专利名称：帕金森氏病动物模型平台及其在药物筛选中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及疾病和药物研究领域。具体的，本发明提供了一种研究帕金森氏病的动物模型平台，以及使用所述动物模型平台筛选帕金森氏病药物的方法。
背景技术：
1817 年 James Parkinson 描述了帕金森氏病(Parkinson，s Disease, PD)中两个自相矛盾的症状-震颤和麻痹，肌强直是第三大症状。ro是常见的基底神经节受损疾病， 基底神经节内黑质-纹状体系统中多巴胺能神经元变性、丧失导致多巴胺水平下降、乙酰胆碱能系统功能亢进、丘脑底核和苍白球内侧部过度兴奋及肌张力增高是ro运动功能障碍的主要病理生理学基础。另外，大量临床及动物实验研究发现，基底神经节中出现的异常β波还与ro的肌张力密切相关。酪氨酸轻化酶(Tyrosi ne hydroxylase, TH)是儿茶酹胺类活性物质生物合成的限速酶，在多巴胺(Dopamine，DA)生物合成的调节中发挥重要作用。酪氨酸羟化酶在生物体内，尤其是在黑质纹状体系统中质(活性)和量(表达)的变化会直接影响到L-多巴胺的生物合成。酪氨酸羟化酶(TH)的变化与H)的发生发展密切相关。帕金森氏病的运动障碍正在通过各种动物模型得到复制并深入机制研究。在ro的行为学研究中，其动物模型包括化学性损害模型，机械损伤模型和基因遗传模型。化学性损害模型包括用6-羟基多巴胺、1-甲基-4-苯基-1，2，4，6-四氢吡啶(MPTP)、百草枯、鱼藤酮对动物例如灵长类或啮齿类动物进行处理。6-羟基多巴胺(6-0HDA)介导建立的动物模型是最常见的帕金森氏病模型之一。MPTP介导建立的动物模型是另一种常见的帕金森氏病模型，能很好地模拟帕金森病的临床症状和病理学特点。尸体解剖检查MPTP动物模型，发现损伤的主要是多巴胺系统。不同的帕金森氏病致病模型模拟的帕金森氏病的病理、发病机制、临床症状和病理学特点不同。不同的动物在同一个帕金森氏病致病模型也有一定区别。例如，不同动物对MPTP敏感性有差异，表现在处理后的黑质多巴胺能神经元数目的减少的程度，以及是否有蓝斑区肾上腺紊能神经元数目的减少和更典型的帕金森病行为学方面的改变等。因此通常需要针对特定的医学或药物开发研究目的开发特定的帕金森氏病致病模型，以及选择特定的动物类型，以及观察这种特定动物模型的特定参数，才能尽量准确地获得待测医疗手段或药物是否对帕金森氏病有效的判断。步态失调和姿势障碍是帕金森氏病患者的重要功能障碍，主要表现为身体前倾，肘、腰、膝屈曲；行走时步幅小呈小碎步步态，步行速度慢，步行节奏中度降低；行走过程中步幅越来越小，同时步行速度加快，呈现出几乎要奔跑的步态称为慌张步态；在启步和在狭窄的地方行走时因害怕而不敢迈步称为冻结步态。根据Hoehn-Yahr等级划分，帕金森氏病患者步态变化过程分为三个阶段①.早期的症状是运动迟缓和下肢活动幅度降低，产生小碎步的典型步态。②.随着病情的进一步发展，患者出现显著的步态冻结。③.最后，患者出现姿势反射丧失、平衡障碍甚至跌倒等现象。目前，临床上常用的步态分析评定指标有步长、步速及耐力。对帕金森氏病动物模型的行为观察成为验证帕金森氏病动物模型和药物的重要手段。应用于检测化学诱导，例如MPTP诱导的ro小鼠模型中行为学检测方法主要有旷场实验、滚轴实验、游泳实验、造窝实验、爬杆实验、悬挂实验和握杆平衡实验等。上述行为学检测方法适用于检测动物运动迟缓、运动障碍及四肢协调功能等方面障碍，且由于各种原因，检测结果并不一致。影响以上实验结果的因素包括①.实验因素包括测试时间、训练强度、实验室环境和实验操作人员操作手法等。②.发生在动物身上的某些运动功能障碍强度较弱，而上述各种实验测试指标的敏感性较小，不足以测出动物的功能性障碍。③.在进行某些行为测试时，动物的状态是非自愿的，动物的意识状态可能影响到测试结果。④.上述各个行为学测试方法所检测的指标反映了动物仅在运动时或者静止时的运动功能，还不能真实的反映模型动物的行为学状态。因此，还需要一种能够更加准确反映帕金森氏病动物模型，特别是MPTP诱导的ro小鼠模型的行为状态判断方法以及使用这种方法评估药物或疗法对帕金森氏病的效果。
发明内容
本发明提供了一种用于研究帕金森氏病的小鼠模型平台，所述模型平台利用1-甲基-4-苯基-1，2，4，6-四氢吡啶(MPTP)诱发小鼠出现帕金森氏症状，并采用定量分析小鼠通过步行台的步态及姿势指标来作为检测帕金森氏症状行为学检测的特征参数。本发明还提供的利用所述平台用作在待测物中研究或筛选帕金森氏病相关药物的方法。本发明还提供了利用所述平台在待测物中筛选帕金森氏病相关药物的方法，包括以下步骤(I)对小鼠进行训练，包括将小鼠放入具有步行台，让其从步行台一侧跑至另一侦牝训练至小鼠能连续地通过步行台；(2)将1-甲基-4-苯基_1，2，4，6-四氢吡啶(MPTP)施用于步骤(I)得到的小鼠；(3)将待测物给予步骤(2)得到的小鼠；(4)观察和定量分析步骤(3)得到的小鼠通过步行台的步态指标和姿势指标；(5)根据(4)的分析结果对待测物是否可作为帕金森氏病相关药物进行初步判断。在本发明的一个方面，采用的小鼠为C57/BL6小鼠，特别是鼠龄为8_10周的小鼠。在本发明的一个方面，使用的步行台是水平设置的平台，其具有侧壁，以及可包括顶盖，以形成左右两侧封闭和/或上下封闭的通道。通道具有两侧的入口和出口，供小鼠从所述步行台一侧跑到另一侧。在本发明的一个方面，步骤(4)采用了动物步态分析系统平台，例如可商购的步行台(Catwalk)动物步态分析系统平台来观察和定量分析小鼠通过步行台的前述特征指标。所述动物步态分析系统平台包括玻璃地板和上下左右封闭，两端具有入口和出口的通道的步行台、玻璃光源、摄像头、图像采集卡和分析装置，小鼠沿通道走过步行台时，爪子接触被玻璃光源照亮的玻璃地板，留下的爪印被步行台下方的摄像头拍摄到后送入图像采集卡，通过分析装置分析这些爪印和相关时间可以得到步序，步态，时长，每个爪子的步长，每对前爪和后爪之间的距离，爪印的长度宽度，爪子的压力等参数，并由此统计或计算出所述步态指标和姿势指标。通过对所述参数和的统计或计算，可以对所述步态指标和姿势指标进行定量分析。动物步态分析系统平台中的通道通常由与玻璃地板两端垂直连接的侧壁和顶盖组成。封闭通道具有供小鼠通过的入口和出口。动物步态分析系统平台中的分析装置通常为带有统计或计算软件程序的计算机系统。在本发明中，观察和定量分析小鼠通过步行台的步态指标和姿势指标。帕金森氏病动物模型的行为学指标包括体现平衡协调的指标、疼痛的指标、步态指标和姿势指标等。通过前述动物步态分析系统平台可以观察和分析脚掌尺度指标(可作为疼痛的指标)、步态指标和姿势指标等指标。在本发明中出乎意料地发现，步态指标和姿势指标能够准确定性和定量地反映帕金森氏病模型动物的行为学状态，通过和TH蛋白的表达的比较，发现这些步态指标和姿势指标与帕金森氏病的相关度稳定和敏感，比其它常用的制备的相关度闻。在本发明中，步态指标是指小鼠在通过步行台时下肢特征的各种指标。在本发明中，姿势指标是指小鼠在通过步行台时身体姿架特征的各种指标。在本发明的一个方面，步态指标包括小鼠通过所述步行台的行走时间，速度变异 率，步频，摇摆速度，步幅，接触率和步伐周期等。在本发明的一个方面，姿势指标包括小鼠通过所述步行台的接触时间、初次双足接触时间、末次双足接触时间、两后足爪间距、对角双足支撑模式、三足支撑模式和四足支撑模式等。 其中，有关指标和参数的定义如下。行走时间(Run duration):单向单次通过玻璃地板所需要的时间。速度变异率(Walking speed variation):行走过程中即时速度的变异率。步频(Cadence):每秒钟的步伐数。摇摆周期每个步伐周期中，动物足悬空的时间。摇摆速度(Swing speed)=步幅/摇摆周期。步幅(Stride length):行走过程中同一只足的足跟/足尖连续两次接触地面间的距离。步伐周期(Step cycle):行走过程中，同一只足接触玻璃地板时，间隔的周期。接触时间(Stance):每个步伐周期中，单只足接触地面的时间。接触率(Duty cycle):每一步伐周期中，支撑时间占整个周期的百分率。支撑周期足接触地面的时间。初次双足接触时间(Initial dual stance):每一步伐周期中，初次出现双足接触地面的支撑周期。末次双足接触时间(Terminal dual stance):每一步伐周期中，末次出现双足接触地面的支撑周期。两后足爪间距(Base of support):两后足同时支撑玻璃地板面时,两者之间的距离。对角双足支撑模式(Support-diagonal):对角双足同时支撑地板周期占总支撑周期的百分率。三足支撑模式(Three-point support):三足同时支撑地板周期占总支撑周期的
百分率。四足支撑模式(Four-point support):四足同时支撑地板周期占总支撑周期的百分率。
在本发明的其中一个方面，所述步骤(4)中观察和定量分析的步态指标和姿势指标为四足的步幅、接触率、速度变异率、双足对角支撑模式、三足支撑模式、四足支撑模式、双前足的摇摆速度、步伐周期、末次双足接触时间、双后足支撑时间、爪间距和初次双足接触时间中的一种或多种的组合。优选的，观察和定量分析的步态指标和姿势指标为四足的步幅、对角双足支撑模式、三足支撑模式、速度变异率、两后足爪间距、双后足的支撑率、双前足的初次双足接触时间中的一种或多种的组合。最优选的，所述步骤(4)中观察和定量分析的步态指标和姿势指标为四足的步幅、对角双足支撑模式、三足支撑模式、速度变异率、两后足爪间距、双后足的支撑率和双如足的初次双足接触时间。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6_四氢吡啶(MPTP)可以通过管饲法和注射方式等给予小鼠。在本发明的其中一个方面，其中步骤(2)通过腹腔注射给予小鼠MPTP。在本发明的又一个方面，MPTP注射剂量为约25-40mg/Kg，优选为约40mg/Kg，连续注射5天。在本发明的其中一个方面，其中步骤(I)为将小鼠放入步行台，让其自由从通道一 侧自由跑至另一侧，每天跑一次，6趟/次，训练7天，以小鼠可以连续无停顿地通过通道为符合测试要求。通常，对小鼠进行测试前七天进行训练，可以将小鼠放入所述步行台或替代通道内，让其自由从通道一侧自由跑至另一侧，每天跑一次，6趟/次，随着训练次数的增力口，小鼠在通道内探索的次数越来越少。至第7天，大部分小鼠可以连续无停顿地通过通道。训练结束后，小鼠仍不能连续地通过通道，将被剔除实验之外。在本发明的一个方面，利用所述平台在待测物中筛选帕金森氏病相关药物的方法中设立药物处理组、正常对照组和帕金森氏病(PD)模型组，其中药物处理组的小鼠进行前述所述步骤(I)到(5)的处理。药物处理组在步骤(3)可给予不同的待测物，还可以给予不同浓度的待测物。ro模型组和正常对照组的小鼠的其它处理条件和步骤与药物处理组的小鼠相同，只是帕金森氏病模型组的小鼠在步骤(3)不给予待测物，以及正常对照组的小鼠在所述步骤(2)和(3)不给予MPTP和待测物。帕金森氏病模型组的小鼠和正常对照组的小鼠也可以在步骤(2 )和(3 )分别给予与MPTP和待测物相同的溶剂或生理盐水。通过检测药物处理组与帕金森氏病模型组的小鼠的所述通过步行台的步态指标和姿势指标是否有明显统计学差异，来对待测物是否可作为帕金森氏病相关药物进行初步判断。若经过待测物处理后，药物处理组与ro组对比，步态和姿势的指标不同，且经过标准的统计学检测后，有明显统计学意义，则初步认为此待测物对ro有影响，可对其做进一步的研究。例如，可对该待测物进行是否帕金森氏病相关蛋白的拮抗剂、激动剂或反向激动剂等的研究，或对其进行修饰，用于研究帕金森氏病的机理或治疗药物或方法研究等。例如，若经过待测物处理后，药物处理组与ro组对比，步态和姿势的失调现象得到明显改善，且经过标准的统计学检测后，有明显统计学意义，则可初步判断此待测物对ro模型鼠有治疗作用。
图1为本发明的实施例的旷场实验结果图。图2a为本发明的实施例的步行台实验步态和姿势分析结果图。图2b为本发明的实施例的步行台实验步态和姿势分析结果图。图3为本发明的实施例的步行台实验行为分析和蛋白表达图。
具体实施例方式为了更好地理解和阐释本发明，下面将参照附图对本发明作进一步的详细描述。实施例1实验材料1.实验动物健康雄性C57/BL6小鼠，8 10周，体重25 28克，由香港中文大学实验动物中心提供。小鼠每5 10只分笼饲养，自由进食和饮水，室温保持22±1°C，光暗周期为12/12小时。 2.实验方法( I)动物分组及H)动物模型的建立将随机选取40只雄性C57/BL6小鼠，随机分为生理盐水对照组和MPTP注射组，每组20只。注射前一小时，将动物从饲养室移至实验室内，让其熟悉室内环境。MPTP的注射剂量为40mg/Kg，液体注射量为10ml/Kg，连续注射5天，生理盐水对照组注射等体积的生理盐水。(2)行为学研究旷场实验(Open field test):在最后一次注射后第4、7、12、16、21天对两组小鼠进行Open field test。实验前2小时，将小鼠从动物饲养室移至行为学检测实验室，让其适应实验室条件，并于实验开始前I小时轻轻抓放动物，使其熟悉操作者的手法。实验开始时，将动物放于一 50X50X25厘米的旷场内，所有动物进入旷场时，头均面对同一位置，启动轨迹跟踪系统，检测小鼠的运动轨迹、运动距离、休息时间及运动时间等指标。步行台实验(Catwalk test):制作模型前7天,对C57/BL6小鼠进行测试前训练。将小鼠放入一替代通道内，让其自由从通道一侧自由跑至另一侧，每天跑一次，6趟/次，随着训练次数的增加，小鼠在通道内探索的次数越来越少，至第7天，大部分小鼠可以连续无停顿地通过通道。训练结束后，小鼠仍不能连续地通过通道，将被剔除实验之外。在第I次注射后第3天及最后一次注射后第4、7、12、16、21天对两组小鼠进行步行台实验。本实验中采用CatWalk XT9. O系统(美国Noldus公司，CatWalk XT9. O,软件名称CatWalk XT)来对小鼠进行步行台实验。具体研究参数和定义由该系统提供如下行走时间(Run duration):单向单次通过玻璃地板所需要的时间。速度变异率(Walking speed variation):行走过程中即时速度的变异率。步频(Cadence):每秒钟的步伐数。摇摆周期每个步伐周期中，动物足悬空的时间。摇摆速度(Swing speed)=步幅/摇摆周期。步幅(Stride length):行走过程中同一只足的足跟/足尖连续两次接触地面间的距离。步伐周期(Step cycle):行走过程中，同一只足接触玻璃地板时，间隔的周期。接触时间(Stance):每个步伐周期中，单只足接触地面的时间。接触率(Duty cycle):每一步伐周期中，支撑时间占整个周期的百分率。支撑周期足接触地面的时间。初次双足接触时间(Initial dual stance):每一步伐周期中，初次出现双足接触地面的支撑周期。末次双足接触时间(Terminal dual stance):每一步伐周期中，末次出现双足接触地面的支撑周期。两后足爪间距(Base of support):两后足同时支撑玻璃地板面时,两者之间的距离。对角双足支撑模式(Support-diagonal):对角双足同时支撑地板周期占总支撑周期的百分率。三足支撑模式(Three-point support):三足同时支撑地板周期占总支撑周期的
百分率。四足支撑模式(Four-point support):四足同时支撑地板周期占总支撑周期的百分率。(3)小鼠灌注及黑质、纹状体取材病理组织取材在注射后第21天，将实验动物用麻醉剂(氯胺酮100mg/Kg，眠乃宁(Xy I ax ine ) 10mg/Kg,1. p.)深度麻醉,经心脏依次灌注生理盐水20ml和多聚甲醒30ml。灌注完毕后将小鼠断头取脑，置于4%多聚甲醛中4°C条件下后固定24小时。依次浸入15%、20%和30%蔗糖溶液中4°C过夜后，入包埋剂0. C. T.中冰冻包埋。将小鼠脑切至25uM厚切片，隔5片取一片，入0. 01MPBS中4°C保存。蛋白标本取材在注射后第4、7、12、16、21天，小鼠深度麻醉后，以20ml生理盐水灌注后，取出整脑于冰上迅速取黑质区和纹状体区，入-80°C保存。(4)ffestern blotting检测各时间点黑质及纹状体区TH蛋白表达的规律WesternBlotting实验的主要溶液配制I) 5X电泳缓冲液Tris base 15.1g甘氨酸72g10%SDS50ml加水至总体积1000ml。用时稀释5倍即为I X电泳缓冲液(无需调pH)。2) TBST (pH7. 6)
权利要求
1.一种用于在待测物中筛选帕金森氏病相关药物的方法，包括以下步骤 (1)对小鼠进行训练，包括将小鼠放入步行台，让其从步行台一侧跑至另一侧，训练至小鼠能连续地通过步行台，所述小鼠优选为C57/BL6小鼠， (2)将1-甲基-4-苯基-1,2，4，6-四氢吡啶(MPTP)施用于步骤(I)得到的小鼠； (3)将待测物给予步骤(2)得到的小鼠； (4)观察和定量分析步骤(3)得到的小鼠通过步行台的步态指标和姿势指标； (5)根据(4)的分析结果对待测物是否可作为帕金森氏病相关药物进行初步判断。
2.权利要求1的方法，其中所述步态指标包括行走时间，速度变异率，步频，摇摆速度，步幅，接触率和步伐周期。
3.权利要求1的方法，其中所述姿势指标包括接触时间、初次双足接触时间、末次双足接触时间、两后足爪间距、对角双足支撑模式、三足支撑模式和四足支撑模式。
4.权利要求1的方法，其中步骤(4)中观察和定量分析的步态指标和姿势指标为四足的步幅、接触率、速度变异率、双足对角支撑模式、三足支撑模式、四足支撑模式、双前足的摇摆速度、步伐周期、末次双足接触时间、双后足支撑时间、爪间距和初次双足接触时间中的一种或多种的组合。
5.权利要求4的方法，其中步骤(4)中观察和定量分析的步态指标和姿势指标为四足的步幅、对角双足支撑模式、三足支撑模式、速度变异率、两后足爪间距、双后足的支撑率、双前足的初次接触时间中的一种或多种的组合，优选的，所述步骤(4)中观察和定量分析的步态指标和姿势指标为四足的步幅、对角双足支撑模式、三足支撑模式、速度变异率、两后足爪间距、双后足的支撑率和双前足的初次接触时间。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中步骤(4)通过动物步态分析系统平台来观察和分析小鼠通过步行台的所述特征指标，所述平台包括具有通道和玻璃地板的步行台、玻璃光源、摄像头、图像采集卡和分析装置，小鼠沿通道走过步行台时，爪子接触被玻璃光源照亮的玻璃地板，留下的爪印被步行台下方的摄像头拍摄到后送入图像采集卡，通过分析装置分析这些爪印可以得到步序，步态，时长，每个爪子的步长，每对前爪和后爪之间的距离，爪印的长度宽度，爪子的压力参数，并由此统计或计算出所述步态指标和姿势指标。
7.权利要求1-6中任一项的的方法，其中步骤(2)为腹腔注射MPTP。
8.权利要求7的方法，其中步骤(2)为MPTP注射剂量为约40mg/Kg，连续注射5天。
9.权利要求1-8中任一项的的方法，其中步骤(I)为将小鼠放入步行台，让其自由从通道一侧自由跑至另一侧，每天跑一次，6趟/次，训练7天，以小鼠可以连续无停顿地通过通道为符合测试要求。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述小鼠设为药物处理组，另外还设立正常对照组和帕金森氏病模型组，帕金森氏病模型组和正常对照组的小鼠的其它处理条件和步骤与药物处理组的小鼠相同，但帕金森氏病模型组的小鼠不给予待测物，正常对照组的小鼠不给予MPTP和待测物，通过检测药物处理组与帕金森氏病模型组的小鼠的所述通过步行台的步态指标和姿势指标是否有明显统计学差异，来对待测物是否可作为帕金森氏病相关药物进行初步判断。
全文摘要
本发明公开了一种研究帕金森氏病的动物模型平台，以及使用所述动物模型平台筛选帕金森氏病药物的方法。本发明提供了用于在待测物中筛选帕金森氏病相关药物的方法，包括以下步骤(1)对小鼠进行训练，包括将小鼠放入步行台，让其从步行台一侧跑至另一侧；(2)将MPTP施用于步骤(1)得到的小鼠；(3)将待测物给予步骤(2)得到的小鼠；(4)观察和定量分析步骤(3)得到的小鼠通过步行台的步态指标和姿势指标；(5)对待测物是否可作为帕金森氏病相关药物进行判断。本发明的方法检测的指标稳定可靠，与帕金森氏病相关性明显大于现有技术。
文档编号A61K49/00GK103007299SQ201210585560
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者王小洪, 路钢, 姜舒, 刘强, 潘伟生 申请人:胡祥