治疗帕金森病及帕金森综合症的药物及其制备方法

专利名称：治疗帕金森病及帕金森综合症的药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗帕金森病及帕金森综合症的药物及其制备方法，属于中药领域。
背景技术：
帕金森病和帕金森综合症(Parkinson，PD)是临床常见病，特别是随着人口老龄化，老年人口的比例和绝对数逐渐增加，作为老年退行性脑病的帕金森病和帕金森综合症其发病率和患病率正迅速增加。帕金森病(PD)是以进行性运动功能障碍为主要临床表现的中枢神经系统变性性疾病，震颤、僵直及运动减少是其最主要的临床表现。
目前，市场上尚无治疗帕金森病和帕金森综合症的中成药。帕金森病及帕金森综合症的治疗主要是药物治疗和手术治疗两大类，手术疗法由于有严格的适应症(原发性帕金森病的部分患者)、70％左右的复发率、技术难度大，存在手术并发症、价格昂贵等因素，因此，仅仅限于大医院的少量患者，不能普及，而大量的患者还是主要依靠药物治疗为主。目前的药物治疗主要是西药为主，常用的药物分为多巴胺类制剂，如左旋多巴、美多芭、息宁等，这是治疗帕金森病的主要药物，另外，还有多巴胺受体激动剂，如溴隐停、协良行等，抗胆碱能药物，如安坦等，另外，还有增加多巴胺释放的药物，如金刚烷胺，抑制多巴胺降解的药物，如Selegiline等。目前的治疗药物主要是改善症状，不能延缓病情的发展，并且，很多研究发现，虽然多巴胺类替代疗法疗效显著，但应用过早，或长期应用，或用量较大，反而可能促进自身的多巴胺能神经细胞的萎缩，和产生多巴胺的功能丧失，使病情进行性加重，因此，现在一般不主张早期应用多巴胺类制剂，也不主张大量应用。而提出“细水长流，不求全效”的用药思路，或推广“假日疗法”等。一般多巴胺类制剂的疗效在用药5～10年后趋于消失，机体不再有效地吸收和利用多巴胺，最后出现无药可医的局面。另外，治疗帕金森病的药物多数存在较多的副作用，长期应用的患者多数出现幻觉、异动症、低血压、胃部不适、严重心衰、心律失常、精神病、运动障碍等不良反应，并且长期应用还可以出现“开关现象”、“剂末现象”、“剂量高峰多动症”等特殊问题，同时很多合并症如冠心病、低血压、糖尿病、青光眼、胃病等均因为不良反应限制了西药的应用。还有巴胺类替代疗法对帕金森综合症往往疗效较差，甚至无效，所以，积极寻找其它安全有效的治疗办法，改善患者生存质量，尤其是早期轻型患者，能代替巴胺类制剂的又无不良反应的药物以及重症患者提高巴胺类制剂疗效、增加其疗效持续时间、减轻其不良反应的增效减毒，改善患者生存质量的药物是现代帕金森病药物研究和开发的重点。

发明内容
本发明的目的在于提供一种在总结多年临床治疗帕金森病经验的基础上，通过对帕金森病临床患者的临床症状、证候和体质的特点、以及病因病机的深入研究而制成治疗帕金森病及帕金森综合症的药物。
本发明的另一个目的是提供了该中药组合物的制备方法。
本发明药物选择白芍、钩藤、天麻、蒺藜、石决明、制何首乌、珍珠母、牡蛎、丹参、炙甘草进行组合的，将这些药物组合使得各药物功效产生作用，从而能够有效地治疗帕金森病患者的症状。其中选用白芍是因为白芍具有平抑肝阳，养血敛阴，柔肝止痉，与天麻、钩藤等配伍，可以起到平肝潜阳，熄风止痉，用于阴虚阳亢，风邪内动，肢体或头部震颤、抖动，眩晕、头痛、烦躁易怒等肝阳上亢，肝风内动证；选用钩藤是因为钩藤具有息风止痉，平肝清热之功，与白芍合用加强白芍平肝息风舒解肢体筋脉挛缩，动作缓慢不灵和肢体震颤的作用；选用天麻是因为天麻具有息风止痉，平肝潜阳，祛风通络之功。与白芍合用，可以加强平抑肝阳、舒痉止颤的作用；选用蒺藜是因为蒺藜具有平肝疏肝，祛风明目之功，与白芍、天麻等合用，可以辅助和加强白芍、钩藤平肝潜阳，息风止痉的作用；选用石决明是因为石决明具有清泄肝火，镇潜肝阳之功，同时由于具有咸寒滋养肝阴的作用，与白芍合用，可以加强白芍的滋补肝之阴血缓解筋脉拘急的作用；选用制何首乌是因为制何首乌具有补益肝肾阴血，润肠通便之功。与白芍合用，可以加强白芍的滋补肝之阴血缓解筋脉拘急的作用。同时，何首乌还具有润肠通便之功，对帕金森病患者多数合并有的便秘有较好的作用；选用珍珠母是因为珍珠母具有平肝潜阳，清肝明目，镇静安神作用，与白芍合用，可以加强白芍的平抑肝阳，养血敛阴，柔肝止痉的作用。与石决明、佐药牡蛎等重镇药平肝潜阳药物合用，可以加强平肝潜阳，重镇止颤的作用。与钩藤合用，可以加强钩藤平抑肝阳之功；选用牡蛎是因为具有平肝潜阳，重镇安神的作用，与石决明、珍珠母合用，适用于肝阴不足，肝阳上亢所致的震颤、眩晕、头痛、烦躁易怒等证。同时牡蛎质重能镇，具有安神之功，适用于心神不安，惊悸怔忡，失眠多梦等证；选用丹参是因为丹参具有活血止痛，清心除烦的功效，另外丹参活血养血可加强白芍养血滋阴的作用，丹参药性偏凉，善入心经，能清心除烦安神，与重镇的石决明、珍珠母、牡蛎合用，对于帕金森病患者的心神不安，惊悸怔忡，失眠多梦等证有较好的治疗作用；选用炙甘草是因为炙甘草具有益气补中，缓急止痛，调和药性的作用，炙甘草味甘，与白芍合用，酸甘化阴，柔筋缓急止痛，可以加强白芍的养血敛阴，柔肝止痉，缓解筋脉拘急，进而增加肢体灵活性。同时由于炙甘草味甘性平，得中和之性，能缓和钩藤、天麻、蒺藜诸药之刚性，使其作用柔和而持久，不致于作用过强而伤肝，与石决明、珍珠母、牡蛎等质重的介类重镇之品合用，可以减轻对胃的刺激，减缓其重镇潜降之性，固护肝胃，因此既有佐药的作用，又有使药的作用。综合全方诸药，本品具有平肝潜阳，养血敛阴，熄风止痉，养心安神，舒痉止颤之功，诸药合力，起到了滋补肝肾，平肝潜阳，息风止痉的作用，正好与本品的病机肝肾阴虚、肝阳上亢，肝风内动基本一致，达到改善帕金森氏病、帕金森综合症患者的症状和生存质量。
本发明药物是由下列组份制成的(用量为重量份)白 芍73.73～2.99钩 藤73.73～2.99天麻44.16～1.79蒺 藜74.72～3.03石决明73.73～2.99制何首乌53.09～2.15
珍珠母73.73～2.99牡 蛎73.73～2.99丹参53.09～2.15炙甘草22.23～0.90。
制备本发明药物的配方优选重量(份)配比范围是白 芍47.88～2.99钩 藤47.88～2.99天麻28.68～1.79蒺 藜48.52～3.03石决明47.88～2.99制何首乌34.48～2.15珍珠母47.88～2.99牡 蛎47.88～2.99丹参34.48～2.15炙甘草14.44～0.90。
本发明药物的最佳重量(份)配比是白 芍11.97 钩 藤11.97 天麻7.17蒺 藜12.13 石决明11.97 制何首乌8.62珍珠母11.97 牡 蛎11.97 丹参8.62炙甘草3.61。
本发明药物可以采用中药制剂的常规方法制备成任何常规的内服药品。
将上述各组份制成本发明药物的制备方法是a)将钩藤、天麻、制何首乌、丹参加10～90％的乙醇，提取多次，每次0.5～3.0小时，合并乙醇提取液、过滤；b)滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.0～1.3，备用；c)药渣与白芍、蒺藜、石决明、珍珠母、牡蛎、炙甘草加水煎煮多次，每次0.5～3.0小时，水煎液滤过，合并滤液及醇提浓缩液，浓缩至相对密度为1.1～1.4；d)加入适量的辅料，制成药剂。
辅料可以是糊精、阿斯帕坦。
本发明药物具有平肝潜阳、熄风止痉之功效。用于治疗因肝阳上亢，肝风内动引起的帕金森病和帕金森综合症，症见肢体振颤、僵硬、不灵活，动作缓慢，便秘，面部表情呆板、行动困难，眩晕、头痛、烦躁易怒、肢体麻木、失眠、多梦、心悸，舌质红，脉弦等病症。


图1是HPLC标准品检测图谱。
图2是HPLC纹状体样品检测图谱。
图3是致帕金森病样模型大鼠黑质处酪氨酸羟化酶免疫组化染色图谱。
图4是本发明药物对单侧黑质纹状体通路损毁大鼠模型的药理作用的技术路线图。
图5是本发明药物颗粒对药物性肌肉震颤模型小鼠的药理作用示意图。
图6是本发明药物颗粒对MPTP致PD样模型小鼠的药理作用示意图。
具体实施例方式
以下通过实验例来进一步阐述本发明所述药物的有益效果，这些实验例为本发明药物的药效学试验[实验例I]本发明药物对单侧黑质纹状体通路损毁大鼠模型的药理作用本实验例考察本发明药物对单侧黑质纹状体通路损毁致帕金森病样模型大鼠的运动功能、大鼠皮层过氧化脂质水平、纹状体内多巴胺含量及黑质处神经元数量的影响。
实验材料1、动物SD大鼠，雄性，体重200±20g2、试剂与仪器试剂6-羟多巴胺(6-hydroxydapamine，6-OHDA)、辛烷磺酸钠盐(octylsulfate sodium salt，OSA)、多巴胺(Dopamine，DA)、二羟基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)、二羟基苯甲胺(3，4-dihydroxybenzylamine，DHBA)、高香草酸(homovanillic acid，HVA)、硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetra-acetic acid，EDTA)、高氯酸、甲醇、酚、酪胺酸羟化酶抗体。
仪器SN-2N型动物脑立体定位仪、8453型紫外可见分光光度计、高效液相色谱仪、460电化学检测器、碳18反相色谱柱、T21型高速冷冻离心机、Image-pro plus图象采集及分析系统。
实验方法1、纹状体6-OHDA定向损毁大鼠模型的建立参照Yukio lchitani等的方法建立6-OHDA纹状体定向损毁的大鼠PD模型6-OHDA溶于0.9％生理盐水中(含0.1％抗坏血酸)。大鼠以10％水合氯醛麻醉，脑立体定位仪定位，平颅头位，右侧为健侧，左侧进行四点注射，四点分别为前囟前(AP)0.5-1.0mm，中线旁开(ML)3.0mm，自颅骨表面深度(DV)5.5mm及4.5mm各一点，及平前囟，中线旁开(ML)3.0mm，自颅骨表面深度(DV)5.5mm及4.5mm各一点，每点注射6-OHDA 2μl(3μg/μl)。对照组(假手术)注射等量生理盐水。
2、大鼠旋转行为的检测及模型鼠的筛选参照郜文等的实验方法术后2周起对各组实验动物腹腔注射盐酸阿朴吗啡(0.25mg/kg)，观察其行为学变化，3分钟后，开始记录大鼠旋转次数，连续测定40分钟。
在造模4周后进行筛选传统的帕金森病样大鼠模型制备方式为黑质处6-OHDA的定向损毁，选择旋转圈数＞6圈/分钟的大鼠作为合格大鼠模型，但此时大鼠脑中多巴胺(DA)的含量已严重下降，多降低95％以上，为便于观察药物作用效果，我们选择了6-OHDA纹状体处定向损毁的中度损毁造模方式，选择恒定向健侧旋转且旋转圈数＞40圈/40分钟的大鼠作为合格模型鼠，选择任一次测定均不产生旋转行为的假手术大鼠作为对照鼠，其余则淘汰。
在用药2周和6周时，分别测定阿朴吗啡诱导的各组大鼠的旋转行为，测定时间40分钟。计算每只大鼠用药后旋转圈数下降率。计算方法下降率＝(用药前旋转圈数-用药后旋转圈数)/用药前旋转圈数×100％。
3、分组及给药将经筛选合格大鼠随机分组。假手术组蒸馏水(10ml/kg)连续灌胃7周；模型组蒸馏水(10ml/kg)连续灌胃7周；本发明药物组分别给予颗粒1g/kg、2g/kg、4g/kg连续灌胃7周；美多巴组(阳性对照药组)给予美多巴50mg/kg/日(一日两次)连续灌服7周。
4、脑组织脂质过氧化产物丙二醛(MDA)测定脑组织称重，以1∶8的比例加0.2M pH7.4磷酸盐缓冲液进行匀浆，3000rpm离心10min，取上清0.5ml。加1/24mol/L H2SO44ml、10％磷钨酸0.5ml搅拌，室温放置5分钟，3000rpm离心10分钟，弃上清，倒控1min。加1/24mol/LH2SO42ml、10％磷钨酸0.3ml，搅拌，室温放置5分钟，3000rpm离心10分钟，弃上清，倒控1分钟。按下表加试剂。
测定管标准管空白管匀浆沉淀物 有- -四乙氧基丙烷(5nmol/ml) - 0.5 -生理盐水(ml) 0.5 - 0.50.05mol/L HCl(ml)1 1 1TBA溶液6.7mg/ml(ml) 1 1 1加塞混匀，置沸水浴1h后冷却，2000rpm离心5min，取上清，532nm测OD值计算丙二醛浓度丙二醛浓度＝f/F×5nmol/ml(F标准溶液OD，f样品(OD)5、高效液相色谱法对脑组织单胺类神经递质及其代谢产物的测定标准品配制各标准品都溶于流动相中，浓度为0.1mg/ml，使用时分别稀释到10ng/ml，进样量10μl。
色谱条件Waters公司碳十八反相色谱柱，洗脱液80mM磷酸氢二钠，60mM柠檬酸，0.22mM乙二胺四乙酸二钠，0.5mM octyl sulfate sodium salt，20％甲醇。调pH为4.3，经过滤脱气后使用，流量1.0ml/min。电化学检测器工作电压0.7v，测定温度37℃。标准品在浓度和峰面积间有良好的线性关系，r2＞0.99。
样品预处理参照张林魁等人的方法进行样品的预处理按照1∶10(w/v)的比例向纹状体内加入0.1M高氯酸(每100ml含L-半胱氨酸5mg，内标DHBA浓度为200ng/ml)制备匀浆，置高速冷冻离心机12000转，温度为4℃离心20分钟。取上清10μl测定其中的多巴胺用其代谢产物的含量。
6、脑黑质处酪胺酸羟化酶的免疫组织化学染色灌注固定，取材用10％水合氯醛腹腔注射麻醉动物，将动物固定于平台上，开胸，由心尖剪开左心室，插入灌注针头至主动脉根部，并剪开右心耳，快速灌注温盐水，直至心室内无血，肝脏变白，再用预冷的灌注固定液进行灌注固定，直至动物全身僵直，再慢灌10-20分钟后，取出脑组织放入后固定液中，待组织下沉后应用。
免疫组织化学染色将脑组织从后固定液中取出，用自来水冲洗，修块，置于异戊烷中，放入液氮中速冻10-15钞，组织经冠状切面切为40μm厚的组织薄片，将组织片放入PBS液中洗涤，5分钟/次×3次，组织片用3％H2O2室温孵育10分钟，以去除内源性过氧化物酶活性，PBS洗液充分洗涤，5分钟/次×3次，用5-10％封闭用羊血清室温孵育30分钟，以减少非特异性吸附，吸出羊血清，加入1∶5000稀释的酪胺酸羟化酶抗体(TH室温孵育2小时后转入4℃孵育48小时。PBS洗液充分洗涤，5分钟/次×3次，加入生物素标记的鼠二抗(稀释度为1∶300，37℃水浴箱中保温30分钟，PBS洗液充分洗涤，5分钟/次×3次，加入辣根过氧化物酶标记的三抗(稀释度为1∶200)，37℃水浴箱中保温60分钟，PBS洗液充分洗涤，5分钟/次×3次，DAB显色，镜下控制染色程度，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照的设立分别以洗液和非免疫的正常兔血清代替一抗进行免疫组化染色，其余步骤同前。阳性反应为组织细胞结构呈棕黄色颗粒聚集。
免疫组织化学染色结果的图象分析每组随机选取3只大鼠行免疫组化切片，将切片置于10×10显微镜下观察各动物黑质阳性细胞，用Image-pro plus软件采集图象并分析，记录阳性细胞数，面积及平均灰度。
实验结果
1.本发明药物对模型大鼠旋转行为的影响对于单侧的黑质纹状体通路损毁模型，同侧的黑质-纹状体通路破坏，纹状体内的神经元失去多巴胺能神经的支配，其多巴胺受体处于一种超敏状态，当给予外源性的多巴胺受体激动剂如阿朴吗啡后，动物损伤侧的反应就强于健侧而无法保持平衡，并向健侧旋转，旋转的频率大致与黑质内的多巴胺能神经元的受损程度一致。本研究给药前、给药后2周及6周，分别对大鼠进行了旋转行为测定，为消除动物个体差异对实验结果的影响，我们对每只大鼠分别进行给药后自身旋转次数下降率的计算，对模型组与其它各组下降率(％)作t检验。实验发现模型组大鼠较对照组旋转圈数明显增高，本发明药物各剂量组都明显减少大鼠旋转次数，其中本发明药物1g/kg和2g/kg剂量组与模型组相比差异具显著性(表1)。
表1.本发明药物对6-OHDA大鼠旋转行为的影响组别只数用药前 用药2周 用药6周圈/40min 圈/40min 下降率％ 圈/40min 6周下降率％假手术组 10 0.0±0.0 0.0±0.0 /0.0±0.0 /模型组 10 96.2±88.190.4±102.5 25.2±36.9 87.5±132.6 27.6±30.3美多巴 10 136.9±92.0 111.7±94.0 29.1±24.9 67.8±82.867.5±30.9**本发明药物1g/kg 10 105.5±97.9 68.8±102.6 49.0±40.5 54.4±87.556.9±42.2*本发明药物2g/kg 10 122.3±71.6 79.8±49.237.2±38.1 54.8±42.154.9±26.2本发明药物4g/kg 9 138.1±68.6 101.0±70.5 33.4±29.4 80.1±74.850.3±30.5对下降率(％)作t检验，与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.012)本发明药物颗粒对模型大鼠皮层过氧化脂质的影响给药7周后，将大鼠断头处死，取脑皮层测定脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量。结果表明模型组大鼠与正常对照组相比，皮层MDA的含量明显升高，而本发明药物颗粒用药组则可显著降低MDA的水平(表2)。
表2本发明药物颗对6-OHDA大鼠脑皮层MDA的影响组别 N MDA(nmol/mg蛋白)假手术组 1868.9±13.4*模型组 1277.5±11.5本发明药物1g/kg 1077.7±6.7本发明药物4g/kg 1069.4±8.5*与模型组相比，*P＜0.053)本发明药物颗粒对模型大鼠脑纹状体多巴胺神经递质及其代谢产物含量的影响大鼠给药7周后，断头处死，取脑纹状体，用高效液相色谱仪测定单胺类神经递质及其代谢产物的含量。在此项检测指标中，我们采用的计算方法如下神经递质含量降低率＝(健侧神经递质含量-损毁侧含量)/健侧神经递质含量×100％。结果发现模型组大鼠损毁侧纹状体内多巴胺(DA)、多巴酸(DOPAC)及高香草酸(HVA)含量降低率比对照组明显加重。应用本发明药物颗粒后，可明显缩小损伤侧与未损伤侧神经递质含量的差异(请参阅图1、图2，表3)表3本发明药物颗粒对6-OHDA模型大鼠纹状体中多巴胺及其代谢产物含量降低率的影响组别 NDA降低率(％) DOPAC降低率(％)HVA降低率(％)假手术组 642.7±27.8**22.4±27.6**21.4±20.1**模型组 783.1±8.177.0±5.9 68.7±13.9美多巴50mg/kg868.0±17.5 61.3±13.9**59.2±14.5本发明药物1g/kg 669.6±13.2*62.7±12.6*56.0±3.7*本发明药物2g/kg 974.1±8.3*69.9±8.4*65.6±6.5本发明药物4g/kg 672.7±20.6 61.0±16.9*67.9±16.9神经递质含量降低率＝(健侧神经递质含量-损毁侧含量)/健侧神经递质含量×100％与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.014)本发明药物颗粒对模型大鼠黑质处酪胺酸羟化酶染色阳性细胞的影响在本项指标中，我们将每组动物左右侧黑质处酪胺酸羟化酶(TH)染色阳性的细胞数进行自身对比，计算损毁侧TH阳性细胞数及细胞面积的下降率，发现模型组大鼠损毁侧黑质处TH阳性细胞的下降率明显高于正常对照组，应用本发明药物颗粒可使降低的TH阳性细胞率明显回升(表4)表4，本发明药物颗粒对6-OHDA模型大鼠黑质处酪胺酸羟化酶染色阳性细胞的影响组别 N 阳性细胞数下降率％ 阳性细胞面积下降率％假手术 3 32.32±15.61**26.35±15.32**模型组 3 87.32±4.21 80.83±8.92美多巴50mg/kg 3 62.37±19.93**58.90±22.20**本发明药物1g/kg3 36.15±12.00**35.04±13.03**本发明药物2g/kg3 37.54±6.62**38.28±5.16**本发明药物4g/kg3 64.10±11.99**68.95±14.44**阳性细胞数下降率＝(健侧-损伤侧TH阳性细胞数)/健侧TH阳性细胞数×100％阳性细胞面积下降率＝(健侧-损伤侧TH阳性细胞面积)/健侧TH阳性细胞面积×100％与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01实验表明，本发明药物颗粒可以减少神经毒物6-羟多巴胺(6-OHDA)对黑质内多巴胺能神经元的损害，对其具有良好的保护作用，明显提升动物损毁纹状体内多巴胺及其代谢产物的含量。
本发明药物颗粒对药物性肌肉震颤模型小鼠的药理作用本实验例选用了两种药物性肌肉震颤模型槟榔碱震颤和氧合震颤素震颤。记录动物出现震颤的潜伏期及震颤持续的时间，以观察本发明药物颗粒对药物震颤行为的影响。
实验材料1、动物ICR小鼠，雄性，清洁级，体重18±2g。
2、试剂氧化震颤素(Oxotremorin)、槟榔碱(Arecoline)。
实验方法1、动物分组及给药情况小鼠随机分组，正常对照组小鼠在给予0.9％生理盐水单次腹腔注射(0.3ml/只)前，给予蒸馏水连续灌胃(0.3ml/只)3周；模型组小鼠给予槟榔碱(25mg/kg)或氧化震颤素(0.15mg/kg)单次腹腔注射前蒸馏水连续灌胃(0.3ml/只)3周；药物预实验后，我们对本发明药物组颗粒用药组小鼠造模前连续灌胃3周，本发明药物颗粒剂量分别为1g/kg、2g/kg、4g/kg；美多巴组(阳性对照药组)小鼠在造模前1天，美多巴65mg/kg灌胃。
2、槟榔碱肌肉震颤小鼠行为评价采用成年ICR小鼠，槟榔碱25mg/kg腹腔注射，记录每只小鼠自给予槟榔碱后至产生肉眼明显可见的肌肉震颤所需时间为震颤潜伏期，震颤产生后至消失所需时间为震颤持续时间。
3、氧化震颤素震颤小鼠行为评价采用成年ICR小鼠，氧化震颤素0.15mg/kg腹腔注射，记录每只小鼠自给予氧化震颤素后至产生肉眼明显可见的肌肉震颤所需时间为震颤潜伏期，震颤产生后至消失所需时间为震颤持续时间。
实验结果1、本发明药物颗粒对槟榔碱致小鼠震颤行为的影响结果表明模型组小鼠在给予槟榔碱腹腔注射后，出现明显的震颤、流涎、躁动不安等行为，其震颤持续的时间明显高于对照组。本发明药物颗粒给药组小鼠在腹腔注射槟榔碱后，震颤、流涎、躁动不安等症状较模型组减轻，震颤持续时间较模型组显著缩短(表5)。
表5本发明药物颗粒对槟榔碱致小鼠震颤时间的影响组别 N 持续时间(秒)对照组 15 0.0±0.0**模型组 15 430.5±55.1美多巴(65mg/kg) 15 397.3±39.3*本发明药物颗粒1g/kg 15 395.8±46.9*本发明药物颗粒2g/kg 15 370.6±37.9**本发明药物颗粒4g/kg 15 406.8±46.9与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.012、本发明药物颗粒对氧化震颤素致小鼠震颤行为的影响结果表明模型组小鼠在给予氧化震颤素腹腔注射后，出现明显的震颤行为，其震颤持续的时间明显高于对照组。本发明药物颗粒给药组小鼠在腹腔注射氧化震颤素后，震颤、流涎、躁动不安等症状较模型组减轻，震颤持续时间较模型组显著缩短(表6)。
表6本发明药物颗粒对氧化震颤素致小鼠震颤时间的影响组别 N 持续时间(秒)对照组 15 0.0±0.0**模型组 15 38.9±7.6美多巴(65mg/kg) 15 32.1±4.1**本发明药物颗粒1g/kg 15 39.5±3.9*本发明药物颗粒2g/kg 15 34.4±5.9*本发明药物颗粒4g/kg 15 32.8±6.4*与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01帕金森病人最直观的临床表现是肌肉震颤、僵直及运动不能。槟榔碱和氧化震颤素均为M受体激动剂，可以引起肌肉的剧烈收缩，能够模拟该病的震颤表现，故本模型也是评价抗帕金病药效的一种必要动物模型。本发明药物能够显著缩短动物震颤持续时间。
本发明药物颗粒对MPTP致PD样模型小鼠的药理作用实验材料1、动物C57BL小鼠，雌、雄各半，清洁级，体重18±2g。
2、试剂及仪器1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)。
仪器CS-2型小鼠自主活动程序仪。
实验方法1、MPTP致帕金森病小鼠模型的建立MPTP直接溶于0.9％无菌生理盐水中，调节其终浓度为2mg/ml。模型组动物连续腹腔注射MPTP20mg/kg，共造模8天。
2、分组及给药C57BL小鼠随机分组。正常对照组蒸馏水灌胃3周后，腹腔注射与模型组等剂量的生理盐水8天。模型组蒸馏水灌胃3周后，MPTP20mg/kg连续腹腔注射，共造模8天。本发明药物颗粒用药组在给予本发明药物颗粒3周后，腹腔注射MPTP20mg/kg，共造模8天。本发明药物颗粒在给予3周后，腹腔注射MPTP20mg/kg，共造模8天。本发明药物颗粒的剂量分别为1g/kg、2g/kg、4g/kg；美多巴组(阳性对照药组)为造模当天开始给予美多巴65mg/kg。
3、小鼠爬杆实验参照Nobutaka Arai；Kazuaki Misugi的实验方法略加修改，具体测定方法如下实验用具为自制不锈钢杆长0.5米，直径1cm(其上用胶布缠绕)顶端为一直径2.5cm的木制圆球，动物给予MPTP前一天，先进行爬杆训练，引导动物10秒内由杆顶爬至杆底，每只训练4次。正式测定时，首先测定应用MPTP前小鼠的爬杆时间，在给予MPTP后1-2小时内，对动物进行第二次爬杆时间的测定。具体测定方法如下持小鼠尾部，将其头向下置于杆顶部(以小鼠后肢置于球上为准)，让其自然爬下，记录小鼠自站于杆顶至双前肢接触杆底平台所需时间。测定时限120秒，鼠不能持杆，完全自然下滑者，记录其爬杆时间为120秒。计算各组小鼠给予MPTP前后爬杆时间的差值(给予MPTP后爬杆时间短于未处理时，其数据记录为0)。连续测定造模8天内各组小鼠处理前后爬杆时间差值。
4、小鼠自发活动记数测定参照李斌等报告的方法，应用中国医学科学院药物研究后研制的CS-2型小鼠自主活动程序仪测定小鼠自发活动次数，当计算机进入测定程序后，将小鼠放入活动箱中(高13cm，直径25cm)，每次同时测定4只小鼠，每个活动箱中一只，由计算机自动记录小鼠活动情况，测定每只鼠5分钟内的活动次数，进行统计学处理。
5、高效液相色谱法对脑组织单胺类神经递质及其代谢产物的测定标准品配制各标准品都溶于流动相中，浓度为0.1mg/ml，使用时，分别稀释到10ng/ml，进样量10μl。
色谱条件Waters公司碳十八反相色谱柱，洗脱液80mM磷酸氢二钠，60mM柠檬酸，0.22mM乙二胺四乙酸二钠，0.5mM octyl sulfate sodium salt，20％甲醇。调pH为4.3，经过滤脱气后使用，流量1.0ml/min。电化学检测工作电压0.7v，测定温度37℃。标准品在浓度和峰面积间有良好的线性关系，r2＞0.99。
样品预处理参照张林魁等人的方法进行样品的预处理按照1∶20(w/v)的比例向纹状体内加入0.1M高氯酸(每100ml含L-半胱氨酸5mg，内标DHBA浓度为200ng/ml)制备匀浆，置高速冷冻离心机12000转4℃离心20分钟。取上清10μl测定其中的多巴胺及其代谢产物的含量。
实验结果1、本发明药物颗粒对小鼠爬杆时间的影响爬杆时间反映了动物的协调运动能力。协调性好则动物爬杆时间所需时间短，协调性差，则爬杆时间长。结果发现模型组小鼠爬杆时间与正常对照组相比显著延长，本发明药物颗粒用药组小鼠爬杆时间明显缩短(表7)。
表7本发明药物颗粒对小鼠爬杆时间的影响组别N 造模后时间-造模前时间(秒)对照组 140.32±0.69**模型组 159.19±5.09美多巴(65mg/kg) 157.09±3.20*本发明药物颗粒1g/kg 135.67±3.18**本发明药物颗粒2g/kg 156.70±3.68*本发明药物颗粒4g/kg 145.45±2.64*与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.012、本发明药物颗粒对小鼠自主活动的影响自主活动数反映了动物的随意运动能力。模型组小鼠与正常对照组相比，自主活动明显减少。本发明药物颗粒用药组小鼠自主活动较模型组显著增加(表8)。
表8本发明药物颗粒对小鼠自主活动的影响组别 N 造模后时间-造模前时间(秒)对照 14 38.6±33.0**模型 15 12.2±9.2美多巴(65mg/kg) 15 70.0±34.7**本发明药物颗粒1g/kg 13 18.7±8.4*本发明药物颗粒2g/kg 15 18.9±11.9*本发明药物颗粒吨/kg 14 20.7±13.2*与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.013、本发明药物颗粒对MPTP模型小鼠脑纹状体中多巴胺及其代谢产物含量的影响小鼠造模后14天，断头处死，取脑纹状体用HPLC电化学检测器测定单胺类神经递质及其代谢产物的含量。结果显示模型组小鼠脑纹状体内多巴胺(DA)、多巴酸(DOPAC)及高香草酸(HVA)的含量较对照组都明显降低，差异具显著性。各剂量本发明药物颗粒都能不同程度的提高模型动物脑纹状体内多巴胺的含量(表9)。
表9.本发明药物颗粒对MPTP模型小鼠纹状体多巴胺及其代谢产物含量的影响(ng/mg纹状体重)组别 N DA DOPACHVA对照 10 7.02±2.54**6.17±1.99**2.91±0.57**模型 10 2.08±1.24 2.76±2.24 2.07±0.66美多巴(65mg/kg) 10 3.54±1.91*4.11±2.43 3.17±1.60*本发明药物颗粒1g/kg 10 2.82±1.12 4.55±1.88*2.50±0.82本发明药物颗粒2g/kg 10 3.60±1.83*5.37±1.78**2.76±0.90*本发明药物颗粒4g/kg 10 4.43±2.32**3.74±1.18 2.30±0.53与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01结论1、对于单侧黑质纹状体通路损毁致帕金森病(PD)大鼠模型，本发明药物颗粒对模型鼠的异常旋转行为有明显的改善作用，它还能够抑制模型鼠大脑皮层脂质过氧化产物的增多，增加黑质处酪胺酸羟化酶染色阳性神经元数目，提升大鼠脑纹状体内多巴胺及其代谢产物的含量。
2、对于槟榔碱及氧化震颤素所致的肌肉震颤小鼠模型，本发明药物颗粒能明显减少震颤持续时间。
3、对于MPTP腹腔注射PD小鼠模型，本发明药物颗粒能明显增强小鼠运动协调性，缩短其爬杆时间，增强小鼠自主活动能力，提升小鼠脑纹状体内多巴胺及其代谢产物的含量。
本发明药物的颗粒剂制备本发明药物由下列重量配比的原料药制成白芍11.97、钩藤11.97、天麻7.17、蒺藜12.13、石决明11.97、制何首乌8.62、珍珠母11.97、牡蛎11.97、丹参8.62、炙甘草3.61。
它包括下列步骤a)将钩藤、天麻、制何首乌、丹参加4倍量70％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小时，合并乙醇提取液、过滤；b)滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.12，温度为60℃备用；c)药渣与白芍、天麻、蒺藜、石决明、珍珠母、牡蛎、炙甘草加8倍量的水，煎煮2次，每次1.5小时，水煎液滤过，合并两次滤液及醇提浓缩液，浓缩至相对密度为1.15～1.17，温度为60℃；d)加入适量的糊精及阿斯帕坦3g，喷雾干燥后制成本发明药物的颗粒剂，经过筛、整粒、分装。
本发明药物的胶囊剂制备本发明药物由下列重量配比的原料药制成白芍11.97、钩藤11.97、天麻7.17、蒺藜12.13、石决明11.97、制何首乌8.62、珍珠母11.97、牡蛎11.97、丹参8.62、炙甘草3.61。
它包括下列步骤a)将钩藤、天麻、制何首乌、丹参加4倍量70％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小时，合并乙醇提取液、过滤；
b)滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.12，温度为60℃备用；c)药渣与白芍、天麻、蒺藜、石决明、珍珠母、牡蛎、炙甘草加8倍量的水，煎煮2次，每次1.5小时，水煎液滤过，合并两次滤液及醇提浓缩液，浓缩至相对密度为1.15～1.17，温度为60℃；d)加入适量的辅料，制粒，干燥，分装入明胶硬胶囊，即得到本发明药物的胶囊剂。
本发明药物的片剂制备该治病帕金森病的药物由下列重量配比的原料药制成白芍11.97、钩藤11.97、天麻7.17、蒺藜12.13、石决明11.97、制何首乌8.62、珍珠母11.97、牡蛎11.97、丹参8.62、炙甘草3.61。
它包括下列步骤a)将钩藤、天麻、制何首乌、丹参加4倍量70％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小时，合并乙醇提取液、过滤；b)滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.12，温度为60℃备用；c)药渣与白芍、天麻、蒺藜、石决明、珍珠母、牡蛎、炙甘草加8倍量的水，煎煮2次，每次1.5小时，水煎液滤过，合并两次滤液及醇提浓缩液，浓缩至相对密度为1.15～1.17，温度为60℃；d)加入适量的辅料，制粒，干燥，压制成片，分装，即得到本发明药物的片剂。
以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，凡依本发明专利要求范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明专利权利要求的涵盖范围。
权利要求
1.一种治疗帕金森病及帕金森综合症的药物，其特征在于它由下列重量配比的原料制成的药剂白 芍 73.73～2.99 钩 藤 73.73～2.99 天麻 44.16～1.79蒺 藜 74.72～3.03 石决明 73.73～2.99 制何首乌 53.09～2.15珍珠母 73.73～2.99 牡 蛎 73.73～2.99 丹参 53.09～2.15炙甘草 22.23～0.90。
2.根据权利要求1所述的治疗帕金森病及帕金森综合症的药物，其中各原料的重量配比是白 芍 47.88～2.99 钩 藤 47.88～2.99 天麻 28.68～1.79蒺 藜 48.52～3.03 石决明 47.88～2.99 制何首乌 34.48～2.15珍珠母 47.88～2.99 牡 蛎 47.88～2.99 丹参 34.48～2.15炙甘草 14.44～0.90。
3.根据权利要求1所述的治疗帕金森病及帕金森综合症的药物，其中各原料的重量配比是白 芍 11.97钩 藤 11.97天麻 7.17蒺 藜 12.13石决明 11.97制何首乌 8.62珍珠母 11.97牡 蛎 11.97丹参 8.62炙甘草 3.61。
4.根据权利要求1所述的治疗帕金森病及帕金森综合症药物的制备方法，其特征在于，它包括下列步骤a)将钩藤、天麻、制何首乌、丹参加10～90％的乙醇，回流提取多次，每次0.5～3.0小时，合并乙醇提取液、过滤；b)滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.0～1.3，备用；c)药渣与白芍、蒺藜、石决明、珍珠母、牡蛎、炙甘草加水煎煮多次，每次0.5～3.0小时，水煎液滤过，合并滤液及醇提浓缩液，浓缩至相对密度为1.1～1.4；d)加入适量的辅料，制成药剂。
5.根据权利要求4所述的治疗帕金森病及帕金森综合症药物的制备方法，其特征在于辅料是糊精、阿斯帕坦。
全文摘要
本发明公开了一种有效治疗帕金森病及帕金森综合症的药物及其制备方法，它是以白芍、钩藤、天麻、蒺藜、石决明、制何首乌、珍珠母、牡蛎、丹参、炙甘草为原料，通过下述步骤制备a)将钩藤、天麻、制何首乌、丹参加10～90％的乙醇，回流提取多次，合并乙醇提取液、过滤；b)滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.0～13；c)药渣与白芍、蒺藜、石决明、珍珠母、牡蛎、炙甘草加水煎煮多次，水煎液滤过，合并滤液及醇提浓缩液，浓缩至相对密度为1.1～1.4；d)加入适量的辅料，制成药剂。本发明配方及制作方法独特，治疗效果显著。
文档编号A61P25/00GK1739743SQ20051003279
公开日2006年3月1日 申请日期2005年1月19日 优先权日2005年1月19日
发明者王永炎, 袁锐光, 龙超峰, 谢称石, 陈木洲 申请人:广东众生药业股份有限公司