专利名称：骨髓来源的间质干细胞用于制备治疗肝纤维化的制剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于干细胞与组织工程领域，涉及间质干细胞的新用途，尤其是涉及骨髓来源的间质干细胞用于制备治疗肝纤维化的制剂的用途。
背景技术：
肝纤维化是一组常见的临床综合症，从病理生理学角度看，是对诸多类型肝脏慢性损伤的修复反应，具体表现为细胞外基质的异常增多和过度沉积、进行性炎症活动、直至肝硬化、肝细胞癌和肝功能衰竭。
到目前为止，肝纤维化的病因和发病机制仍然不十分清楚，临床缺乏特异有效的治疗方法，预后不良。但较为公认的观点是各种致肝损伤因子持续造成肝细胞损伤坏死，激活肝脏各种细胞产生细胞外基质，而后者反过来影响细胞的发生、分化、增殖、黏附和表型的表达，这种相互作用又有多种细胞因子介导，形成了非常复杂的病理过程，涉及不同水平的调节，其中肝脏星状细胞的活化和增殖是肝纤维化形成发展的最为重要环节。所以，促进肝脏星状细胞的凋亡、减少细胞外基质的形成是当前减缓或逆转肝纤维化进程的重要战略对策。主要表现在以下几方面1、基因治疗利用外源基因如肝细胞生长因子基因、转化生长因子β受体基因等导入体内，试图增加这些基因在体内的表达，促进肝脏上皮细胞的增生，促进肝脏星状细胞的凋亡、减少细胞外基质的形成，改善肝脏功能，减缓或逆转肝纤维化。但由于外源基因的导入效率不高、维持时间短，需要长期用药维持，而且外源基因的导入有增加致畸致瘤的危险。
2、细胞因子及信号转导分子治疗利用干扰素、白细胞介素及肝脏星状细胞的活化途径中的信号分子抑制剂等，抑制肝脏星状细胞的活化增殖，减少胶原的形成。但这些蛋白分子缺乏特异性，全身应用药后它们的双刃剑样作用存在着难以克服的副作用。
3、细胞治疗利用携带靶基因的肝脏细胞通过门静脉植入肝脏，具有一定的作用。但毕竟是增加了外源基因的风险性。胎肝细胞静脉输注也具有一定的治疗作用，但细胞来源的限制及社会伦理的问题均影响本疗法的开展。骨髓来源的造血干细胞输注近年来开始受到关注，但由于细胞体外扩增有限、体内治疗后存活时间短，且需要细胞输注前射线清髓处理，这在某种程度上影响了肝纤维化治疗。
显然，在现有条件下，对肝纤维化治疗作用的有关技术和方法均存在种种缺陷和不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种骨髓来源的间质干细胞用于制备治疗肝纤维化的制剂的用途。
所述的制剂由骨髓来源的间质干细胞与生理盐水配制而成，用于肝纤维化的大鼠模型进行外周静脉输注的有效剂量为2.5×106细胞/次/1000g体重。该有效剂量是通过动物模型实验取得治疗效果而确定的。
所述的骨髓来源的间质干细胞是按以下方法制备的利用无菌术分离大鼠骨髓有核细胞，接种在含胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近融合时，进行消化、传代，依此法反复传代，达到纯化和扩增间质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。
所述的制剂由骨髓来源的间质干细胞与生理盐水配制而成，用于肝纤维化的病人进行外周静脉输注的有效剂量为2～5.0×106细胞/次/1000g体重。该有效剂量是通过动物模型实验取得治疗效果以及人体用药常识而确定的。
所述的骨髓来源的间质干细胞是按以下方法制备的利用无菌术分离人骨髓有核细胞，接种在含胎牛血清或人血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近融合时，进行消化、传代，依此法反复传代，达到纯化和扩增间质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。
将本发明所述的骨髓来源的间质干细胞制备的制剂用于治疗肝纤维化的效果评价
(1)一般情况精神状态和活动状态、进食和大小便情况。
(2)肝功能与血清肝纤维化指数。
(3)肝脏羟脯氨酸含量。
(4)肝脏病理组织结构与形态。
(5)肝脏免疫组织化学。
(6)肝脏组织供体来源雄性细胞检测用PCR法。
上述利用本发明所述的骨髓来源的间质干细胞制备的制剂静脉输注大鼠肝纤维化模型的实验证明，该制剂能够阻滞和逆转肝纤维化的发展，改善全身状态和肝功能状态，促进肝脏病理恢复。
本发明将骨髓来源的间质干细胞制备的制剂通过静脉输注给肝纤维化患者，可以改善全身状态和肝功能状态，促进肝脏病理恢复，减少胶原纤维的产生和假小叶的形成，降低死亡率，达到阻滞和逆转肝纤维化发展的目的，为临床治疗肝纤维化开辟细胞治疗的新途径。
本发明的优点在于(1)为临床治疗肝纤维化开辟细胞疗法的新途径。
(2)本发明所利用的骨髓来源的间质干细胞，制备简便，连续培养及冻存复苏后仍具有多向分化潜能，细胞同质性高，具有正常的核型和端粒酶活性。
(3)本发明利用骨髓来源的间质干细胞制备的制剂静脉输注技术方案简便、易操作。
图1为HE染色和VG染色的肝脏组织切片图，其中，a1为正常肝脏组织图，a2为CCl4诱导6周的肝脏组织(HE染色)图，b1为CCl4诱导6周后MSC治疗4周的肝脏组织(HE染色)图，b2为生理盐水对照组的肝脏组织(H E染色)图，c1为CCl4诱导6周后MSC治疗4周的肝脏组织(HE染色)图，c2为生理盐水对照组的肝脏组织(MASSON染色)图，d1为DMN诱导10天后开始MSC治疗组的肝脏组织图，d2为生理盐水对照组的肝脏组织(MASSON染色)图。
图2为二羟基亚硝胺(DMN)诱导模型组MSC制备的制剂治疗后的生存分析图，其中，A组(DMN20/MSC)是DMN诱导的第20天加MSC治疗组，B组(DMN 10/MSC)是DMN诱导的第10天加MSC治疗组，C组(DMN/Saline)是DMN诱导的第10天加生理盐水替代MSC的对照组，D组(Saline/Saline)是空白对照组。
图3为PCR检测受体肝脏存在雄性供体骨髓来源的间质干细胞的SRY片段(104bp)和内参对照β-actin片段(216bp)，图中，1，DNA Marker；2，CCl4诱导模型治疗大鼠；3，CCl4诱导模型对照大鼠4，DMN诱导模型对照大鼠；5，DMN诱导模型第10天治疗大鼠；6，DMN诱导模型第20天治疗大鼠7，正常雄性Wista r大鼠；8，正常雌性Wistar大鼠。
具体实施例方式
实施例一骨髓来源的间质干细胞(MSC)的制备利用无菌术分离大鼠骨髓有核细胞，接种在含8％胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，视生长情况隔天换液1次，细胞贴壁增殖接近融合至细胞成90％融合态时，进行消化、传代，依此法反复传代，达到纯化和扩增间质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。
所述的低糖DMEM培养基选用HYCLONE公司的CAT NO.SH30002.01产品，或者GIBCO公司的同类产品。
实施例二骨髓来源的间质干细胞(MSC)的制备利用无菌术分离大鼠骨髓有核细胞，接种在含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，视生长情况3天换液1次，细胞贴壁增殖接近融合至细胞成80％融合态时，进行消化、传代，依此法反复传代，达到纯化和扩增间质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。
所述的低糖DMEM培养基选用HYCLONE公司的CAT NO.SH30002.01产品，或者GIBCO公司的同类产品。
实施例三骨髓来源的间质干细胞(MSC)的制备
利用无菌术分离大鼠骨髓有核细胞，接种在含15％胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，视生长情况4天换液1次，细胞贴壁增殖接近融合至细胞成70％融合态，进行消化、传代，依此法反复传代，达到纯化和扩增间质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。
所述的低糖DMEM培养基选用HYCLONE公司的CAT NO.SH30002.01产品，或者GIBCO公司的同类产品。
实施例四肝纤维化大鼠造模四氯化碳(CCl4)诱导模型雌性Wistar大鼠，140-160g，按剂量40％CCl4(橄榄油溶解)0.5ml/100g大鼠体重，腹腔注射，每周2次，至6周造模成功。
二羟基亚硝胺(DMN)模型雌性Wistar大鼠，140-160g，按剂量DMN1mg/100g大鼠体重，每周连续3天，每天1次，至3周造模成功并维持7周。
实施例五骨髓来源的间质干细胞(MSC)制备的制剂的输注实验动物雌性Wistar大鼠的四氯化碳(CCl4)诱导模型、二羟基亚硝胺(DMN)模型剂量2.5×106细胞/次/1000g体重，共1次。
途径外周静脉治疗时机CCl4诱导模型为6周造模成功后开始使用MSC制备的制剂。
DMN诱导模型分为诱导10天开始使用MSC制备的制剂组和诱导20天开始使用MSC制备的制剂组。
对照组用生理盐水代替。
效果评价1、一般情况CCl4诱导模型治疗组精神状态好转，体重逐日增加，进食量增大，无死亡发生，对照组则有1例死亡。DMN诱导模型第10天治疗组总体效果好于第20天治疗组，生存率分别为80％和60％，而对照组则为10％。如图2所示，DMN诱导模型因肝损伤引起纤维化，使用MSC治疗，能提高大鼠的生存率，越早期使用，生存时间越长。
2、血常规每周1次追踪血象变化，白细胞变化不大，血红蛋白与血小板在治疗6周后接近正常。对照组白细胞变化不大，血红蛋白与血小板持续减少。
3、肝功能与血清肝纤维化指数每2周1次检测，治疗组肝功能在治疗2周后接近正常，血清肝纤维化指数在治疗6周后接近正常。治疗组肝功能、血清肝纤维化指数和肝脏羟脯氨酸含量接近正常。对照组肝功能与血清肝纤维化指数均未能恢复。
4、肝脏病理治疗组肝病理结构显示肝细胞变性减轻，胶原纤维沉积减少，肝小叶结构趋于正常。对照组存活的大鼠肝脏病理结构显示肝细胞严重变性坏死，肝小叶结构紊乱，纤维增生明显，免疫组化显示肝星状细胞α-SMA表达增多。如图1所示。图1为HE染色和VG染色的肝脏组织切片。诱导后的肝组织正常肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，纤维组织在全小叶多处弥漫性增生，假小叶形成。而经过MSC治疗的肝组织结构紊乱减轻，胶原纤维组织减少。用图像分析扫描MASSON染色切片，结果显示MSC治疗4周后的胶原面积减少60％。
5、骨髓来源的间质干细胞(MSC)植入肝脏证据雄性供体大鼠Y染色体特异性基因在雌性大鼠肝脏细胞表达利用肝细胞DNA进行PCR检测，证实雄性供体骨髓来源的间质干细胞植入雌性肝脏。如图3所示，使用CCl4诱导模型治疗大鼠(电泳第2道)，以及使用DMN诱导模型10天、20天治疗大鼠(电泳第5、6道)，均在肝脏内看到供体MSC在受体内的表达。
权利要求
1.骨髓来源的间质干细胞用于制备治疗肝纤维化的制剂的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制剂由骨髓来源的间质干细胞与生理盐水配制而成，用于肝纤维化的大鼠模型进行外周静脉输注的有效剂量为2.5×106细胞/次/1000g体重。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的骨髓来源的间质干细胞是按以下方法制备的利用无菌术分离大鼠骨髓有核细胞，接种在含胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近融合时，进行消化、传代，依此法反复传代，达到纯化和扩增间质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制剂由骨髓来源的间质干细胞与生理盐水配制而成，用于肝纤维化的病人进行外周静脉输注的有效剂量为2～5.0×106细胞/次/1000g体重。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的骨髓来源的间质干细胞是按以下方法制备的利用无菌术分离人骨髓有核细胞，接种在含胎牛血清或人血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近融合时，进行消化、传代，依此法反复传代，达到纯化和扩增间质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。
全文摘要
本发明属于干细胞与组织工程领域，涉及骨髓来源的间质干细胞用于制备治疗肝纤维化的制剂的用途。所述的制剂由骨髓来源的间质干细胞与生理盐水配制而成，用于肝纤维化的大鼠模型进行外周静脉输注的有效剂量为2.5×10
文档编号A61P1/16GK1803192SQ20051003273
公开日2006年7月19日 申请日期2005年1月13日 优先权日2005年1月13日
发明者项鹏, 李树浓, 赵东长 申请人:中山大学