反义寡核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明的实施方案一般性地涉及用于治疗肌肉萎缩症，特别是杜兴氏肌营养不良(DMD)的反义化合物和组合物。在一个实施方案中，本发明涉及反义寡核苷酸分子、包含所述反义寡核苷酸分子的药物组合物和制剂，以及治疗肌肉萎缩症相关疾病和病症的方法，其中所述反义寡核苷酸分子包含选自SEQ?ID?NO：5-8、10、12、14、16、24、27、28、34、35、37、40、42、44-46、79、97、100、101和116及其组合的碱基序列。
【专利说明】反义寡核苷酸[0001 ] 联邦政府资助的研究或开发
[0002]本发明是在由美国国立卫生研究院国家神经病症和中风研究院(NationalInstitute Of Neurological Disorders And Stroke of the National Institutes ofHealth) (NIH/NINDS)授予的基金N0.U01NS062709下由美国政府支持而进行的。美国政府在本发明中具有一定的权利。
[0003]发明背景
[0004]杜兴氏肌营养不良(DMD)是肌营养不良症的最常见和最严重的形式。每3500个新生男孩中有I个受DMD影响，其是由人DMD基因的无义突变和异读框突变(out of framemutation)引起的严重x连锁肌萎缩疾病。DMD患者到10至12岁时通常需要轮椅并且在其少年晚期至30岁出头死亡。
[0005]DMD是由阻碍功能性蛋白质合成的肌营养不良蛋白基因的突变引起的。肌营养不良蛋白基因是人基因组中最大的基因之一，其包含79个外显子，覆盖超过230万个碱基对。一般而言，通过除去整个外显子或复制一个或多个外显子，或引入终止密码子引起阅读框的改变的肌营养不良蛋白基因的任何外显子部分中的突变具有破坏功能性肌营养不良蛋白的产生的潜能，这可导致DMD。
[0006]近年来，研究已显示基于反义寡核苷酸(AO)的疗法可提供对遗传相关疾病(包括DMD)的有前景的治疗。具体地，已开发了显示对靶向基因表达的特异性的反义寡核苷酸(AO)。例如，已显示反义寡核苷酸诱导特异性外显子跳读，从而恢复阅读框和功能性肌营养不良蛋白的表达。通过跳读肌营养不良蛋白基因的异读框突变，阅读框可被恢复并且表达截短的但具有功能的Becker-样肌营养不良蛋白。
[0007]人细胞的体外研究和疾病动物模型的体内研究已证明外显子跳读原理作为DMD的潜在疗法。最近已进行了使用两种不同的AO化学药品(磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)和硫代磷酸酯-连接的2’ β.-甲基RNA (2’ OMePS))的初步临床试验，取得了令人鼓舞的结果。Deutekom等人已报导了肌营养不良蛋白的表达在注射了针对外显子51的2’OMePSAO的4名DMD患者的TA肌肉的恢复。
[0008]确定特定外显子的靶向去除对恢复肌营养不良蛋白阅读框的作用的一个至关重要的因素是特定反义寡核苷酸的鉴定。由于反义寡核苷酸通常具有仅有20-30个核苷酸的序列，对于靶向每一个外显子肌营养不良蛋白外显子，可有上百个或更多个潜在的候选Α0。实际上，许多反义寡核苷酸不产生高效的外显子跳读。因此，为了有效地除去外显子以恢复肌营养不良蛋白阅读框来治疗DMD，需要对靶向每一个人肌营养不良蛋白外显子的反义寡核苷酸进行筛选和选择。然而，还没有规则来应用以选择最有效的靶向单个外显子的Α0。此外，所有先前的技术都鉴定仅在细胞培养物中显示外显子跳读效应的Α0，这与DMD患者中肌纤维的最终靶向细胞极不相同。在细胞培养中选择的单个AO的生物学作用可与在体内肌肉中的潜在作用显著不同。
[0009]因此，仍然存在对改进的反义寡核苷酸的需要，其引起肌营养不良蛋白基因的靶向外显子中的高效外显子跳读。[0010]发明概述
[0011]本发明的实施方案一般性地涉及用于治疗肌肉萎缩症，特别是杜兴氏肌营养不良(DMD)的反义化合物和组合物。
[0012]在一个实施方案中，本发明涉及反义寡核苷酸分子、包含反义寡核苷酸分子的药物组合物和制剂以及用于治疗肌肉萎缩症相关疾病和病症的方法，其中反义寡核苷酸分子包含选自如下序列及其类似物和组合的碱基序列:
【权利要求】
1.一种用于治疗DMD的反义寡核苷酸分子，所述反义寡核苷酸分子包含选自下组的碱基序列及其类似物和组合:
GCTGGGAGAGAGCTTCCTGTAGCTTCAC(SEQ ID NO:5);
TGTTACCTACCCTTGTCGGTCCTTGTAC(SEQ ID NO:6);
CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC(SEQ ID NO:7);
GGCGTTGCACTTTGCAATGCTGCTGTCT(SEQ ID NO:8);
TTGGAAATCAAGCTGGGAGAGAGCTTCC(SEQ ID NO:9)；
CTACCCTTGTCGGTCCTTGTACATTTTG(SEQ ID NO:12);
GTCAATCCGACCTGAGCTTTGTTGTAGA(SEQ ID NO:14);
CTTGCTATGAATAATGTCAATCCGACC(SEQ ID NO:16);
TATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC(SEQ ID NO:24);
GCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO:27);
CCAATGCCATCCTGGAGTTCCT(SEQ ID NO:28);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGA(SEQ ID NO:34);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCC(SEQ ID NO:35);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT(SEQ ID NO:37);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG(SEQ ID NO:40);
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG(SEQ ID NO:42);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG(SEQ ID NO:44)；
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTA(SEQ ID NO:45);
GCTGCCCAATGCCATCCT GGAGTTCCTG(SEQ ID NO:46)
AACUUCCUCUUUAACAGAAAAGCAUAC(SEQ ID NO:79);
GGGAUCCAGUAUACUUACAGGCUCC(SEQ ID NO:97);
CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCT(SEQ ID NO:100)；
CATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGT(SEQ ID NO:101);和
CAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAG(SEQ ID NO:116) 并且其中所述分子可结合靶位点以引起肌营养不良蛋白基因的外显子的外显子跳读。
2.权利要求1的反义寡核苷酸分子，其中在其处引起外显子跳读的肌营养不良蛋白基因的外显子选自外显子43、45、50、51和53。
3.权利要求1的反义寡核苷酸分子，其中将所述反义寡核苷酸分子与不同的化学实体缀合或复合。
4.权利要求1的反义寡核苷酸分子，其中所述反义寡核苷酸分子是磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)。
5.权利要求1的反义寡核苷酸分子，其中所述反义寡核苷酸分子是能够结合其互补RNA序列的寡聚物。
6.权利要求1的反义寡核苷酸分子，其中所述反义寡核苷酸分子在其任一末端包含I至2个额外的核苷酸碱基，或在序列的末端缺失I至2个核苷酸碱基，并且其中所述I至2个核苷酸碱基可与其靶序列互补和/或不与其靶序列互补。
7.一种用于治疗DMD的药物组合物，所述组合物包含根据权利要求1的反义寡核苷酸分子和药学上可接受的载体、佐剂或媒介物。
8.—种药物组合物，其包含与聚合物缀合以增强反义寡核苷酸的递送和反义作用的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸选自:
9.权利要求8的组合物，其中所述反义寡核苷酸包含具有约15至40个碱基配对单元(单体)的吗啉代寡聚物或PNA寡聚物。
10.权利要求8的组合物，其中所述吗啉代寡聚物包括二硫代磷酸酯-连接的吗啉代寡聚物。
11.权利要求8的组合物，其中所述聚合物是肽。
12.权利要求8的组合物，其中所述聚合物是阳离子聚合物。
13.权利要求8的组合物，其中所述聚合物是树状八胍聚合物。
14.一种治疗受试者的肌肉萎缩症的方法，包括向所述受试者施用有效量的反义寡核苷酸分子，所述反义寡核苷酸分子选自:
GCTGGGAGAGAGCTTCCTGTAGCTTCAC(SEQ ID NO:5);
TGTTACCTACCCTTGTCGGTCCTTGTAC(SEQ ID NO:6);
15.权利要求14的方法，其中所述肌肉萎缩症是杜兴氏肌肉萎缩症(DMD)。
16.权利要求14的方法，其中所述肌肉萎缩症是贝克肌肉萎缩症(BMD)。
17.权利要求14的方法，其中所述序列选自SEQID NO:5、6、7、8、10、12、14、16和24并且所述外显子是外显子43。
18.权利要求14的方法，其中所述序列选自SEQID NO:27、28、34、35、37、40、42、44、45和46并且所述外显子是外显子45。
19.权利要求14的方法，其中所述序列选自SEQID NO:79和97，并且所述外显子是外显子50。
20.权利要求14的方法，其中所述序列选自SEQID NO:100和101，并且所述外显子是外显子51。
21.权利要求14的方法，其中所述序列是SEQID N0.116并且所述外显子是外显子53。
【文档编号】A61P21/00GK103501793SQ201280015038
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年2月8日 优先权日:2011年2月8日
【发明者】陆其龙 申请人:夏洛特-梅克伦堡医院(商业用名:卡罗来纳保健系统)