病和认知水平的损失进行有效的控制。
文档编号A61P25/28GK103028122SQ20121058631
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者张研 申请人:北京大学