专利名称：促红细胞生成素微球在制备治帕金森病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及促红细胞生成素微球的新用途，具体地说，是促红细胞生成素微球在制备治帕金森病药物中的用途。
背景技术：
帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是中老年人常见的神经系统退行性疾患，主要与黑质致密区多巴胺能神经元变性缺失及由此造成的黑质纹状体通路多巴胺递质减少有关。经过多年的临床实践，一般认为，左旋多巴仍是最有效的治疗帕金森病药物。但左旋多巴长期应用后，大部分患者会出现症状波动、异动症(levodopa-induced dyskinesia,LID)和精神症状，即H)运动并发症，加之实验室发现高浓度多巴胺(dopamine，DA)和左旋 多巴会由于自身氧化产生自由基，可导致神经细胞变性坏死，因此，联合其他药物共同预防和治疗ro病症十分迫切。研究发现纹状体GRKs和Arrestins表达的变化与H)的发展关系密切。近年研究表明，PD运动并发症的发生与表达Dl受体的直接通路及其下游cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)、ERK等信号转导通路被激活关系密切，其下游信号转导蛋白多巴胺和环磷腺苷调节的憐酸化蛋白 _32 (dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32000,DARPP-32)的蛋白Thr75位点磷酸化表达的改变可能参与了异动症的发病。目前认为使用左旋多巴控释剂、多巴胺受体激动剂、B型单胺氧化酶(monoamineoxidase-B type,MA0_B)抑制剂和儿茶酌·-氧位-甲基转移酶抑制剂(eateehol-O-methyltransferase inhibitor, C0MTI)可延缓运动并发症的出现。但是西药预防和治疗产生的副作用较大，容易形成耐药性，不宜长期服用。促红细胞生成素(Erythropoietin, ΕΡ0)是一种参与调节红细胞前体细胞分化、增殖、抑制凋亡的糖蛋白激素，可以增加红血球的数目。近年来越来越多的研究表明，EPO在神经发育、神经保护和成年神经元修复、生存、再生过程中均发挥着非常广泛和复杂的作用，而且认为它的神经保护作用是一种不依赖于其促进红细胞生成功能的直接作用。另外，EPO及其受体(Erythropoietin receptor, EPO-R)在哨齿类、哺乳类及人类的神经元和胶质细胞均有表达。关于促红细胞生成素对H)模型的保护作用及其机制的实验研究已有报道，但是关于促红细胞生成素与多糖、缓释材料制备的微球在治疗和预防H)病症药物中的应用还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种促红细胞生成素微球在制备治帕金森病药物中的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是
促红细胞生成素微球在制备治帕金森病药物中的应用，所述的促红细胞生成素微球是自然提取的促红细胞生成素、基因重组表达促红细胞生成素、聚乙二醇修饰的促红细胞生成素、糖基化修饰的促红细胞生成素或人血清融合的促红细胞生成素中的一种与多糖制备成促红细胞生成素多糖颗粒，所述促红细胞生成素多糖颗粒再与缓释材料制备成促红细胞生成素微球。所述的促红细胞生成素多糖颗粒是指促红细胞生成素与多糖在聚乙二醇溶液中通过冷冻干燥或喷雾干燥制备得到，所述多糖是葡聚糖或海藻酸钠中的一种。所述的缓释材料为聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸-聚乳酸(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)或聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇(PLGA-PEG)中的一种。所述的促红细胞生成素微球是通过水包油-油包固(S/0/W)的方法或水包油-油包油-油包固(S/0/0/W)的方法制备得到。所述的促红细胞生成素微球是通过皮下注射或颅内注射。
所述的促红细胞生成素微球的注射剂量为10万单位 500万单位/kg。所述的促红细胞生成素微球的注射频率为7天 60天一次。本发明优点在于
1、本发明发掘了促红细胞生成素微球的新医疗用途，开拓了一个新的应用领域；
2、该促红细胞生成素微球作为药物治疗和预防ro病症具有长效缓释、无毒副作用、顺应性好、减轻病人痛苦、价格低等优点，易于被患者接受；
3、促红细胞生成素微球制备工艺简单，对环境友好，在治疗和预防ro病症中有良好的应用前景。
附图I是大鼠脑脊液EPO含量结果。附图2是免疫组化检测大鼠脑内EPO结果。附图3是免疫组化检测大鼠脑内EPO-R结果。附图4是免疫组化检测大鼠黑质TH细胞结果。附图5是大鼠脑内黑质多巴胺能神经元计数结果。附图6是大鼠黑质TH的检测结果。附图7是大鼠纹状体TH的检测结果。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例I促红细胞生成素微球的制备 一、制备促红细胞生成素多糖颗粒
①用超纯水分别制备10% (w/w)的聚乙二醇(PEG)水溶液和10% (w/w)的葡聚糖水溶液。精确称取SOOmg自然提取的促红细胞生成素溶于7.2ml超纯水中待用。②在0°C 4°C条件下，将上述的葡聚糖水溶液、促红细胞生成素水溶液和PEG水溶液按照体积比为1: 1: 5、1: 1:10、1: 1:20或1: 1:40的比例混合，然后旋涡震荡30s 60s充分混匀。③将促红细胞生成素、PEG和葡聚糖形成的混合溶液冷冻过夜，然后真空冷冻干燥。
④将步骤③所得的样品用二氯甲烷洗涤三次除去PEG连续相，获得载促红细胞生成素多糖颗粒。得到的促红细胞生成素多糖颗粒的粒径为O. 3 5μπι，这些玻璃体颗粒光滑圆整，粒径分布均匀，促红细胞生成素的结构得到较好的保护，避免了在剂型制备过程中失活。二、制备促红细胞生成素微球
①称取Ig聚乙烯醇(PVA)和5g NaCl，加超纯水94g，然后加热、搅拌，至PVA完全溶胀，停止加热，继续缓慢搅拌，待溶液呈澄清透明且无气泡后，停止搅拌，放于4°C冰箱待用。该溶液中PVA浓度为1% (w/w), NaCl浓度为5% (w/w)。②精确称取缓释材料聚羟基乙酸-聚乳酸(PLGA) 200mg，加二氯甲烷800mg，漩涡振荡，使PLGA溶于二氯甲烷中，得PLGA的二氯甲烷溶液，浓度为20 % (w/w)，现用现配，以 防二氯甲烷挥发。③称取促红细胞生成素多糖颗粒10mg，均匀分散于O. 5g步骤②中的PLGA的二氯甲烧溶液中，磁力搅拌15min,转速1800rpm,充分搅拌使得促红细胞生成素多糖颗粒均勻分散于PLGA的二氯甲烷溶液中，将所得初乳分散于含I % (w/w) PVA和5% (w/w)氯化钠的水溶液中，以2200rpm的转速勻衆成复乳(S/0/W),于Imin内转移到4°C的10% (w/w)氯化钠的水溶液中固化，搅拌3 4小时后收集陈化的蛋白微球，用超纯水洗涤三次，在冰相预冻过夜，再真空冷冻干燥，制得粒径在50 μ m 120 μ m的微球。需要说明的是，促红细胞生成素还可以是基因重组表达促红细胞生成素、聚乙二醇修饰的促红细胞生成素、糖基化修饰的促红细胞生成素或人血清融合的促红细胞生成素中的一种。所述的促红细胞生成素多糖颗粒还可以是促红细胞生成素与多糖在聚乙二醇溶液中通过喷雾干燥制备得到，所述多糖还可以是海藻酸钠。所述的缓释材料还可以是聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)或聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇(PLGA-PEG)中的一种。所述的促红细胞生成素微球还可以采用水包油-油包油-油包固(S/0/0/W)的方法制备得到(详见Yuan W，Wu F，Guo M, Jin T. Development of protein deliverymicrosphere system by a novel S/O/O/ff multi-emulsion. Eur J Pharm Sci, 2009,36(2-3) : 212-218.袁伟恩，吴飞，葛梅燕，金拓.用一种新颖的水包油-油包油-油包固的方法制备输送蛋白微球系统，欧洲药剂科学杂志，2009，36 (2-3):212-218)。制备的促红细胞生成素微球可以用于皮下注射或颅内注射，起到缓释和治疗H)病症的作用。实施例2自然提取的促红细胞生成素制备的微球治疗ro的临床前试验 一、实验方法
I. PD模型制备
大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥麻醉后，严格平颅位固定于大鼠脑立体定向仪上，剪毛后碘伏消毒头部皮肤，沿正中线切开头皮，15%双氧水烧灼骨膜，暴露颅骨缝及前囟，确定前囟坐标，根据包新民等所著《大鼠脑立体定位图谱》，确定右侧前脑内侧束(medial forebrainbundle, MFB)注射位点①前囟后3. 7mm,矢状缝右侧I. 7mm,卢页骨下8. Omm,门齿线2. 4mm ；
②前囟后4. 4mm,矢状缝右侧I. 2mm,卢页骨下8. 0mm,门齿线2. 4mm。按上述确定的注射位点钻孔，用10 μ I规格的微量注射器抽取6-OHDA 6 μ 1(溶于O. 2%维生素C生理盐水，浓度4 μ g/μ 1)，每点注射3 μ I,注射速度约I μ 1/min,留针5min后缓慢退针,退4mm再留针5min,直至完全退出，缝合皮肤切口，置笼喂养。3周后，大鼠腹腔注射阿朴吗啡(O. 5mg/kg)诱导旋转，平均旋转频率> 7次/min为成功H)大鼠模型。微球注射液预处理
羧甲基纤维素(CMC)溶剂配方0. 5%CMC，5%甘露醇，O. 1%吐温_80，加水溶解。EPO微球注射液将123mg实施例I所制备的EPO微球溶于7. 5mlCMC溶剂中，得到含EPO和CMC的混悬液，即EPO微球注射液，其中，EPO的终浓度为10000 U/ml。
模型分组和行为学测定
随机将ro大鼠模型分为①ro组(ro大鼠不再做进一步处理)、②epo微球 ο万单位/kg组(ro大鼠皮下注射或颅内注射剂量为 ο万活性单位/kg大鼠的自然提取的epo制备的微球)、③epo微球loo万单位/kg组(ro大鼠皮下注射或颅内注射剂量为loo万活性单位/kg大鼠的自然提取的EPO制备的微球)、④EPO微球500万单位/kg组(H)大鼠皮下注射或颅内注射剂量为500万活性单位/kg大鼠的自然提取的EPO制备的微球)。EPO微球注射频率为7天 60天一次。另设有假手术组正常SD大鼠，不作任何处理。各组大鼠经腹腔注射阿朴吗啡诱导旋转，记录其30分钟内旋转圈数，计算各组大鼠每分钟的平均旋转圈数。大鼠脑脊液抽取
大鼠在注射EPO微球注射液I周后，予腹腔注射3%的戊巴比妥麻醉后，严格平颅位固定于大鼠脑立体定向仪上，剪毛后碘伏消毒头部皮肤，解剖器械由18G针头改造，针尖
I.5_，用钳子改成90度角。30G针连接Iml注射器用于收集脑脊液。改造枕头钝性分离表层肌肉，暴露环枕膜，立即用连接Iml的30G针头以30度角度从切口的尾端刺入环枕膜，进入约1mm，抽取脑脊液。将脑脊液注入O. 5ml的EP管中，_80°C下保存待用。免疫组化染色
大鼠在结束注射后的第12h，每组随机抽取4只大鼠用乙醚麻醉，依次经心脏灌注预冷的生理盐水IOOml和4%多聚甲醛300ml，断头取脑，相同固定液中后固定8h，经修块、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡后用石蜡包埋。行石蜡切片，切片厚度为5 μ m。取纹状体冠状层面采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP法)行免疫组化染色，步骤如下石蜡切片脱蜡至水；3%双氧水室温避光孵育5min，以消除内源性过氧化氢酶活性；pH7. 7的I nmol/1 EDTA-Tris-HCl 微波加热修复；1%BSA_PTS (O. 5%Triton-X100)室温封闭 20min ；TH受体单克隆抗体(1:400，1%BSA稀释)4°C湿盒内孵育过夜；滴加稀释的生物素标记二抗，37°C孵育20min ;滴加稀释的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37°C孵育20min ;联苯二胺(DAB)显色剂显色，自来水冲洗，之后脱水、透明、封片。各步骤之间均用O.Olmol/1 PBS充分漂洗，PBS代替一抗作为阴性对照。免疫组化切片各观察区随机取5个不重叠视野，于高倍镜(10父40)下观察，采用01^10^3-^50成相系统拍摄，1111&86- 1'0 Plus 5. I图象处理软件进行半定量分析，计算TH受体阳性细胞指数(IOD) =阳性细胞面积X校正光密度值(测量区光密度一背景光密度)。蛋白免疫印迹
大鼠在最后一次注射12h后，乙醚麻醉，每组随机抽取4只大鼠断头处死。迅速开颅取脑，快速冰上分离双侧纹状体，每IOmg组织加入100 μ I蛋白裂解液RIPA (含有50mMpH7. 4 Tris, 150mM NaCl, l%Triton X-100,1% sodium deoxycholate, 0. 1% SDS 以及 sodiumorthovanadate, sodium fluoride, EDTA, leupeptin 等)和 I μ I 蛋白酶抑制剂 PMSF,超声充分匀浆，冰上裂解30 min，然后置于4°C离心机于HOOOrpm离心30min，吸取上清液至另
一 EP管，提取总蛋白，测定蛋白浓度后于-80 0C保存。蛋白电泳溶液配制。IX电泳缓冲液(Running Buffer) 14. 4g/L甘氨酸，3g/LTris base, lg/L十二烧基横酸钠。转膜缓冲液(Transter Buffer) :19.375 g Tris base,0. 75 g 甘氨酸，200ml 甲醇加水至 1000ml。IX 上样缓冲液(Sample Buffer) 62. 5mMTris-HCl (pH6. 8，25°C )，2% w/v 十二烷基磺酸钠，10% 甘油，50mM 二硫苏糖醇，(λ 01%w/v 溴酌■蓝或酌■红。10 X TBS (Tris-buffered saline):封闭缓冲液(Blocking Buffer) I X TBS,
0.1%吐温-20和5% w/v脱脂奶粉。第一抗体稀释液I X TBS, 0. 1%吐温-20和5%封闭剂。Wash Buffer TBS/T :1 XTBS，0. 1% Tween-20。·配胶用BiO-Rad公司的专用配胶槽，用15 μ I微量注射器或20 μ I EPPEND0RF移液枪加已变性的样品于加样孔中，每加一个，水冲洗针管。先在100V下电泳30min，再稳压150V电泳60min。蛋白转膜，250mA的电流下转移90min，转膜后取膜。转膜后用25ml TBS室温下洗膜5min ;用25ml的封闭缓冲液室温下封闭Ih ;用15ml的Wash Buffer洗3次，每次5min ;按相应浓度稀释第一抗体TH抗体(滴度为1:400)或抗β -actin的兔抗溶液(滴度为1:1000)，在IOml的一抗稀释缓冲液中，4°C轻摇孵育膜过夜；用15ml的Wash Buffer洗3次，每次5min ;加第二抗体(抗兔的HRP相连的IgG ；1:1000)于IOml的封闭缓冲液中室温下轻摇孵育膜Ih ;用15ml的Wash Buffer洗3次,每次5min。配置IOml的ECL显色混合液，加于PVDF膜上，置室温中反应，去除多余液体，用Imagelab图像分析软件计算各样本目的蛋白条带OD值与面积值的乘积，从而进行蛋白条带密度定量。每个样品的免疫印迹蛋白条带与β -actin相比较后，得出一个密度比，再进行统计学分析。统计学分析
采用SPSS13. O软件进行统计学处理。数据以均数土标准误差表示，应用团体t检验和单因素方差分析进行统计，以P < 0. 05为显著性水平。二、结果
I.不同剂量EPO微球对大鼠模型旋转次数的影响
各组大鼠注射阿朴吗啡后，其平均旋转圈数结果见表1，假手术组大鼠30分钟内平均旋转数为0±2圈/分钟，ro组大鼠30分钟内平均旋转数为19±2圈/分钟，与假手术组相比P〈0. 001 (*) ;10万活性单位/kg EPO微球组旋转数为15±2圈/分钟，与H)组相比无显著差异；100万活性单位/kg EPO微球组旋转数为4± I圈/分钟，与H)组相比P〈0. 001(#) ；500万活性单位/kg EPO微球组旋转数为2±1圈/分钟，与ro组相比P〈0. 001 (#)。结果表明自然提取的EPO制备的微球可以降低ro大鼠的不自主旋转次数，其中，高剂量EPO微球有十分明显的治疗效果。表I不同剂量EPO微球对大鼠模型旋转次数的影响
权利要求
1.促红细胞生成素微球在制备治帕金森病药物中的应用，其特征在于，所述的促红细胞生成素微球是自然提取的促红细胞生成素、基因重组表达促红细胞生成素、聚乙二醇修饰的促红细胞生成素、糖基化修饰的促红细胞生成素或人血清融合的促红细胞生成素中的一种与多糖制备成促红细胞生成素多糖颗粒，所述促红细胞生成素多糖颗粒再与缓释材料制备成促红细胞生成素微球。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的促红细胞生成素多糖颗粒是指促红细胞生成素与多糖在聚乙二醇溶液中通过冷冻干燥或喷雾干燥制备得到，所述多糖是葡聚糖或海藻酸钠中的一种。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的缓释材料为聚乳酸、聚羟基乙酸-聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-聚乙二醇或聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇中的一种。
4.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的促红细胞生成素微球是通过水包油-油包固的方法或水包油-油包油-油包固的方法制备得到。
5.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的促红细胞生成素微球是通过皮下注射或颅内注射。
6.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的促红细胞生成素微球的注射剂量为10万单位 500万单位/kg。
7.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的促红细胞生成素微球的注射频率为7天 60天一次。
全文摘要
本发明公开了促红细胞生成素微球在制备治帕金森病药物中的应用，所述的促红细胞生成素微球是自然提取的促红细胞生成素、基因重组表达促红细胞生成素、聚乙二醇修饰的促红细胞生成素、糖基化修饰的促红细胞生成素或人血清融合的促红细胞生成素中的一种与多糖制备成颗粒，所述颗粒再与缓释材料制备成微球。本发明的优点在于发掘了促红细胞生成素微球的新医疗用途，开拓了一个新的应用领域，促红细胞生成素微球治疗和预防帕金森病具有长效缓释、无毒副作用、顺应性好、减轻病人痛苦、价格低等优点，易于被患者接受，促红细胞生成素微球制备工艺简单，对环境友好，在治疗和预防帕金森病中有良好的应用前景。
文档编号A61K38/18GK102895655SQ201210366598
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者刘振国, 袁伟恩, 戚辰, 张奇昕 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院