纹状体或黑质密部中的神经缺陷的治疗的制作方法

专利名称：纹状体或黑质密部中的神经缺陷的治疗的制作方法
专利说明纹状体或黑质密部中的神经缺陷的治疗 发明领域 本发明涉及通过给予人重组GDF5治疗由人纹状体或黑质密部(substanta nigra pars compacta)的损伤或疾病所引起的神经缺陷的方法，并涉及用于这类治疗方法的包含人重组GDF5的组合物和基质。

背景技术：
目前尚无修复由神经病引起的损伤的满意方法，这些损伤可能导致帕金森氏病(帕金森氏综合征)或中风。帕金森氏病是由诸如震颤、僵直、迟钝-和运动功能减退的神经缺陷，以及在平衡和姿势中其它缺陷组成的综合征。帕金森氏病通常与神经系统的老化有关。类似地，中风可影响运动系统，使得患者具有轻偏瘫或麻痹的症状。
黑质是帕金森氏病的主要位置。黑质的色素神经元很大程度上且广泛地表达到尾状壳核(caudate-putamen)(纹状体)上，并且特异性合成和释放多巴胺。当75-80％多巴胺能神经分布被破坏时，帕金森氏综合征的症状出现。帕金森氏病患者对多巴胺置换性疗法(dopaminereplacement therapy)应答。不幸的是，多巴胺置换性疗法的功效随黑质纹状体的多巴胺途径的衰退而持续降低。
干细胞的鉴定刺激了针对更新药物的特定细胞类型的选择性产生(regenerative medicine)的研究。虽然已研制出将干细胞直接分化为治疗相关的细胞类型的方案，例如治疗帕金森氏病的多巴胺能(DA)神经元、治疗ALS的运动神经元以及治疗MS的少突神经胶质细胞，但是这些源于干细胞的细胞类型的实际数量的有效增殖尚未报道。产生无限数量的表达完整中脑DA神经元标记物的DA神经元的能力是为帕金森氏病提供治愈的重要部分。因此，可用于刺激干细胞分化为DA谱系的药物为影响大脑中动脉(MCA)及其分支的帕金森氏病以及中风提供了一种利用和区分外源性和内源性干细胞的可能性。
在其它情况下，抵抗大脑和/或脊髓的急性或神经变性性损伤的作用的尝试都主要涉及植入胎神经元，以补偿损失或不足的神经功能。但是，人胎儿细胞移植研究受到严格限制。也已建议给予诸如神经生长因子和胰岛素样生长因子的神经营养因子以刺激中枢神经系统(CNS)内神经的生长。参见，例如Lundborg，Acta Orthop.Scand.58145-169(1987)；美国专利No.5,093,317。给予CNS神经营养因子需要绕过血-脑屏障。该屏障可通过直接输注，或者通过修饰分子增加其进入该屏障的输送、通过化学修饰或轭合或者通过分子截断来克服。TGF-β超家族的许多生长因子[Kingsley，Genes & Development8 133-146(1994)以及其中摘引的文献]都与很多尤其涉及伤口愈合和组织再生的内科疗法和应用有关。某些这类多功能蛋白除具有诸如在多种细胞类型中调节增殖和分化作用外，还对神经元具有促进生存作用[Roberts and Sporn，Handbook of Experimental Pharmacology 95419-472，eds.Spom and Roberts(1990)；Sakurai等，J.Biol.Chem.，26914118-14122(1994)]。因此，例如证实TGF-β体外对胚胎运动和感觉神经元的营养作用[Martinou等，Devl.Brain Res.，52 175-181(1990)；Chalazonitis等，Dev.Biol.，152121-132(1992)]。另外，蛋白TGF-β-1、-2、-3、激活素A和GDNF(神经胶质细胞系-衍生的神经营养因子)对中脑的多巴胺能神经元呈现促进生存的作用，但是这些作用并不通过星细胞介导，GDNF为一种与TGF-β超家族成员具有结构类似性的蛋白[Krieglstein等，EMBO J.，14，736-742(1995)]。各种组织和发育阶段中TGF-β超家族的蛋白的出现与其准确功能以及靶位、生存期、辅助因子的需要量、必需的细胞生理环境和/或对衰退的抗性上的差别相符合。
GDF5表达于新生大鼠的中脑中，表明其在多巴胺能神经元发育中可能发挥作用[Krieglstein等，J.Neurosci.Res.，42 724-32(1995)]。体外研究表明MP52对大鼠胚胎的多巴胺能神经元具有促生存作用，保护它们对抗毒素1-甲基-4-吡啶鎓(MPP+)。另外，体内研究表明薄壁组织内注射GDF5能预防成熟大鼠黑质纹状体多巴胺能系统由前脑内侧束的6-羟基多巴胺(6OHDA)损伤诱导的死亡[Sullivan等，Eur.J.Neurosci.，233 73-6(1997)]。然而，虽然这些研究表明GDF5在多巴胺能边缘系统的发育和保护中发挥重要作用，但是针对神经再生性能力或区分内源性或外源性细胞群能力，它们未呈现或显示出任何与GDF5的相关性。
因此，目前需要一种治疗由人纹状体或黑质密部的损伤或疾病所引起的神经缺陷的方法。本发明寻求以能治疗或预防这样产生的缺陷的方式来利用人重组GDF5。
发明概述 本发明涉及治疗由人纹状体或黑质密部的损伤或疾病所引起的神经缺陷的方法，该方法包括给予人纹状体或黑质密部有效诱导细胞群的量的人重组GDF5，所述细胞群具有向多巴胺能表型分化的能力，以便实际上使所述细胞向多巴胺能表型分化，本发明还涉及包含适用于治疗此类缺陷的人重组GDF5的组合物和基质。
发明详述 已证实神经发生存在于成人海马、室下区(subventricular)、黑质和嗅球中。因此，在治疗由可为帕金森氏病病因的人纹状体或黑质密部的损伤或疾病所引起的神经缺陷中，可将这些细胞补充和/或分化成DA特异性神经元的药物对提供细胞替代是必要的。在本发明的治疗方法和组合物中，将人重组GDF5用作一种预分化剂或分化剂以分化无论是内源性或外源性的干细胞群或祖细胞群。本发明基于，至少部分基于这种发现，即人重组GDF5是一种神经营养因子，其能选择性诱导成人神经海马祖细胞向多巴胺能表型分化。本文所述的资料表明人重组GDF5是神经干细胞分化的有效诱导物。因此，这些结果表明人重组GDF5除能提供除其本身的神经保护功能外，还提供神经再生功能的协同作用。
GDF5是一种功能为生长和分化因子的蛋白质。哺乳动物中可发现天然状态的该蛋白质。按本发明进一步地描述及本领域技术人员清楚的方法，可将天然存在的人GDF5改良、纯化或另外处理形成人重组GDF5。本文将“Human recombinant GDF5”称为GDF5-HR。已知的GDF5-HR蛋白包括BMP-14、CDMP-1和MP52。
MP52由Biopharm GmbH提供，Biopharm GmbH是一家营业场所在德国海德堡的德国公司，1994年首次分离MP52的cDNA，其归属于TGF-β基因超家族的骨生成因子。MP52是一种具有120个氨基酸残基的蛋白质，其N-末端为丙氨酸，其氨基酸序列公开于WO93/16099和WO95/04819。多种动物实验表明MP52与成骨作用有关，类似于其它的骨生成因子。
由于已发现MP52是神经干细胞分化的有效诱导物，所以已确定其可用于治疗人纹状体或黑质密部中的神经缺陷，所述缺陷归因于神经变性疾病，尤其是帕金森氏病，或者由影响中脑动脉(MCA)及其分支的中风引起的损伤。虽然我们已发现MP52单独即可刺激海马中分离的成人神经原向多巴胺能表型分化，但是可将其与激动剂联合以诱导神经干细胞或其它具有向多巴胺能表型分化的能力的细胞中的多巴胺能分化提高。例如，可将MP52与Sonic Hedgehog(SHH)或成纤维细胞生长因子8(FGF8)联合使用，以便为诱导神经干细胞和本文所述的其它细胞成为表型为多巴胺能的细胞提供明显增强的方法。SHH是Wnt信号途径中的一个完整部分；该发育途径中的其它因子与GDF5-HR联合应用中对神经的形成可能是重要的。
GDF5-HR可用于分化除成熟神经祖细胞外的干细胞形式，如海马祖细胞或海马干细胞，或者其它具有向多巴胺能表型分化的能力的细胞。这些其它形式的细胞包括，但不限于间充质干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞(ESCs)、源于胚胎干细胞的祖细胞、产后衍生的干细胞或祖细胞、源于脐带或胎盘组织的细胞、源于肌肉的干细胞或祖细胞、源于胰的干细胞或祖细胞、源于缘的干细胞或祖细胞、源于视网膜的干细胞或祖细胞以及源于肝的干细胞或祖细胞。
GDF5-HR可单独用作神经营养因子，以在治疗人纹状体或黑质密部内的神经缺陷中诱导细胞群分化。此处所用术语神经营养性被定义为包括恢复、再生和分化细胞的潜在性。还可将所述蛋白质与神经营养组合物混合或者与用作传递或支持系统的适合基质联合使用。所述神经营养组合物包括有效量的GDF5-HR。有效量指诱导细胞群的有效量，所述细胞群具有向多巴胺能表型分化的能力，以便实际上使所述细胞向多巴胺能表型分化。本发明的神经营养组合物可包含约0.5-约1,000纳克的MP52，或约0.5-约200纳克的MP52。
神经营养组合物可通过将GDF5-HR固定、混合、溶解或混悬于药学上可接受的载体或水性溶剂中而获得。例如，载体或水性溶剂的适合的实例包括，但不限于临床级别的无菌水、无菌盐水、无菌磷酸缓冲盐水、葡萄糖的盐水溶液、无菌液体介质或其它生理学上可接受的等渗液体。另外，本发明的神经营养组合物可包含多种药学上可接受的、可与载体或水性溶剂混合的添加剂，如稳定剂、防腐剂、增厚剂、助溶剂等。
还可将GDF5-HR与适合的用作传递或支持系统的基质结合使用。GDF5-HR的成功基质期望能执行几种重要的功能。期望其与GDF5-HR结合，并能用作缓慢或持续释放的传递系统，并调节分化过程中细胞响应的各个步骤。基质阻止GDF5-HR从传递部位分散出去，因此将GDF5-HR的作用集中在所传递的细胞上。另外，所选择的基质材料应该是体内可生物降解的、多孔的并且优选是可生物降解的。此处所用的术语生物可降解的被定义为包括能在体内生理条件下降解或损坏掉(化学或物理性)，从而所降解的产物可被体内排泄或吸收的物质。生物降解率可根据植入纹状体或黑质密部内后所要求的释放速率而变化。基质还可按要求用作暂时性支架(scaffold)，直至被新生长的神经组织代替。因此，在一实施方案中，基质为需要此种因子的患者提供持续释放的神经营养因子成分，并可在患者中提供供组织生长发育的结构。基质可以是微粒形式(直径超过10微米的大粒或直径小于10的微粒)，或者可以是结构稳定、三维植入片形式(例如，支架)。移植片可以是立方体(cube)、圆筒、软管(tube)、嵌入块(block)、薄膜、薄片或适合的构造形式。
影响体内生物降解聚合物的机械性能的因素对于聚合物科学家来讲是熟知的，包括单体的选择、启发过程条件和添加剂的存在。生物降解已能通过合成聚合物实现，该聚合物在骨架中具有不稳定的键，或者具有在体内能被安全地氧化或水解的键。具有该特性的最常用化学官能团是醚、酯、酐、原酸酯和酰胺。因此，在本发明的一实施方案中，GDF5-HR被控制性地从可生物降解的聚合物基质中释放至在可生物降解聚合物中需要通过水解化学键的部位上。可生物降解性聚合物基质优选为粉末、微粒、微球、条状物、凝胶(如原位可聚合的凝胶)、网状物或海绵的形式。
生物相容性基质可以包括天然的、改良的天然或合成的可生物降解聚合物，包括同聚物、共聚物和嵌段聚合物，以及它们的组合物。值得注意的是一般根据合成的单体来命名聚合物。
适合的可生物降解的聚合物或聚合物类别的实例包括纤维素、胶原、弹性蛋白、明胶、玻连蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、再生基膜基质、淀粉、葡聚糖、藻酸盐、透明质酸酶(hyaluron)、壳多糖、壳聚糖、琼脂糖、多糖、透明质酸、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚乙二醇、去细胞组织(decellularized tissue)、自主装配肽(self-assemblingpeptides)、多肽、糖胺聚糖、它们的衍生物及其混合物。对于羟乙酸和乳酸，一般在聚合前，将中间体环状二聚体制备和纯化。分别将这些中间二聚体称为乙交酯和交酯。其它有用的可生物降解聚合物或聚合物类别包括，但不限于聚二氧六环酮、聚碳酸酯、聚草酸酯、聚(α-酯)、聚酐、聚乙酸酯、聚己内酯(polycaprolactones)、聚(原酸酯)、聚氨基酸、聚酰胺及其混合物和共聚物。其它有用的可生物降解的聚合物包括，但不限于L-和D-乳酸的立体聚合物、双(对-羧基苯氧基)丙酸和癸二酸的共聚物、癸二酸共聚物、己内酯的共聚物、聚(乳酸)/聚(羟乙酸)/聚乙二醇共聚物、聚氨酯和聚(乳酸)的共聚物、聚氨基甲酸酯和聚(乳酸)的共聚物、α-氨基酸的共聚物、α-氨基酸和己酸的共聚物、α-苄基谷氨酸酯和聚乙二醇的共聚物、琥珀酸酯和聚(乙二醇)的共聚物、聚磷腈、聚羟基链烷酸酯及其混合物。二元和三元系统也包括在内。
一般来讲，将用作基质的适合的可生物降解性聚合物按要求构型，以使其具有适合预期用途的机械性质、保持充分的完整性直至组织已向内生长(in-grown)和愈合、不引起炎症或毒性反应、在实现其目的后在体内代谢，易于加工成所需要形成的终产品、证明有可接受的储存期以及容易灭菌。
在本发明的一方面，用于形成基质的生物相容性聚合物为水凝胶形式。通常，水凝胶是交联聚合物质，其可在水中吸收超出其重量20％的水，而同时保持特定的三维结构。这种定义包括在水性环境中膨胀的干燥交联聚合物以及水膨胀性材料。很多亲水聚合物可交联产生水凝胶，而无论该聚合物是否是生物来源的、半合成的或全合成的。水凝胶可由合成聚合材料生产。可将这些合成聚合物特制为具有一定范围特性和可预测批批(lot-to-lot)均匀的聚合物，且代表一类通常不含免疫原性问题的可靠来源的物质。基质可以包括由自主装配肽形成的水凝胶，如在美国专利Nos.5,670,483和5,955,343、美国专利申请No.2002/0160471、PCT申请No.WO02/062969中描述的那些。
使水凝胶能在药物传递应用中有价值的性质包括平衡膨胀度、吸收动力学、溶质渗透性以及其体内的功能特性。对化合物包括GDF5-HR的渗透性部分取决于膨胀度或含水量以及生物降解速率。由于凝胶的机械强度根据膨胀度的直接比例衰减，本发明范围内还包括可将水凝胶连接于底物上，以使该复合系统能增强机械强度。在其它备选实施方案中，可将水凝胶浸渍在多孔底物中，使得水凝胶具有对GDF5-HR的有用的传递性质的同时，获得底物的机械强度。在一实施方案中，向黑质密部或纹状体内直接薄壁组织内注射GDF5-HR或包含GDF5-HR的神经营养组合物或包含GDF5-HR的基质，可有效促进祖细胞或干细胞的残留群(pool)的分化，使得将神经祖细胞或干细胞的定位活动范围分化为多巴胺能族系(lineage)。
另外，可将GDF5-HR神经营养(neutrophic)组合物和/或包含GDF5-HR的基质通过直接移植、通过微导管、内导管插入术(intracatheterization)或者通过微型泵传递至所述部位上。还可将GDF5-HR组合物和/或基质通过鞘内传递或脑室内或通过鼻内给予而间接地传递至黑质密部或纹状体内。所述溶媒赋形剂或载体可以是已知的药学上可接受的能给予患者的任何物质，尤其是能诱导细胞在局限的位点上分化。实例包括液体介质，如Dulbeccos改良Eagles培养基(DMEM)、无菌盐水、无菌磷酸缓冲盐水、Leibovitz氏培养基(L15，Invitrogen，Carlsbad，CA)、葡萄糖的无菌水溶液和任何其它生理学上可接受的液体。一种传递至黑质密部的优选的方法是根据已知的技术，如F.Balis & D.Poplack，Am.J.Pediatric.Hematol.Oncol.11(l)74-86(1989)中所讲授的技术，用奥马耶贮器鞘内或脑室内给予。一种传递至黑质密部的更为优选的方法是通过微导管直接薄壁组织内注射。
在备选实施方案中，GDF5-HR可用于移植前预处理成熟干细胞或祖细胞，或者在移植前与其它细胞混合加入以在体内诱导脑内细胞群中这些转录物的上行调节，或者另外强制脑中神经干细胞或祖细胞的分化。因此，可利用这些条件在植入纹状体或黑质前预处理细胞群，包括神经干细胞或祖细胞，或者其它的干细胞或祖细胞或者本文所述的其它细胞。例如，可将海马神经干细胞在适当的基质/带有GDF5-HR的支架上分化，然后直接将其分化形式移植到纹状体或黑质密部中。
提供下列实施例进一步说明本发明的某些方面，但下列实施例并不限定本发明的范围。
实施例1MP52-诱导成熟啮齿动物海马神经祖细胞向多巴胺能表型分化 按先前公开的方法[Svendson等，Nat Rev Genet.，5(2)136-44(2004)]，从成熟大鼠大脑中分离成熟啮齿动物海马神经祖细胞。将分离的细胞以1000个细胞/cm2接种于层粘连蛋白包被的24孔组织培养板中(Becton Dickson，Bedford，MA)。
使接种的细胞最初在一种补充的神经基础培养基(NBM)中生长。NBM是带有B27补充物(Invitrogen，Carlsbad，CA)和L-谷氨酰胺(4毫摩尔)(Sigma，St.Lovis，MO)的Neurobasal-A培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)。补充的NBM也包含20纳克/毫升的上皮生长因子(EGF)(Sigma，St.Louis，MO)和20纳克/毫升的基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)(Peprotech，Rocky Hill，NJ)。
将一份(Set one)细胞在补充的NBM中培养17日。将第二份(Settwo)细胞先在补充的NBM中培养4日。然后，从培养板中除去补充的NBM，将细胞在含有20纳克/毫升的MP52(Biopharm GmbH，Heidelberg，Germany)的NMB中培养13日。将第三份(Set three)细胞先在补充的NBM中培养10日。然后，从培养板中除去补充的NBM，将细胞在含有200纳克/毫升的Sonic Hedgehog(SHH)(Sigma，St.Louis，MO)和100纳克/毫升的成纤维细胞生长因子8(FGF8)(Peprotech，Rocky Hill，NJ)的NMB中培养。将第四份(Set four)细胞先在补充的NBM中培养10日。然后，从培养板中除去补充的NBM，将细胞在含有20纳克/毫升的MP52、200纳克/毫升的SHH和100纳克/毫升的FGF8的NMB中培养。
在17-日实验期结束时，将所有的培养基用4％多聚甲醛(Sigma，St.Louis，MO)固定，然后进行免疫细胞化学染色以评估β微管蛋白III(TuJl)、神经胶质纤维(fibrilary)酸性蛋白(GFAP)和酪氨酸羟化酶(TH)的表达。
简言之，将固定的培养基用磷酸缓冲盐水(PBS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)洗涤，然后暴露于蛋白封闭溶液中30分钟。该蛋白封闭溶液为带有4％山羊血清(Chemicon，Temecula，CA)和0.3％Triton(Triton X-100，Sigma)的PBS。然后在室温下，将初级抗体溶液应用于含有封闭溶液加上1∶500稀释的TuJl抗体(Sigma，St.Louis，MO)、1∶1000稀释GFAP抗体(Chemicon，Temecula，CA)以及1∶2000稀释的TH(Chemicon，Temecula，CA)的样本中1小时。
除去该初级抗体溶液，将样本用PBS洗涤。然后在室温下，应用次级抗体溶液1小时。该次级抗体溶液为带有1∶250稀释的山羊抗-小鼠IgG-德克萨斯红(Chemicon，Temecula，CA)和1∶250稀释的山羊抗-家兔IgG-Alexa 488(Chemicon，Temecula，CA)的蛋白封闭溶液。然后将样本洗涤，与10微摩尔的4’-6-二脒基-2-苯基吲哚-2HCl(DAPI)(Molecular Probes，Eugene，OR)一起孵育10分钟以使细胞核显影。
免疫细胞化学染色后，使用Olympus倒置偏荧光(epifluorescent)显微镜观察荧光，然后用数字照相机和ImagePro软件(MediaCybernetics，Silver Spring，MD)获取影像。为进一步对反应定量，在200x放大倍率下，对细胞视野计数以检查对各标记物的阳性细胞的百分率，然后与在单独NBM下生长的对照样本进行比较。对每个条件下最少1000个细胞计数(或者如果更少)，在该条件下观察细胞总数。
对所给定的标记物呈阳性的细胞的百分率通过用对特定标记物呈阳性的细胞的数量除以DAPI染色确定的有核细胞总数来测定。表1显示对TuJl、TH和GFAP染色呈阳性的细胞的比例。
表1对给定标记物染色呈阳性的细胞的百分率 该表显示用NBM加上FGF8和单独用SHH，9％这些神经祖细胞分化为多巴胺能表型(通过TH阳性染色证实)。当将MP52与FGF8和SHH混合时，多巴胺能性分化明显增强(26％TH阳性)。此外，MP52还诱导这些神经祖细胞分化为星形细胞，其可通过免疫细胞化学证明的中间丝蛋白GFAP的表达增加所证实。虽然无论是否加入MP52与SHH和FGF8混合时，神经元(TuJl阳性细胞)总数并不明显变化，但发育成熟为多巴胺能TH阳性表型的这些细胞的百分率在MP52存在下确实明显增加。
实施例2MP52-诱导产后细胞中Nurrl表达 根据美国专利申请序列号10/887,012和10/877,446中所述，从脐带和胎盘消化液中分离产后细胞。简单地讲，从产后组织移出物中分离人脐带和胎盘细胞。
从分娩或正常手术分娩时的孕妇中获得所述各组织。在无菌状态下，在层流通风橱中进行下列细胞分离方案。
在抗霉菌剂和抗生素(AA)(每100毫升1毫升(每毫升10,000单位))(PBS-AA)存在下，将产后组织用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤。洗涤步骤包括在温和搅拌下用PBS-AA冲洗组织。将该过程进行数次以除去血和碎屑。然后在150cm组织培养板中，在50毫升DMEM-低葡萄糖(DMEM:Lg)或DMEM-高葡萄糖(DMEM:Hg)培养基存在下，将洗涤的组织机械性离解。
将组织剁成小碎片后，立即将其转移至50-毫升圆锥形管中，每管装约5gm组织。然后在40毫升含有AA的DMEM:Lg或DMEM:Hg中将组织消化，所述AA含有溶于DMEM中的10毫升胶原酶∶分散酶(C∶D)或者含有溶于DMEM中的胶原酶∶分散酶∶透明质酸酶(C∶D∶H)。C∶D是带有稀释于50毫升DMEM中的500毫克分散酶(0.4单位/毫克)的750毫克II型胶原酶(每毫克＞125单位(每毫克0.5-3FALGA单位))。因此，C∶D∶H是带有稀释于50毫升DMEM中的500毫克分散酶(0.4单位/毫克)和200毫克(300单位/mg)的750毫克II型胶原酶(每毫克＞125单位(每毫克0.5-3FALGA单位))。或者，在本方案中，还可利用IV型胶原酶(750毫克，每毫克＞125单位(每毫克0.5-3FALGA单位))。在37℃下，在定轨振荡器(温和震荡)内，将装有组织、培养基和消化酶的圆锥形管温育至少24小时。
消化后，将组织通过40微米尼龙细胞过滤器过滤。然后将过滤的细胞混悬液在1000×g下离心10分钟。将上清液抽气，然后再将细胞沉淀混悬于50毫升新鲜培养基中。将该过程完成2次，以从细胞群中除去残留的酶活性。然后移去上清液，将细胞沉淀再悬浮于2毫升扩充培养基(DMEM:Lg或DMEM:Hg；15％FBS(Hyclone确定的牛血清Lot#AND 18475)；2-巯基乙醇(1微升/100毫升)；每一抗霉菌素的抗生素(1毫升/100毫升(10,000单位/毫升))中。通过锥虫蓝排除的手工计数法，确定每批分离细胞的细胞生存力。
将分离的脐带和胎盘细胞以1000细胞/cm2接种于层粘连蛋白包被的24孔组织培养板(Corning，NY)中。按文献nonprov系列号中所述，先将细胞接种于维持培养基(空白对照)中。在维持培养基中4日后，将细胞分为4份。将第一份细胞转换为补充EGF(20纳克/毫升)和bFGF(20纳克/毫升)的NBM中，使其生长13日。将第2-4份细胞转换为补充EGF(20纳克/毫升)和bFGF(20纳克/毫升)的NBM中，使其生长6日。然后，除去补充有EGF和FGF8的NBM，使细胞在含下列成分的各NBM再培养7日MP52+SHH+FGF8(第二份)；MP52+SHH+FGF8+视黄酸(RA)(第三份)；或者MP52+RA(第四份)。
在17-日实验期结束时，使用Rneasy试剂盒(RNeasy Mini kit，Qiagen，Valencia，CA)，从所诱导的细胞群中分离RNA。根据制造商说明书(RNeasy Mini kit，Qiagen，Valencia，CA)，用含有β-巯基乙醇(Sigma St.Louis，MO)的350微升的缓冲RLT溶解细胞，然后在-80℃下储存。将细胞溶胞产物溶化，根据制造商说明书，用2.7U/样本DNase处理(Sigma St.Louis，MO)来提取RNA。将RNA用50微升的DEPC-处理的水(0.1％焦碳酸二乙酯，Sigma，St.Louis，MO)稀释，在-80℃下储存。使用带有TaqMan逆转录试剂的无规六聚体(AppliedBiosystems，Foster City，CA)，将RNA在25℃下逆转录10分钟，37℃下60分钟以及95℃下10分钟。将样本在-20℃下储存。
采用Assays-on-DemandTM基因表达产品Nurr I(Hs00428691)、酪氨酸羟化酶(Hs00428691)和GAPDH(Applied Biosystems，FosterCity，CA)，用TaqMan Universal PCR标准混合器，根据制造商说明书，利用带有ABI prism 7000SDS软件的7000序列检测系统，对cDNA样本进行定量PCR(Q-PCR)测定。热循环条件最初为50℃2分钟和95℃10分钟，接着是95℃15秒和60℃1分钟的40个循环。
表2中显示产后细胞分化后Nurrl和酪氨酸羟化酶(TH)mRNA的表达。该表显示MP52诱导产后细胞中Nurrl和TH表达。当与对照组(NBM+EGF+FGF8)比较时，在与SHH+FGF8+MP52或者SHH+FGF8+MP52+视黄酸一起培养后，在产后细胞培养物中诱导Nurrl表达。与对照组相比，当将产后细胞与MP52并仅与视黄酸混合一起培养时，Nurrl诱导进一步增加。与对照组(神经细胞基础培养基+B27补充物+EGF/FGF)比较，在与SHH+FGF8+MP52、SHH+FGF8+MP52+视黄酸或者MP52+视黄酸培养后，在脐带细胞培养基中诱导酪氨酸羟化酶(TH)表达。
表2多巴胺能分化后产后细胞中Nurrl和酪氨酸羟化酶的表达 注释SHH＝Sonic Hedgehog，FGF8＝成纤维细胞生长因子8，RA＝视黄酸 实施例3MP52-诱导成熟啮齿动物海马神经祖细胞分化为少突神经胶质细胞和星形细胞 通过复乳化(double-emulsion)技术制备包含MP52的微球核。简单地讲，将固有粘度为0.4dl/gm的50mg聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)的90∶10共聚物(以商品名MEDISORB出售，Alkermes，Inc.，Wilmington，OH)溶解于1.5ml二氯甲烷和0.5ml丙酮中。将25微克MP52溶解于含有0.1％(wt./vol.)人血清白蛋白(HSA)(Sigma，St，Louis，MO)的0.15ml的16mM柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中。在混合入微球体之前，将MP52用赋形剂重新配制以稳定蛋白质。采用Branson超声仪450(Branson Ultrasonics，Danbury，CT)，通过脉冲将聚合物/MP52水溶液连续超声10秒，得到一种单一乳剂(single emulsion)。将该单一乳剂加入到30ml含有5％(wt./vol.)聚乙烯醇(MW 31,000-50,000，87-89％水解化；Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)和5％(wt./wt.)NaCl的水溶液中。将得到的溶液经磁力搅拌1分钟，产生一种复乳剂(double emulsion)。
将该复乳剂(水/油/水)加入到包含10％(wt./wt.)NaCl的去离子水(400毫升)中，经磁力搅拌25分钟。然后将微球核通过40-微米尼龙细胞过滤器(Becton Dickinson，NJ)过滤，用去离子水(400ml)洗涤。然后将各核心在-80℃下冷冻2小时。随后采用Virtis Freezemobile(VirtisCompany，Gardinier，NYC)，通过冷冻干燥过程，将微球冷冻干燥。在-40℃的环境温度下，将微球体保持冷冻干燥，在4℃下的无菌微量小管中储存以备进一步使用。
将冷冻干燥的微球体在神经基础-A培养基中洗涤数次以除去碎屑。将洗涤过的微球体用层粘连蛋白(Sigma，St.Louis，MO)以20微克/毫升的量包被。在无菌eppendorf(Ambion，Austin，TX)中，将20-50个层粘连蛋白包被的微球体与500,000个成熟啮齿动物神经祖细胞(按实施例1中所述方法制备)在1毫升神经基础-A培养基中混合10-30分钟。将该核心/细胞混悬液接种于24孔超低群(ultra low cluster)组织培养板(Corning Inc.，Corning，NY)内的2孔中(500微升/孔)。再向各孔中补充100微升新鲜培养基维持另外5日。
实验期结束时，将附在微球上的细胞用4％多聚甲醛固定，然后进行免疫细胞化学以评估GFAP(GFAP，1∶1000，DakoCytomation，Carpinteria，CA)和髓磷脂碱性蛋白(MBP，1∶500，Chemicon，Temecula，CA)的表达。
为适当制备供染色的样本，将固定的、细胞包被的微球体在15ml圆锥形软管中以100x g离心3分钟。然后将沉淀再悬浮于少量无菌PBS中。用微量吸管将混合物置于称重舟形碟(weigh boat dish)的中心。将埋入化合物的OCT(Tissue-Tek OCT Compound，Sakura，Torrance，CA)加入到所述少量沉淀周围直至填充满称重舟。然后将称重舟置于乙醇和干冰冷冻浴顶端，以快速降低OCT的温度，从而在一种硬块(hard block)上包埋该细胞包被的微球。
然后用标准恒冷切片机(Leica)切成10-微米切片，然后置于载玻片上染色。用疏水性笔在切片周围划出一疏水表面以供染色，按以上实施例1中所述进行免疫染色，这一次采用以上提及的各浓度下直接对抗GFAP和MBP(1∶500，髓磷脂碱性蛋白，Chemicon，Temecula，CA)的抗体。
免疫组织化学证明接种于装载MP52的微球体上的成熟啮齿动物海马神经原的分化。装载MP52的微球体诱导明显数量的成熟啮齿动物神经祖细胞分化为GFAP阳性的星形细胞和髓磷脂碱性蛋白阳性的少突神经胶质细胞。这种作用在未装载MP52的对照粒子中未观察到。
在此，我们提供通过应用MP52将内源性或外源性(移植的)干细胞或者原粒子(progenitor)-样细胞或者其它可应用的细胞分化为多巴胺能表型，从而利用MP52作为在人中治疗帕金森氏病的药物的证据。可用这种方法缓解成人中由于丧失多巴胺能神经元从黑质密部突出至纹状体所引起的这类疾病。在尤其涉及海马神经原的该应用中，强烈的MP52分化能力为产生大量治疗帕金森氏病的多巴胺能细胞提供了一种治疗途径。
权利要求
1.一种治疗由人纹状体或黑质密部的损伤或疾病所引起的神经缺陷的方法，该方法包括给予所述人的所述纹状体或所述黑质密部有效诱导细胞群的量的GDF5-HR，所述细胞群具有向多巴胺能表型分化的能力，以便实际上使所述细胞向多巴胺能表型分化。
2.权利要求1的方法，其中所述GDF5-HR以单一剂量给予。
3.权利要求1的方法，其中所述GDF5-HR以缓释剂量给予。
4.权利要求1的方法，其中所述GDF5-HR作为包含生理学上可接受的载体的神经营养组合物给予。
5.权利要求4的方法，其中所述载体选自临床级无菌水、无菌盐水、无菌磷酸缓冲盐水、无菌葡萄糖水溶液、无菌液体介质和生理学上可接受的等渗液体。
6.权利要求1的方法，其中所述GDF5-HR在一种基质中被给予。
7.权利要求6的方法，其中所述基质的形式选自颗粒、支架、立方体、圆筒、软管、嵌入块、薄膜、水凝胶或薄片。
8.权利要求1的方法，其中所述GDF5-HR通过微导管、内导管插入术、鞘内传递而颅内给予，或者通过微型泵脑室内给予，或者鞘内或鼻内给予。
9.权利要求1的方法，其中所述细胞群包括选自干细胞或祖细胞的细胞，其为成熟神经原、海马祖细胞、海马干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、源于胚胎干细胞的祖细胞、产后衍生的细胞、脐带干细胞、脐带祖细胞、胎盘干细胞、胎盘祖细胞、肌肉干细胞、肝干细胞、胰干细胞、缘干细胞、视网膜干细胞、肌肉祖细胞、胰祖细胞、缘祖细胞、视网膜祖细胞和肝祖细胞。
10.权利要求1的方法，其中所述GDF5-HR选自MP52、BMP-14和CDMP-1。
11.权利要求1的方法，其中所述GDF5-HR包含MP52。
12.权利要求4的方法，其中所述GDF5-HR包含MP52。
13.权利要求12的方法，其中所述神经营养组合物包含约0.5-1,000纳克的所述MP52。
14.权利要求12的方法，其中所述神经营养组合物还包含SonicHedgehog和FGF8。
15.一种适用于治疗由人纹状体或黑质密部的损伤或疾病所引起的神经缺陷的神经营养组合物，它包含
有效诱导细胞群的量的GDF5-HR，所述细胞群具有向多巴胺能表型分化的能力，以便实际上使所述细胞向多巴胺能表型分化，
Sonic Hedgehog；
FGF8；以及
生理学上可接受的载体。
16.权利要求15的神经营养组合物，其中所述GDF5-HR选自MP52、BMP-14和CDMP-1。
17.权利要求15的方法，其中所述GDF5-HR包含MP52。
18.权利要求17的方法，其中所述神经营养组合物包含约0.5-1,000纳克的所述MP52。
19.权利要求17的组合物，它还包含Sonic Hedge Hog和FGF8。
20.权利要求15的组合物，它还包含Sonic Hedge Hog和FGF8。
全文摘要
本发明涉及通过给予人纹状体或黑质密部有效诱导细胞群的量的人重组GDF5，来治疗由人纹状体或黑质密部的损伤或疾病所引起的神经缺陷的方法，所述细胞群具有向多巴胺能表型分化的能力以便实际上使所述细胞向多巴胺能表型分化，本发明还涉及神经营养组合物和适于这类治疗用途的基质。
文档编号A61K38/18GK101065142SQ200580040119
公开日2007年10月31日 申请日期2005年9月26日 优先权日2004年9月28日
发明者S·米斯特里, D·J·梅西纳 申请人:伊西康公司