葡萄糖依赖性促胰岛素多肽类似物、其药物组合物及应用的制作方法【专利摘要】本发明提供了一种源自GIP（1-29，SEQ?ID?NO:1）的GIP类似物，其中GIP类似物具有GLP-1的激动活性和GIPR激动活性，并包含如下述通式I所示的氨基酸序列：Tyr-A2-A3-Gly-Thr-Phe-A7-Ser-Asp-Tyr-Ser-A12-A13-A14-A15-Lys-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-Trp-Lue-A27-A28-A29-Y。本发明还提供了包括GIP类似物的药物组合物及其应用。【专利说明】葡萄糖依赖性促胰岛素多肽类似物、其药物组合物及应用[0001]交叉引用[0002]本申请要求2011年6月10日提交的中国申请号:201110156296.2的权益。【
背景技术：
】[0003]2型糖尿病，T2D，是一种慢性代谢失调疾病。其主要特征为肝糖输出增加，胰腺^细胞功能缺陷，胰岛素分泌不足和胰岛素抑制，最终发展为持续的高血糖症状(Green等人,CurrentPharmaceuticalDesign,2004，10)。T2D也是导致肾衰竭、失明和截肢的主要原因，同时也与全球由心血管所导致的高死亡风险密切相关。而且，随着肥胖症的快速增加，据信将使T2D更加流行，而这一现象在发展中国家尤为突出。虽然有很多抗糖尿病的治疗已经通过了FDA(美国食品和药品管理局)的审批，仍然需要新的治疗手段来更好达到对血糖和体重的控制。[0004]1929年LaBarre提出了肠促胰素的概念(肠分泌胰岛素)。这一概念在多年以后开启了一种独特的治疗糖尿病的方法。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)是迄今在人体内发现的两种活性最强的肠促胰素。在过去的30年里，对这两种多妝进行了广泛的研究(Baggio和Drucker,Gastroenterology,2007,132,2131-2157)。GLP-1和GIP分别由小肠内皮的L细胞和K细胞分泌。GLP-1是一种含有30或31个氨基酸的多肽。其是由其前体前胰高血糖素原通过翻译后基因修饰产生的(Orskov等人，Endocrinology,1986，119，1467-1475)。同时，GIP是以42个氨基酸多肽的形式分泌，与GLP-1相比有大约68%的序列同源性(Gallwitz等人，RegulatoryPeptides,1996,63,17-22)。[0005]GLP-1和GIP都是通过与其特异性受体结合来产生相应的生理作用。其分别与GLP-1受体(GLP-1R)和GIP受体(GIPR)结合。这两种受体都属于G蛋白偶联受体家族(Seino等人，JournalofDiabetesInvestigation,2010，1，8-23)。GLP-1和GIP都能够在营养物质被吸收后，`以葡萄糖依赖的方式促进胰岛素的分泌。与其他的传统糖尿病治疗方法相比，例如注射胰岛素，口服磺酰脲和二甲双胍等等，这种葡萄糖依赖的作用方式会最大限度地减少发生低血糖的可能性。此外，这两种多肽可以促进胰岛素的生物合成，提高胰腺P细胞的增殖和抑制P细胞的凋亡，因此其能够潜在地保护P细胞的功能，减缓T2D的发展(Green.BestPractice&ResearchClinicalEndocrinology&Metabolism,2007,21，497-516)。GLP-1和GIP的上述特点使它们成为一类非常有开发前途的T2D和其他代谢失调的潜在治疗剂。[0006]尽管GLP-1和GIP具有潜在的抗糖尿病活性，它们在体内被二肽基酶IV(DPP-1V)快速地降解为非活性形式【GLP-1(9-37或9-36)，和GIP(3_42)】，并且从体内循环中清除掉(Deacon等人，JournalofClinicalEndocrinology&Metabolism,1995,80,952-957)。这种酶特异性地降解N-端第二个位置上的丙氨酸、脯氨酸或者羟脯氨酸。因此，内源性GLP-1和GIP由于DPP-1V的降解作用在人体内的半衰期非常短(Deacon等人,HormoneandMetabolicResearch,2004，36，761-765)。这也是外源G1P-1和GIP不能直接用于抗糖尿病的治疗的原因。[0007]许多研究组织都在对GLP-1和GIP的天然序列进行结构修饰，以达到抵抗DPP-1V的目的。首先，分别在GLP-1和GIP的组氨酸7和酪氨酸1残基上取代各种化学基团来扩展N-端(Green等人，JournalofEndocrinology,2004,180，379-388;O，Harte等人，Diabetes,1999，48，758-765)。其次，GLP-1序列中的Ala8和Glu9，以及GIP序列中的Ala2和Glu3分别被广泛替换成其他氨基酸甚至一些不寻常的氨基酸(Green等人，JournalofMolecularEndocrinology,2003,31,529-540;BiologicalChemistry,2003,384,1541-1551;Metabolism,2004,53,252-259;Gault,etal.JournalofEndocrinology,2003,176,133-141;Metabolism,2003,52,679-687;Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2002,290,1420-1426;Diabetologia,2003,46,222-230)。最终，GLP-1和GIP被连接在短链的或者长链的脂肪酸上来延长在体内的循环时间以及生物利用度(Holz和Chepurny,CurrentMedicinalChemistry,2003,10,2471-2483;Irwin等人，JournalofMedicinalChemistry,2005,48,1244-1250;JournalofMedicinalChemistry,2006,49，1047-1054)。这些结构改造产生了很多具有不同生物活性的GLP-1和GIP的类似物，同时极大地提高了它们对DPP-1V降解作用的耐受性。[0008]1992年在蜥蜴毒液中首次分离并鉴定的exendin-4是一种由39个氨基酸组成的多妝(Eng等人，JournalofBiologicalChemistry,1992，267，7402-7405)。exendin-4与GLP-1有大约53%的序列同源性。实验表明，exendin-4在体内和体外都是纯的和强力的GLP-1受体激动剂。它能够产生与天然的GLP-1非常相似的生理作用，同样可以调节胃排空、胰岛素分泌、食物摄取和胰高血糖素的分泌。EXendin-4在正常的啮齿类动物以及糖尿病的小鼠和大鼠实验模型上都可以引起血糖的降低(Raufman,RegulatoryPeptides,1996，61，1_18)。主要由于它的药物动力学性质得到提高，它在体内的药理活性要远好于天然的GLP-1。Exendin-4序列2位上是甘氨酸取代而不像天然的GLP-1序列那样在同样的位置上是丙氨酸。因此，Exendin-4对DPP-1V降解具有更好的稳定性，在体内的半衰期要远长于天然的GLP-1。化学合成的exendin-4(exenatide,艾塞那肽)由Amylin公司和EliLilly公司合作开发。基于它极强的降血糖特点和相对较长的体内作用时间，艾塞那肽在2005年经FDA批准上市，商品名为Byetta。目前艾塞那肽通过皮下注射给药，一天两次。一周用药一次的长效exendin-4制剂(命名为exenatide_LAR)在动物模型和人中都得到了广泛的研究(Gedulin等人，Diabetologia,2005,48,1380-1385;Drucker等人，Lancet,2008,372，1240-1250)。[0009]受到艾塞那肽巨大成功的鼓励，NovoNordisk公司开发出了利拉鲁肽(Iiraglutide),—种与人GLP-1有大约97%序列同一丨丨生的长效GLP-1类似物。基于天然的GLP-1(7-37)的序列，利拉鲁肽在34位引入了一个精氨酸取代，同时在26位的赖氨酸的e-氨基(epsilon-amine)上通过一个Y_谷酰基与棕榈酰连接,作为连接桥(spacer)。据信，棕榈酰连接通过与血清白蛋白的结合以及多肽自身聚集，在体内获得DPP-1V保护并显著延长了其体内循环速率(Malm-.ErjefSU等人，DrugMetabolismandDisposition:theBiologicalFateofChemicals,2010，38，1944-1953)。利拉鲁肽在2009年和2010年分别经EMA(欧洲药品管理局)和FDA批准上市，商品名为Victoza，以用于以一天一次的皮下注射的方式治疗T2D。利拉鲁肽目前也在进行抗肥胖症(非糖尿病人群)的3期临床实验的探索研究(Astrup等人，Lancet,2009,374,1606-1616)。其它的GLP-1和exendin-4类似物，例如taspoglutide(他司鲁肽)、albiglutide和Iixisenatide(利西拉来)等等，作为单一的GLP-1受体激动剂，都处在临床开发后期。[0010]尽管GIP在正常个体中占到了大约60%的肠促胰素效应(Nauck等人，JournalofClinicalEndocrinologyandMetabolism,1986，63，492-498),应用GIP类似物作为抗糖尿病药物的治疗应用前景却受到了极大的限制。在一部分T2D的受试体身上(并不是所有受试体)，胰腺P细胞对GIP的响应显著性地减弱或消失(Krarup等人，Metabolism,1987,36,677-682;Jones等人，HormoneandMetabolicResearch,1989,21,23-26)。因此，在T2D病人体内静脉注射GIP后只能观察到产生较弱的胰岛素分泌作用。与GIP相反的是，显示GLP-1可以在各种程度的T2D受试体上有效地刺激胰岛素的分泌(Nauck等人，JournalofClinicalInvestigation,1993，91，301-307)。[0011]GIP的促胰岛素分泌效应的减弱可能是由于GIP受体的慢性脱敏所导致(Tseng等人，AmericanJournalofPhysiology,1996，270，E661-666)，或者是因为GIP受体在T2D病人的胰腺P细胞上的表达减少所致(Holst等人，Diabetologia,1997，40，984-986)。虽然GIP的临床应用研究较少，但是已证明GIP与T2D的发病机制有密切的联系(Meier等人，RegulatoryPeptides,2002,107,1-13)。最近有文献报导，N-端修饰的GIP类似物可以提高胰岛素对葡萄糖的敏感度，还可以在患肥胖糖尿病的ob/ob小鼠模型上产生降血糖作用(O，Harte等人，JournalofEndocrinology,2000,165,639-648)。[0012]此外，GIP在T2D上引起的胰岛素分泌减少常在静脉滴注的给药方式下出现，而在其他间歇性给药方式下并不多见(Meier等人，Diabetes,2004，53，S220-224)。还有，当高血糖的症状得到好转的时候，T2D病人的胰腺P细胞可以恢复对内源性和外源性的GIP的口向应(Piteau等人，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2007,362，1007-1012)。因此，GIP作为潜在的T2D治疗方法又重新得到了重视。例如，N-AcGIP单独应用或者与exendin-4联合使用都可以在饮食诱导的肥胖糖尿病模型上显著地降低血糖水平和提高葡萄糖的耐受(I`rwin等人，RegulatoryPeptides,2009,153,70-76)。[0013]基于GLP-1和GIP诱导的促胰岛素效应，已证明GLP-1和GIP在促进葡萄糖依赖性的胰岛素分泌和细胞内cAMP的生成方面有协同和增强效应(Gallwitz等人,JournalofMolecularEndocrinology,1993，259-268;Siegel等人，EuropeanJournalofClinicalInvestigation,1992，22，154-157;Nauck等人,JournalofClinicalEndocrinologyandMetabolism,1993，76，912-917)。很多研究组织都致力于开发可以同时激活GLP-1R和GIPR的合成的GLP-1/GIP杂合肽。[0014]Gallwitz等人报导了一些合成的GLP-1/GIP嵌合肽。其N-端和C-端的三分之一序列来自于其中的一种多肽，而中间的部分则来自于另一种多肽。而且，还制备了在多肽序列的13位和15位具有额外单个突变的杂合肽以及仅仅交换C-端三分之一的嵌合肽。不幸的是，N-端的22个氨基酸与GIP-样片段的替换，以及对13位和15位两个位置的改变都会影响这些杂合肽与GLP-1R的结合亲和力(亲和力减弱280倍到1000多倍)。用GIP的C-端替换GLP-1序列的对应部分则仅降低了其与GLP-1R的亲和性20倍左右。所有的这些杂合肽在GIPR上都只有非常弱的结合亲和性(Gallwitz等人,EndocrinologyandMetaboIism,1995,2,39-46;RegulatoryPeptides,1996,63,17-22)。[0015]在已知的GIP生物活性部位的基础上，Hinke也报道了5种GIP/GLP-1杂合肽，并用这些多肽来阐明GIP和GLP-1的结合以及激活结构域。这些合成的嵌合肽是=GLP-1^ti/GIP[15-30]NH2(CHI),GIP^14ZGLP-1[15_30]NH2(CH2),GLP-1[1_11]/GIP[12_30]Nh2(CroXGIPtH1]/GLP-1[12_18]/GIP[19_3咖2(CH4)和GIPehVGLP-1m-VGIP^咖2(CH5)。GLP-1下标的氨基酸号码是根据一级序列来排序的(也就是说GLP-1[7_37]=GLP-1tl_31])。通过GIPR和GLP-1R转染的CHO细胞中的实验，在这些嵌合肽中加入GLP-1的序列并没有提高它们与GIPR的亲和力或生物活性(Hinke等人，LifeSciences,2004，75，1857-1870)。[0016]专利W02010011439描述了修饰的胰高血糖素类似物，其除了具有胰高血糖素和/或GLP-1活性外，还展现出了非常强的GIP受体激活能力。这些杂合肽是基于胰高血糖素的序列开发而得。胰高血糖素的中间部分(17-19)被GLP-1序列替换，同时C-端被extendin-4的残基(30-39)所代替。这篇专利还声明，2位和20位上分别的a，a-双取代的氨基酸修饰对获得DPP-1V保护作用以及对GLP-1R和GIPR的同时激活起至关重要的作用。GLP-1R/GIPR双重激动剂在饮食诱导肥胖(DIO)小鼠上，比纯的GLP-1激动剂(如exendin-4和里拉鲁肽)表现出了更好的降血糖作用以及降体重作用。这些双重激动剂甚至可以在GLP-1R敲除的动物模型上引起血糖和体重的降低(DiMarchi和Ma.W02010011439,2009，6月，16)。[0017]值得关注的是，据报道，简单地同时服用GLP-1和GIP并不能进一步提高T2D病人的胰岛素分泌作用，也不能进一步降低血糖水平(Mentis等人，Diabetes,2011,60,1270-1276)。这可能表明，简单的组合GLP-1和GIP并不能对它们各自在临床上所体现出的促胰岛素分泌效果产生协同或增强作用。无独有偶，Gaul也报导，同利拉鲁肽和N-AcGIP或是两者的简单肽组合相比，利拉鲁肽-N-AcGIP单一制剂可以在正常雄性NIHSwissTO小鼠以及肥胖糖尿病(ob/ob)小鼠上产生更强的降血糖作用以及胰岛素分泌刺激(Gault等人，ClinicalScience,2011，121，107-117)。【
发明内容】[0018]如本发明所述，`公开的GIP类似物基于天然的GIP序列(1-29，SEQIDN0:1)，部分地，这类多肽显示了显著的GLP-1受体激活而且同时具有GIPR刺激活性。本发明也提供了使用该GIP类似物用于治疗例如糖尿病和肥胖的代谢疾病的药物方法。[0019]一方面，本发明提供的GIP类似物具有GLP-1和GIP的双重活性。GIP和/或GLP-1的活性可以由本领域技术人员按照本领域已有的体内和体外方法来测定(FanR,KangZ,HeL,ChanJ,XuG(2011)Exendin_4ImprovesBloodGlucoseControlinBothYoungandAgingNormalNon-DiabeticMice,PossibleContributionofBetaCellIndependentEffects.PLoS0NE6(5):e20443.do1:10.1371/journal,pone.0020443;DavidG.Parkes等人，InsulinotropicActionsofExendin_4andGlucagon-LikePeptide-1InVivoandInVitro,Metabolism,Vo150,No5(May),2001:pp583-589;JensJuulHoist,ThePhysiologyofGlucagon-likePeptidel;PhysiolRev87:1409-1439，2007;do1:10.1152/physrev.00034.2006;以及M.Shimoda等人，Thehumanglucagon-likepeptide—lanalogueliraglutidepreservespancreaticbetacellsviaregulationofcellkineticsandsuppressionofoxidativeandendoplasmicreticulumstressinamousemodelofdiabetes,Diabetologia(2011)54:1098-1108，D0I10.1007/s00125-011-2069-9)。[0020]例如,每个多肽的EC5tl值通常是由cAMP诱导试验测定的(MeeraKumar等人，ABioluminescent-Based,HTS-CompatibleAssaytoMonitorG-Protein-CoupledReceptorModulationofCellularCyclicAMP,ASSAYandDrugDevelopmentTechnologies,Vol.5,N0.2,2007;YuxinYan等人,Cell-BasedHigh-ThroughputScreeningAssaySystemforMonitoringGProtein-CoupledReceptorActivationUsing旦-GalactosidaseEnzymeComplementationTechnology,JournalofBiomolecularScreening,Vol.7,N0.5,2002;ThomasC.Rich和Jeffreyff.Karpen.,High-ThroughputScreeningofPhosphodiesteraseActivityinLivingCells,MethodsinMolecularBiology,vol.307:PhosphodiesteraseMethodsandProtocols;JayneHesley等人，Stable,Sensitive,Fluorescence-BasedMethodforDetectingcAMP,BioTechniques33:691-694(September2002);以及ChristineWilliams.,cAMPDetectionMethodsFNHTS:SelectingtheBest.,NatureReviews,DrugDiscoveryVol.3,February2004),如在后面的实施方式8中所详细描述的。[0021]在一个实施方式中，本发明提供的GIP类似物(1-29，SEQIDNO:1)具有至少0.01%天然GLP-1对GLP-1受体的激动活性，例如天然GLP-1的GLP-1受体激动活性的至少0.1%、0.2%、0.5%、0.8%、1%、3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%)，和/或至少0.01%GIP对GIP受体的激动活性，例如天然GIP(SEQIDNO:1)的GIP受体激动活性的至少0.1%、0.2%、0.5%、0.8%、1%、3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%，当根据下述实施例8中所述的通用cAMP诱导试验方法进行测定时。[0022]GIP类似物可通过下述至少一种修饰而从SEQIDNO:1的序列衍生而来:[0023](I)对7位氨基酸进行取代以引发其GLP-1受体和GIP受体的激动活性；[0024](2)对13位氨基酸进行取代以提高其GLP-1及GIP受体能力；[0025](3)对22位氨基酸进行取代以提高其GLP-1及GIP受体能力；[0026]或者，类似物通过下述至少一种修饰由SEQIDNO:1的序列衍生而来:[0027](I)对7位氨基酸进行取代以引发其GLP-1受体和GIP受体的激动活性；[0028](2)对13位氨基酸进行取代以提高其GLP-1受体及GIP受体能力；[0029](3)在C-端继续延长I~20个氨基酸。[0030]本发明中，所述的氨基酸位置序号与本文SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的相同位置保持一致。更具体地，位置通过比对序列与本文SEQIDNO:1所示氨基酸序列而鉴定。[0031]在一个实施方式中，根据本发明的GIP类似物的2位是Aib取代，与SEQIDNO:1的序列相对照，该取代(Aib取代Ala)提高了由此获得的GIP类似物对DPP-1V酶的稳定性。[0032]在一个实施方式中，与SEQIDNO:1的序列相对照，根据本发明的GIP类似物的7位的氨基酸是Thr。[0033]在一个实施方式中，根据本发明的GIP类似物的13位的氨基酸在其侧链含有芳香基团。在其侧链含有芳香基团的氨基酸选自Tyr、Tyr的衍生物、Phe和Phe的衍生物。在一个实施方式中，与SEQIDNO:1的氨基酸序列相对照，根据本发明的GIP类似物的13位氨基酸为Tyr。[0034]在一个实施方式中，根据本发明的GIP类似物的16位氨基酸是带正电荷的氨基酸，例如但不限于Lys或Arg。[0035]在一个实施方式中，与SEQIDNO:1的氨基酸序列相对照，根据本发明的GIP类似物的17位氨基酸是Glu。[0036]在一个实施方式中，与SEQIDNO:1的氨基酸序列相对照，根据本发明的GIP类似物的19位氨基酸Val。[0037]在一个实施方式中，根据本发明的GIP类似物的20位氨基酸是带正电荷的氨基酸，例如但不限于Lys或Arg。在一个实施方式中，与SEQIDNO:1的氨基酸序列相对照，根据本发明的GIP类似物的20位氨基酸Arg。[0038]在一个实施方式中，根据本发明的GIP类似物的22位氨基酸由Phe或Phe衍生物取代，例如非天然氨基酸，如4-卤代-苯丙氨酸、4-硝基-苯丙氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-烷基苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸以及包括带有饱和或不饱和环侧链的Cha、Chg和Phg的类似物。[0039]在一个实施方式中，根据本发明的GIP类似物的29位氨基酸是Gly或Gin。[0040]在进一步的方面，由SEQIDNO:1的序列衍生而来的GIP类似物通过至少上述的修饰中的一种修饰后可以进一步进行修饰来提高其GLP-1的激动活性。[0041]在一个实施方式中，由SEQIDN0:1序列衍生而来的GIP类似物的N-端区(1-16)在2、7、13位中的一个或多个位上通过至少一种修饰与GLP-1(SEQIDNO:1)或exendin-4(SEQIDNO:99)的中间段(17-20位)以及GLP-1(SEQIDNO:1)或exendin-4(SEQIDN0:99)的C-端区(21-29)融合。[0042]在一个实施方式中，exendin-4的中间段(SEQIDNO:99的17-20位氨基酸残基)被整合到根据本发明的GIP类似物的肽骨架中以提高GLP-1活性，并保持GIP受体激动活性。[0043]在一个实施方式中，GLP-1【7-37】的C-端区(SEQIDNO:1的27-35位氨基酸残基)被整合到根据本发明的GIP类似物的肽骨架中以提高GLP-1活性，并保持GIP受体激动活性。[0044]在进一步的方面,通过与GLP-1和/或exendin-4的区域融合而获得的GIP类似物可以进一步修饰以提高其活性和/或性质。[0045]在一个实施方式中，根据本发明的GIP类似物的C-端由exendin-4的片段(30-39位)，GPSSGAPPPS，而延长。[0046]在一个实施方式中，C-端用1-10个带正电荷的氨基酸残基延长。带正电荷的氨基酸残基是Lys和/或Arg，优选Lys。带正电荷的氨基酸残基的数目优选是1_6，更优选是1-4，例如在C-端有2个、3个或4个或5个带正电荷的氨基酸残基延长。在一个优选的实施方式中，GIP类似物的C-端由源自胃泌酸调节素(oxyntomodulin)的间插肽(IP-1片段)KRNRNNIA延长。[0047]在一个实施方式中，根据本发明的GIP类似物的i位和i+4位氨基酸间形成盐桥，例如12位和16位。在这样的实施方式中，12和16位氨基酸中的一个氨基酸由带负电荷的氨基酸取代，例如Glu，而另一个位点是带正电荷的氨基酸，例如Lys。[0048]在一个实施方式中，根据本发明的GIP类似物的i位和i+4位氨基酸间形成内酰胺环，例如12位和16位。在这样的实施方式中，12和16位氨基酸中的一个氨基酸由带负电荷的氨基酸取代，例如Glu，而另一个位点是带正电荷的氨基酸，例如Lys。[0049]在一个实施方式中，根据本发明的GIP类似物的j位和j+3位氨基酸间形成盐桥，例如17位和20位。在这样的实施方式中，17和20位氨基酸中的一个由带负电荷的氨基酸取代，例如Glu，而另一个位点是带正电荷的氨基酸，例如Lys。[0050]在一个实施方式中，根据本发明的GIP类似物的j位和j+3位氨基酸间形成内酰胺环，例如17位和20位。在这样的实施方式中，17和20位氨基酸中的一个由带负电荷的氨基酸取代，例如Glu，而另一个位点是带正电荷的氨基酸，例如Lys。[0051]在一个实施方式中，GIP类似物包括位于根据本发明的GIP类似物的i和i+4位氨基酸的侧链之间的盐桥，其中i是12、13、16、17、20或24。[0052]在一个实施方式中，GIP类似物包括位于根据本发明的GIP类似物的j和j+3位的盐桥，其中j是17、18、19或20。[0053]在一个实施方式中，根据本发明的GIP类似物中含有的Lys的e-氨基(epsilon-amine)可以连接有脂肪酸半体，例如Lys16或Lys18。脂肪酸可以选自肉蘧酸、棕榈酸、硬脂酸和胆酸。[0054]在一个实施方式中，e-氨基基团(如Lys、0rn、Dab或Dap)位于根据本发明的GIP类似物的20、24、28、32、33和/或37位。在一个实施方式中，共价连接到带有正电荷的氨基酸残基的侧链的酰基基团可以位于30位至C-末端的任何位置。[0055]在一个实施方式中，16位Lys的e-氨基基团被脂肪酸酰化。[0056]在一个实施方式中，带正电荷的氨基酸残基的侧链被酰化。[0057]在一个实施方式中，连接酰基基团的氨基酸优选在40位。[0058]在一个实施方式中，肽链和脂肪酸半体之间被插入连接桥。连接桥可以是包括1-10氨基酸残基的肽，例如(Glu)m，m是0_3之间的整数。[0059]在一个实施方式中，连接桥是一个氨基酸或选自Y-Glu-Y-Glu、d-Ala-d-Ala、d—Ala-y—Glu-,y—Glu-d—Ala或Glu-Glu的二妝。[0060]在一个实施方式中，酰基基团是C8-C20的脂肪酰基，高度优选棕榈酰。[0061]在一个实施方式中，GIP类似物与亲水性的聚合物在30位到C-末端的任意氨基酸位置进行共价结合，以显著改善其药动学性质。在一个实施方式中，亲水性聚合物与GIP类似物的24-位氨基酸共价结合。[0062]在一个实施方式中，亲水性聚合物与GIP类似物的Cys、同型半胱氨酸(homocysteine)、Lys、Orn>Dab、Dap或对氨基苯丙氨酸的侧链结合。[0063]在一个实施方式中，亲水性聚合物是聚乙二醇(PEG)。[0064]在一个实施方式中，PEG的分子量从约1，000至约40，000道尔顿，例如约5，000至约40，000道尔顿，优选约1，000至约20，000道尔顿。[0065]在一个实施方式中，PEG含有马来酰或醛基功能基团。[0066]在一个实施方式中，肽链和脂肪酸之间被插入连接桥。连接桥是包括1-10氨基酸残基的肽，例如(Glu)m，m是0-3之间的整数。[0067]在一个实施方式中，连接桥是一个氨基酸或选自Y-Glu-Y-Glu、d-Ala-d-Ala、d—Ala-y—Glu-,y—Glu-d—Ala或Glu-Glu的二妝。[0068]在一个实施方式中，GIP类似物是以游离羧酸、酰胺或药学上可接受的盐的形式存在。[0069]一方面，本发明提供的GIP类似物具有GLP-1的激动活性。根据本发明提供的GIP类似物具有GLP-1激动活性和GIPR刺激活性。[0070]在一个实施方式中，本发明提供一种源自GIP(1-29，SEQIDN0:1)的GIP类似物，其中GIP类似物具有GLP-1激动活性和GIPR刺激活性，并包含下述通式所示的氨基酸序列:[0071]Tyr-A2-A3-Gly-Thr-Phe-A7-Ser-Asp-Tyr-Ser-A12-A13-A14-A15-Lys-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-Trp-Leu-A27-A28-A29-Y[0072]其中:[0073]A2选自由Ala、Gly、肌氨酸、Aib、d_Ala和d_Ser组成的组；[0074]A3选自由Glu和Gln组成的组；[0075]A7选自由Thr、Ile和Ser组成的组；[0076]A12选自由lie、Glu和Asp组成的组；[0077]A13选自由具有芳香基团的氨基酸残基组成的组并选自Tyr、Phe、Phe(4_F)、Phe(4-N02)、Phe(4_NH2)、Ala、Ala(2-噻吩基)、Ala(苯并噻吩基)、Ala(4-吡啶基)和苯基甘氨酸；[0078]A14选自由Met或氧化Met、Leu、Val、正亮氨酸和Ile组成的组；[0079]A15选自由Glu和Asp组成的组；`[0080]A17选自由lie、Glu和Gln组成的组；[0081]A18选自由Ala和His组成的组；[0082]A19选自由Val、Ala、Leu、Gln和Ile组成的组；[0083]A20选自由Arg、Lys_Z、Gin、Glu、Asp和Cys-Z组成的组；[0084]A21选自由Glu、Asp和Leu组成的组；[0085]A22选自由Phe、Phe(4_F)、Phe(4-C1)、Tyr、Tyr(4_Me)和Nal组成的组；[0086]A23选自由Ile和Val组成的组；[0087]A24选自由Ala、Asn、Glu、Lys-Z和Cys-Z组成的组；[0088]A27选自由Val、Leu、Ala和Lys-Z组成的组；[0089]A28选自由Lys-Z、Ala、Arg和Asn组成的组；[0090]A29选自由Gly、Gln和Arg组成的组；[0091]Y选自由A30和-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-A^iO或缺失组成的组；[0092]A30和A40独立地选自由-(Lys)n_Z和-Cys-Z或缺失组成的组；[0093]Z选自由-(Glu)m-PEG、-(Glu)m-生物素和-(Glu)m-脂肪酸或缺失组成的组；[0094]n为选自1-6的整数；[0095]m为选自0-3的整数；[0096]其中，在GIP类似物的第i位和第i+4位的氨基酸之间任选地形成内酰胺桥，i为选自12-24的整数；[0097]或其药学上可接受的盐。[0098]在一个实施方式中，本发明提供了如通式I所示的GIP类似物，[0099]其中:[0100]A3是Glu;[0101]A13选自由具有芳香基团的氨基酸残基组成的组并选自Tyr、Phe、Phe(4_F)、Phe(4-N02)、Phe-(4_NH2)、Ala(2-噻吩基)、Ala(苯并噻吩基)和苯基甘氨酸；[0102]A15是Glu;[0103]A18是Ala;[0104]A19选自由Val和Ala组成的组；[0105]A20选自由Arg、Lys_Z、Glu、Asp和Cys-Z组成的组；[0106]A21选自由Glu和Leu组成的组；[0107]A22是Phe;[0108]A23是lie;[0109]A27选自由Val和Lys-Z组成的组；[0110]A28选自由Lys-Z和Asn组成的组；且[0111]A29是Gly;[0112]Z选自由-(Glu)m-PEG、-(Glu)m-生物素和-(Glu)m-脂肪酸或缺失组成的组；[0113]m为选自0-3的整数；[0114]在一个方面中，本发明提供源自GIP(1-29，SEQIDNO:1)的GIP类似物，其中GIP类似物具有GLP-1激动活性和GIPR刺激活性，并包括由下述通式所示的氨基酸序列:[0115]Tyr-A2-Glu-Gly-Thr-Phe-A7-Ser-Asp-Tyr-Ser-A12-A13-A14-Glu-Lys-A17-Ala-A19-A20-A21-Phe-1le-A24-Trp-Leu-A27-A28-Gly-Y[0116]其中:[0117]A2选自由Ala、Gly、肌氨酸、Aib、d_Ala和d-Ser组成的组；[0118]A7选自由Thr、Ile和Ser组成的组；[0119]A12选自由lie、Glu和Asp组成的组；[0120]A13选自由具有芳香基团的氨基酸残基组成的组并选自Tyr、Phe、Phe(4_F)、Phe(4-N02)、Phe-(4_NH2)、Ala(2-噻吩基)、Ala(苯并噻吩基)和苯基甘氨酸；[0121]A14选自由Met或氧化的Met、Leu、Val、正亮氨酸和Ile组成的组；[0122]A17选自由Glu和Gln组成的组；[0123]A19选自由Val和Ala组成的组；[0124]A20选自由Arg、Lys_Z、Glu、Asp和Cys-Z组成的组；[0125]A21选自由Glu和Leu组成的组；[0126]A24选自由Ala、Asn、Glu、Lys-Z和Cys-Z组成的组；[0127]A27选自由Val和Lys-Z组成的组；[0128]A28选自由Lys-Z和Asn组成的组；[0129]Y选自由A30和-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser_A40或缺失组成的组；[0130]A30和A40独立地选自由-(Lys)n_Z和Cys-Z或缺失组成的组；[0131]Z选自由(Glu)m-PEG、(Glu)m-生物素和(Glu)m-脂肪酸或缺失组成的组；[0132]n为选自1-6的整数；[0133]m为选自0-3的整数；[0134]其中，在GIP类似物的第i位和第i+4位的氨基酸之间任选地形成内酰胺桥，i为选自12-24的整数；[0135]或其药学上可接受的盐。[0136]在有些实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:[0137]Y是A30或缺失；[0138]A30选自由(Lys)n_Z和Cys-Z或缺失组成的组；[0139]Z选自由(Glu)m-PEG、(Glu)m_生物素和(Glu)m-脂肪酸或缺失组成的组；[0140]n为选自1-6的整数；[0141]m为选自0-3的整数；[0142]在有些实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:[0143]Y是Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-A^iO；[0144]A40选自由(Lys)n_Z和Cys-Z或缺失组成的组；[0145]Z选自由(Glu)m-PEG、(Glu)m_生物素和(Glu)m-脂肪酸或缺失组成的组；[0146]n为选自1-6的整数；[0147]m为选自0-3的整数；[0148]在有些实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:[0149]Z选自由(Glu)m-PEG、(Glu)m-生物素和(Glu)m-脂肪酸组成的组；m为选自0-3的整数；[0150]在有些实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:Y是缺失。[0151]在这些实施方式中，本发明提供源自GIP(1-29，SEQIDNO:1的GIP类似物，其中GIP类似物具有GLP-1激动活性和GIPR刺激活性，并包括由下述通式所示的氨基酸序列:[0152]Tyr-A2-Glu-Gly-Thr-Phe-A7-Ser-Asp-Tyr-Ser-A12-A13-A14-Glu-Lys-A17-Ala-A19-A20-A21-Phe-1le-A24-Trp-Leu-A27-A28-Gly[0153]其中:[0154]A2选自由Ala、Gly、肌氨酸、Aib、d_Ala和d_Ser组成的组；[0155]A7选自由Thr、Ile和Ser组成的组；[0156]A12选自由lie、Glu和Asp组成的组；[0157]A13选自由具有芳香基团的氨基酸残基组成的组并选自Tyr、Phe、Phe(4_F)、Phe(4-N02)、Phe-(4_NH2)、Ala(2-噻吩基)、Ala(苯并噻吩基)和苯基甘氨酸；[0158]A14选自由Met或氧化的Met、Leu、Val、正亮氨酸和Ile组成的组；[0159]A17选自由Glu和Gln组成的组;[0160]A19选自由Val和Ala组成的组；[0161]A20选自由Arg、Lys_Z、Glu、Asp和Cys-Z组成的组；[0162]A21选自由Glu和Leu组成的组；[0163]A24选自由Ala、Asn、Glu、Lys-Z和Cys-Z组成的组；[0164]A27选自由Val和Lys-Z组成的组；[0165]A28选自由Lys-Z和Asn组成的组；[0166]Z选自由(Glu)m-PEG、(Glu)m_生物素和(Glu)m-脂肪酸组成的组；[0167]m为选自0-3的整数；[0168]其中，在GIP类似物的第i位和第i+4位氨基酸之间任选地形成内酰胺桥，i为选自12-24的整数；[0169]或其药学上可接受的盐。[0170]在有些实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:Y是Gly-Pix)-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Sero[0171]在这些实施方式中，本发明提供源自GIP(1-29，SEQIDNO:1)的GIP类似物，其在GIP类似物具有GLP-1激动活性和GIPR剌激活性，并包括由下述通式所示的氨基酸序列:[0172]Tyr-A2-Glu-Gly-Thr-Phe-A7-Ser-Asp-Tyr-Ser-A12-A13-A14-Glu-Lys-A17-Ala-A19-A20~A21-Phe-1Ie-A24-Trp-Leu-A27-A28-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser[0173]其中:[0174]A2选自由Ala、Gly、肌氨酸、Aib、d_Ala和d_Ser组成的组；[0175]A7选自由Thr、Ile和Ser组成的组；[0176]A12选自由lie、Glu和Asp组成的组；`[0177]A13选自由具有芳香基团的氨基酸残基组成的组并选自Tyr、Phe、Phe(4_F)、Phe(4-N02)、Phe-(4_NH2)、Ala(2-噻吩基)、Ala(苯并噻吩基)和苯基甘氨酸；[0178]A14选自由Met或氧化的Met、Leu、Val、正亮氨酸和Ile组成的组；[0179]A17选自由Glu和Gln组成的组；[0180]A19选自由Val和Ala组成的组；[0181]A20选自由Arg、Lys_Z、Glu、Asp和Cys-Z组成的组；[0182]A21选自由Glu和Leu组成的组；[0183]A24选自由Ala、Asn、Glu、Lys-Z和Cys-Z组成的组；[0184]A27选自由Val和Lys-Z组成的组；[0185]A28选自由Lys-Z和Asn组成的组；[0186]Z选自由(Glu)m-PEG、(Glu)m_生物素和(Glu)m-脂肪酸组成的组；[0187]m为选自0-3的整数；[0188]其中，在GIP类似物的第i位和第i+4位氨基酸之间任选地形成内酰胺桥，i为选自12-24的整数；[0189]或其药学上可接受的盐。[0190]在某些实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:A7为Thr；[0191]在某些实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:A2为Aib；[0192]在某些实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:A13为Tyr；[0193]在某些实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:A17为Glu；[0194]在某些实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:A19为Val；[0195]在某些实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:A20为Arg；[0196]在某些实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:A24为Cys-Z；[0197]Z是_(Glu)m_PEG；[0198]m是选自0-3的整数。[0199]在一个实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:[0200]A30和A40独立地选自(Lys)n_Z；[0201]Z选自由_(Glu)m-PEG、_(Glu)m-生物素和-(Glu)m-脂肪酸或缺失组成的组；[0202]n为选自1-6的整数；[0203]m为选自0-3的整数。[0204]在一个实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:[0205]Z选自由-(Glu)m-PEG和-(Glu)m_脂肪酸组成的组；[0206]m为选自0-2的整数。[0207]在一个实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:[0208]Z是-(Glu)m-PEG;[0209]m为选自0-2的整数。[0210]在一个实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:[0211]Z选自由-(Glu)m-脂肪酸组成的组；[0212]m为选自0-2的整数。[0213]例如，_(Glu)m可以是Y_Glu或y_Glu_y-Glu0[0214]在某些实施方式中，本发明提供的GIP类似物如通式I所示，其中:内酰胺桥在GIP类似物的第i位和第i+4位氨基酸之间形成；i为选自12、16和24的整数。[0215]在某些实施方式中，脂肪酸选自由肉蘧酸、棕榈酸、硬脂酸和胆酸组成的组。[0216]在某些实施方式中，PEG的分子量是从5kDa到40kDa，例如20kDa、30kDa或40kDa。[0217]在某些实施方式中，GIP类似物或其药学上可接受的盐所包括的氨基酸序列选自由SEQIDNO:65、2-64和66-98组成的组。[0218]在某些实施方式中，GIP类似物或其药学上可接受的盐所包括的氨基酸序列选自由SEQIDN0:3、18、19、20、21、35、45、52、63、65、72、74、80、97和98组成的组。[0219]在某些实施方式中，GIP类似物或其药学上可接受的盐所包括的氨基酸序列选自由SEQIDNO:52、72和74组成的组，这些序列具有在第20位、第24位和/或C-末端连接的至少一个脂肪酸半体。[0220]在某些实施方式中，GIP类似物或其药学上可接受的盐所包括的氨基酸序列选自由SEQIDNO:65、74和98组成的组，这些序列具有在第20位、第24位和/或C-末端连接的至少一个PEG半体。[0221]在某些实施方式中，GIP类似物或其药学上可接受的盐包括SEQIDN0:74所示的氨基酸序列，其具有在第24位连接的PEG半体和在C-末端连接脂肪酸半体。[0222]根据本发明的GIP类似物均可以本领域技术人员已知的方法合成和修饰得到。例如，根据本发明的GIP类似物的肽骨架可以通过标准的固相肽合成方法(FmocSolidPhasePeptideSynthesis:APracticalApproach,Chan,WengC;White,PeterD.,OXFORUniversitypress,2000，41-72)或下文实施例1-7所描述的方法得到。GIP类似物还可以通过重组DNA技术或其他制备肽和融合蛋白的方法制备。[0223]在进一步的方面，本发明提供包含有有效量的本文所述的GIP类似物、药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物。[0224]在一个实施方式中，药物组合物可以进一步包含一种或多种抗糖尿病剂，所述抗糖尿病剂选自胰岛素类、双胍类、磺酰脲类、罗格列酮或匹格列酮、a-葡萄糖苷酶抑制剂以及氨基二肽酶IV抑制剂。[0225]在一个实施方式中，药物组合物可以做成注射剂或冻干粉的形式。[0226]如本文所用，“药物组合物”是指根据本发明的具有治疗效用的制剂。[0227]在本发明的用于组合物制备的方法和应用中，还提供了有效成分的治疗有效剂量。治疗有效剂量可以由普通专业人员或兽医工作者根据患者的特征来测定，例如年龄、体重、性别、状况、并发症及本领域公知的其它疾病等。[0228]本发明的药物组合物通常由任何胃肠外途径给药，以包含有效成分的药物组合物的形式，任选无毒有机酸、无机酸或碱加成盐的形式，以药学上可接受的剂量形式。依赖于待治疗的病症和病人以及给药途径，可以不同的剂量施与组合物。[0229]本发明的药物组合物可以通过胃肠外途径给药，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、向鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌内或皮下途径，或者它们通过输液技术施与。药物组合物最好是以灭菌注射液的形式使用，其可能还包含例如足量的盐或葡萄糖的其他物质，以达到注射液与血液等渗的目的。如果需要，注射液还需要有合适的缓冲体系(pH值优选调整到3-9)。本领域技术人员可以按照公知的标准制药技术在无菌条件下完成胃肠外制剂的制备。[0230]适合胃肠外给药的药物组合物包括水性和非水性无菌注射剂，其可以包含抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂达到目标接受者的血液等渗所需要的溶解物；同时，水性和非水性无菌混悬物可以包括助悬剂和增稠剂。药物组合物可以装在单次剂量或多次剂量的容器中，例如密封的安剖瓶和药水瓶；也可以以冻干(Iyophilised)粉状态贮存，其在使用前仅需要加入无菌液体载体，如注射用水，即溶即用。[0231]对于人类患者的口服和胃肠外给药，本发明的药物组合物的单日剂量水平通常在0.1iig至100Iig之间，例如IIig-100iig>10iig、20ug>30ug、40ug>50ug、60ug、70iig、80iig、90iig或100ug/成人/天，单次或多次给药。[0232]因此，例如，本发明的药物组合物可含有并优选含有0.1Ug到lOOiig，例如IV-g-100iig、10yg、20yg、30yg、40yg、50yg、60yg、70yg、80yg、90yg或100iig的有效成分，如适用，一次给药单个或两个或多个。[0233]在一个实施方式中，本发明的药物组合物的给药剂量范围为0.1iig到IOOiig，例如Iyg-100Iig、10Iig、20ug、30ug、40ug、50ug、60ug、70ug、80ug、90ug或100ug,给药频率例如但不限于，每天一次或两次。[0234]在进一步的方面，本发明涉及根据本发明的GIP类似物在治疗或预防代谢失调中的应用。[0235]在进一步的方面，本发明涉及治疗或预防代谢失调的方法，其包括给有此需求的受试者施与有效量的根据本发明的GIP类似物或其药学上可接受的盐或根据本发明的药物组合物的步骤。[0236]在本发明中，代谢疾病包括但不限于糖尿病、肥胖症和骨质疏松症。[0237]在进一步的方面，本发明涉及在体内和/或体外激活GIP和GLP-1受体的方法，其包括将根据本发明的GIP类似物或其药学上可接受的盐与GIP和GLP-1受体接触的步骤。这些方法均可以在体内或体外进行。【专利附图】【附图说明】:[0238]图1表示在正常ICR小鼠上对类似物023、024、025和026(3nmol/kg)进行的ipGTT,以exendin-4(lnmol/kg)作为参考化合物。该化合物分别在_30min的时间点通过皮下注射给药，在Omin的时间点装载葡萄糖(3g/kg)。[0239]图2表示对类似物023、024、025和026进行的ipGTT的AUC。根据AUC数据，尽管类似物024具有更佳的体外活性，类似物023在这些类似物中是最有效的。因此，类似物023被选为活性化合物(hitcompound)o[0240]图3表示在正常ICR小鼠上对类似物051(lnmol/kg)进行的ipGTT，以同剂量的exendin-4作为参考化合物。化合物分别在_30min的时间点通过皮下注射给药,在Omin和240min的时间点装载葡萄糖(3g/kg)。[0241]图4表示对类似物051进行的ipGTT的AUC。根据AUC数据，再连续两次葡萄糖装载后，类似物051和exendin-4在同剂量水平上具有相当相似的降血糖作用。[0242]图5表示类似物088和089在CHO细胞系上进行的hGLP_lR介导的cAMP诱导试验。类似物088(20kPEG化的肽)显示了接近于类似物089(40kPEG化的肽)的GLP-1活性。[0243]图6表示类似物088和089在CHO细胞系上进行的hGIPR介导的cAMP诱导试验。类似物088(20kPEG化的肽)显示了接近于类似物089(40kPEG化的肽)的GIP活性。`[0244]图7表示从0-49天，类似物089在db/db小鼠上以剂量调整形式获得的非空腹血糖水平，以利拉鲁肽做为参考化合物。在所有的类似物089组中观察到比利拉鲁肽更强的降血糖活性。[0245]图8表示在第42天，类似物089在db/db小鼠上以剂量调整形式获得的HbAlC的水平，以利拉鲁肽做为参考化合物。在所有的类似物089组中观察到比利拉鲁肽更强的降低HbAic活性。[0246]图9表示在第50天，类似物089在db/db小鼠上以剂量调整形式获得的血清TG的水平，以利拉鲁肽做为参考化合物。在所有的类似物089组中观察到比利拉鲁肽更强的降低血清TG活性。[0247]图10表示从0-28天，类似物089在DIO小鼠上以剂量调整形式获得的体重水平，以利拉鲁肽做为参考化合物。在所有的类似物089组中观察到比利拉鲁肽更强的降低体重活性。[0248]图11表示在第28天，类似物089在DIO小鼠上以剂量调整形式获得的血清TG的水平，以利拉鲁肽做为参考化合物。在所有的类似物089组中观察到比利拉鲁肽更强的降低血清TG活性。[0249]图12表示在第28天，类似物089在DIO小鼠上以剂量调整形式获得的血清CHO的水平，以利拉鲁肽做为参考化合物。在所有的类似物089组中观察到比利拉鲁肽更强的降低血清CHO活性。[0250]图13表示在第28天，类似物089在DIO小鼠上以剂量调整形式获得的血清HDL/LDL的水平，以利拉鲁肽做为参考化合物。在所有的类似物089组中观察到比利拉鲁肽更强的改善血清HDL/LDL比率的活性。[0251]图14表示类似物089在正常小鼠中的药物代谢动力学研究。静脉注射类似物089，17nmol/kg,半衰期为15小时,皮下注射17nmol/kg、50nmol/kg和150nmol/kg的剂量,半衰期分别为11.9小时、19.9小时和25.2小时。生物利用度约为30%。【具体实施方式】[0252]定义[0253]本发明中，如下术语将和下面的术语解释相一致。[0254]文中使用的术语“相似”或“接近”意思是比规定的数值或数值范围大或小10%，但是并不是规定任何数值或数值范围仅仅在这一更宽的定义内。每一个由术语“类似”或“接近”描述的数值或数值范围也包含规定的绝对值或数值范围。[0255]文中使用的术语“药学上可接受的载体”包含任何标准药物载体，比如磷酸盐的生理盐水缓冲液，水，乳剂如油/水或水/油乳剂，和各种湿润剂。[0256]文中使用的术语“药学上可接受的盐”是指保持母体化合物生物活性的化合物的盐，和那些没有生物活性或其他非所需活性的盐。文中描述的很多化合物都能通过氨基和/或羧基或与其类似的基团形成酸和/或碱的盐。[0257]药学上可接受的碱加成盐能够从无机碱和有机碱制得。从无机碱得到的盐，仅包括所举的例子，钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。从有机碱得到的盐包括，但不限于，伯胺、仲胺和叔胺的盐。[0258]药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸和有机酸制得。从无机酸得到的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及类似品。从有机酸得到的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、羟基丁二酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸及其他类似的酸类。[0259]文中使用的术语“治疗”包括具体障碍或情况的预防，或与一种具体障碍或情况有关的症状的缓解，和/或防止或消除所说的症状。比如，文中使用的术语“糖尿病治疗”通常是指改变血糖水平至正常范围内，可以包括根据一定情况升高或降低血糖水平。[0260]本文中提到的GIP类似物的“有效量”或“治疗有效量”是指无毒但是能达到预期治疗效果的肽的量。例如，一种预期的治疗效果是预防或治疗高血糖，用血糖降低水平来衡量。另一种预期治疗效果包括降低体重或者是防止体重增加，用体重降低来衡量。“有效”剂量会随着个人年龄和自身的状况，管理模式及类似情况改变而改变。因此，确定一个精确的“有效剂量”是不太可能的。然而针对每个人使用的适中的“有效”剂量可以由本领域常规技术人员通过常规试验确定。[0261]本文所提到的术语“纯化”和类似术语是指对分子或化合物的分离，以使其处于基本不含在天然或自然环境中通常与该分子或化合物共存的污染物。本文所提到的术语“纯化”不要求绝对的纯；相反的，它是相对的定义。本问所提到的术语“纯化的多肽”是指从其他化合物中分离得到的多肽，所述其他化合物包括但不局限于核酸分子、脂质体和碳水化合物。[0262]术语“分离，，是指从原始环境中分离得到该物质，例如，一种存在于活动物中的天然的多聚核苷酸是没有被分离的，但是同一种多聚核苷酸，从一些或全部自然系统中的共存物质中被分出，就是分离。[0263]本文中所提到的术语“肽”是指包括三个或更多，并典型的少于50个氨基酸的序列，其中这些氨基酸可能是天然的或者是非天然的氨基酸。非天然的氨基酸是指在体内不存在，但是可以包含在本文所描述的肽结构当中的氨基酸。[0264]本文所提到的“GIP类似物”是包括SEQIDNO:18的氨基酸序列或SEQIDNO:18的氨基酸序列的任何类似物的任何一个肽，其包括肽的氨基酸的取代、添加、缺失或翻译后修饰(例如，甲基化、乙酰化、烷基化、泛酸化、分子内共价键:如形成内酰胺桥，聚乙二醇化等)，其中该类似物能够刺激GIPR和GLP-1R激活，如通过使用实施例中所提到的cAMP诱导试验所测量的。[0265]本文所提到的氨基酸的“修饰”是指氨基酸的取代、添加或缺失，包括取代或添加20种天然氨基酸中的任意种。本发明中，一个特定的氨基酸位置编号(如第24位)都是指天然GIP(SEQIDNO:1)或其任何一种类似物中相应的氨基酸位置。[0266]本文中所提到的术语“天然GLP-1”是指包含人GLP-1(7-36或7_37)序列的肽，术语“天然GIP”是指包含人GIP序列(1-42)序列的肽。本文所使用的术语“GLP-1”或者“GIP”，如果没有进一步解释，则分别指天然GLP-1或天然GIP。[0267]本文所提到的氨基酸“取代”是指一个氨基酸残基被不同的氨基酸残基所取代。[0268]本文所提到的通用术语“聚乙二醇”或“PEG”是指环氧乙烷和水的缩聚物的混合物，以直链或支链形式存在，以通式H(OCH2CH2)nOH表示，其中n最小等于9。若没有进一步说明，这一术语包括平均总分子量选自5，000至40，000道尔顿之间的聚乙二醇的聚合物。“聚乙二醇”或“PEG”与一个数值后缀一起使用表示其大致的平均分子量。例如，PEG-5000是指具有约5000道尔顿的平均分子量的聚乙二醇。[0269]本文所提到的术语“PEG化”或类似术语是指从化合物天然状态通过连接PEG链到肽而进行修饰。“PEG化的肽”是指PEG链以共价键与肽结合的肽。[0270]本文所提到的术语“脂肪酸”是指具有长脂肪酸族尾(链)的羧酸，其可以是饱和或非饱和的。本发明中，脂肪酸是具有C4-C30的直链或支链的脂肪族基团的羧酸。优选的脂肪酸选自肉豆蘧酸、棕榈酸和硬脂酸。[0271]本文所提到的肽的一般定义包括具有修饰的氨末端和羧末端的肽。例如，包含以酰胺基团取代末端羧酸的氨基酸链也包括在命名为天然氨基酸的氨基酸序列内。[0272]本文所提到的“连接桥”(spacer)是指键、分子或分子的基团，其将两个分离的实体彼此连接。连接桥可以优化两个实体的空间结构或提供可以让两个实体彼此分离的易变的结合物。易变的结合物包括光解基团、对酸不稳定的半体、对碱不稳定的半体和酶解基团。[0273]本文所提到的“带电荷的氨基酸”是指在生理pH值的水溶液内，含有带负电荷(即去质子化)或正电荷(即质子化)的侧链的氨基酸。例如，带负电荷的氨基酸包括Asp、Glu、半胱氨酸、同型半胱氨酸和同型谷氨酸，而带正电荷的氨基酸包括Arg、LyS和His。带电荷的氨基酸包括20种天然氨基酸和非天然氨基酸中的带电荷的氨基酸。[0274]本文所提到的术语“酸性氨基酸”是指含有第二个酸性基团的氨基酸，包括例如羧酸基或者是硫酸基。[0275]本文所提到的肽的“GIP活性”是指天然GIP在GIPR上的EC5tl值与该肽在GIPR上的EC5tl值的比值。[0276]本文所提到的肽的“GLP-1活性”是指天然GLP-1在GLP-1R上的EC5tl值与该肽在GLP-1R上的EC5tl值的比值。[0277]本文所提到的术语“烷基”是指含指定数量碳原子的直链或支链碳氢化合物。示例性的烷基包括甲基、乙基和正丙基。[0278]本文所提到的术语“杂烷基”是指含指定数量碳原子的直链或支链碳氢化合物，其中该结构的骨架中至少含有一个杂原子。本发明中所适用的杂原子包括但不局限于N、S和O。[0279]本文所提到的术语“环烷基”是指含指定数量碳原子的环状碳氢化合物，例如，环丙基、环丁基、环己基和环戊基。[0280]本文所提到的术语“杂环烷基”指含指定数量碳原子和一至三个杂原子的环状碳氢化合物，其中杂原子独立地选自0、N和S。非限制性的杂环烷基的例子包括哌啶、四氢呋喃、四氢吡喃、二氢呋喃、吗啉、噻吩等。[0281]本文所提到的术语“芳香基”是指单环或者多环芳香基，优选含有指定数目碳原子的单环或者双环芳香基，如苯基或萘基。除非特别说明，芳香基可以是未被取代的或被取代的。[0282]本文所提到的术语“Aib”是指a-氨基异丁酸。[0283]本文所提到的术语“Phe(4-F)”是指苯丙氨酸的类似物，其苯基的对位由氟原子取代。[0284]本文所提到的术语“Phe(4_N02)”是指苯丙氨酸的类似物，其苯基的对位由硝基取代。[0285]本文所提到的术语“Phe(4_NH2)”是指苯丙氨酸的类似物，其苯基的对位由氨基取代。[0286]本文所提到的术语“Ala(2_噻吩基)”是指丙氨酸的类似物，其(6-甲基由2_噻吩基团修饰。[0287]本文所提到的术语“Ala(苯并噻吩基)”是指丙氨酸的类似物，其P_甲基由苯并噻吩基团修饰。[0288]本文所提到的术语“Nal”是指丙氨酸的类似物，其(6-甲基由萘基修饰。[0289]本文所提到的术语“Ala(4_吡啶基)”是指丙氨酸的类似物，其(6-甲基由4_吡啶基团修饰。[0290]本文所提到的术语“苯基甘氨酸”是指甘氨酸的类似物，其亚甲基由苯基修饰。[0291]本文所提到的术语“Tyr(4_Me)”是指酪氨酸的类似物，其羟基的氢原子由甲基取代。[0292]本文所提到的术语“肌氨酸”是指甘氨酸的类似物，其氨基由甲基修饰。[0293]本文所提到的术语“Orn”是指2，5_二氨基戊酸。[0294]本文所提到的术语“Dab”是指2，4_二氨基丁酸。[0295]本文所提到的术语“Dap”是指2，3_二氨基丙酸。[0296]本文所提到的术语“正亮氨酸”是指2-氨基己酸。[0297]天然GIP(1-42)完全没有GLP-1R的激动活性(Moon等人，MolecularCells,2010,30,149-154)，更不用说其GIP(1-29)片段了。但是，在我们的研究概况中，GIP(1-29)片段能保持与全长GIP(1-42)相当的体外GIPR激动活性。因此，可以通过杂化概念并基于GIP(1-29)序列进行位点突变来构建新的GIP类似物。将GLP-1、exendin-4和利拉鲁肽序列中的某些氨基酸残基引入以引发GLP-1活性。这些GIP类似物不但具有等效的或者甚至超过天然GIP的强力GIPR激动活性，而且在体外具有等效的或者甚至超过天然GLP-1(7-36或7-37)的强力GLP-1R激动活性。[0298]特异性位点突变引发GLP-1活性。[0299]从N-端开始逐一位点比较GLP-1和GIP序列，除了HisVTyr1外最大的不同取代就是Thr13/Ile7。最近报道显示，每条肽的N-端部分，尤其是第7位(每条肽的一级序列编号)的氨基酸残基对配体选择十分关键(Moon等人，MolecularCells,2010,30,149-154)。因此，在我们的研究概况中，基于GIP(1-29)序列，首先引入Thr7以引发GLP-1R激动活性。而且，随后进行Tyr13和Glu15取代以加强GLP-1的活性，并进行Aib2取代以赋予DPP-1V稳定性。[0300]所获得的GIP类似物(SEQIDNO:3)在CHO/hGLP-lR细胞筛选中与天然的GLP-1相比显示出几乎0.2%的GLP-1R激动活性，远远优于最初的结构骨架(SEQIDNO:1);同时，在CHO/hGIPR细胞筛选中，与天然的GIP相比，其显示有77.7%的GIPR激动活性。这表明GIPR能够很好地耐受上述位点的取代。虽然其在GLP-1R上的活性还十分低，但是通过进一步的修饰提高其GLP-1R刺激活性同时保持其GIP的活性值得作进一步的探究。[0301]第二轮的修饰基于类似物003的骨架，并且主要分别集中在位点13和位点22。就Tyr13而言，可以将其4’位的羟基基团以氟取代(SEQIDNO:4)，以硝基取代(SEQIDN0:5、8和15);或将Tyr13以Phe13取代(SEQIDN0:7和11)，以苯基甘氨酸残基13取代(SEQIDNO:9)。同时，就Phe22而言`，分别在该位点上以Tyr残基取代(SEQIDNO:12)，以Tyr(4_Me)残基取代(SEQID勵:13)，用？1^(44)残基取代(SEQIDNO:14)。在手动操作固相肽合成中，由于氧气的介入偶尔观察到了氧化的Met14(SEQIDN0:4、5、6和7)。为了避免手动操作过程中的氧化，后来采用了Met生物电子等排体正亮氨酸(norleucine)来取代Met(SEQIDN0:8-13、14和16-17)。不幸的是，所有这些修饰的类似物其体外GLP-1活性都低于类似物003，并且观察到有些修饰的类似物甚至具有较低的GIP活性。[0302]在第17位到第19位用Glu-Ala-Glu和Glu-Ala-Gln取代(SEQIDNO:16)也没有引发更多的GLP-1活性(与天然GLP-1相比，激动活性还是小于1%)。另外，来自利拉鲁肽的某些氨基酸残基Val27和Arg28的取代(SEQIDNO:17)的确能够增加GLP-1活性，与天然GLP-1相比具有大约5%的活性；然而，它的GIP活性相比天然GIP下降到了仅有21%。因此，必须探索新的策略，引入更多的GLP-1特征的氨基酸残基以获得满意的体外GLP-1R和GIPR活性。[0303]通过引入GLP-1特征性半体作进一步修饰[0304]将来自GLP-1序列和exendin-4序列的中段和C-端的确定氨基酸残基合并入我们优选的骨架(SEQIDN0:3)。并且基于受体识别的考虑，N-端区(1-16位)作为高度保留区域。所设计的杂合肽(SEQIDNO:18、19、20和21)的序列比对如下所示。为了便于本文的说明，GLP-1下标氨基酸名称是按照加工的肽的一级序列编号的(即，GLP-l^^GLP-l^^)。[0305]【权利要求】1.一种源自GIP(1-29，SEQIDNO:1)的GIP类似物，其中GIP类似物具有GLP-1的激动活性和GIPR刺激活性，并包含如下述通式I所示的氨基酸序列:Tyr-A2-A3-Gly-Thr-Phe-A7-Ser-Asp-Tyr-Ser-A12-A13-A14-A15-Lys-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-Trp-Lue-A27-A28-A29-Y其中:A2选自由Ala、Gly、肌氨酸、Aib、d-Ala和d_Ser组成的组；A3选自由Glu和Gln组成的组；A7选自由Thr、Ile和Ser组成的组；A12选自由lie、Glu和Asp组成的组；A13选自由具有芳香基团的氨基酸残基组成的组并选自Tyr、Phe,Phe(4_F)、Phe(4-N02)、Phe(4_NH2)、Ala、Ala(2-噻吩基)、Ala(苯并噻吩基)、Ala(4-吡啶基)和苯基甘氨酸；A14选自由Met或氧化的Met、Leu、Val、正亮氨酸和Ile组成的组；A15选自由Glu和Asp组成的组；A17选自由lie、Glu和Gln组成的组；A18选自由Ala和His组成的组；A19选自由Val、Ala、Leu、Gln和Ile组成的组；A20选自由Arg、Lys-Z、Gin、Glu、Asp和Cys-Z组成的组；A21选自由Glu、Asp和Leu组成的组；A22选自由Phe,Phe(4-F)、Phe(4-C1)、Tyr、Tyr(4_Me)和Nal组成的组；A23选自由Ile和Val组成的组；A24选自由Ala、Asn、Glu、Lys-Z和Cys-Z组成的组；A27选自由Val、Leu、Ala和Lys-Z组成的组；A28选自由Lys-Z、Ala、Arg和Asn组成的组；A29选自由Gly、Gln和Arg组成的组；Y选自由A30和-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser_A40或缺失组成的组；A30和A40独立地选自由-(Lys)n-Z和-Cys-Z或缺失组成的组；Z选自由-(Glu)m_PEG、-(Glu)m-生物素和-(Glu)m-脂肪酸或缺失组成的组；n是选自I到6的整数；m是选自O到3的整数；其中，在GIP类似物的第i位和第i+4位的氨基酸之间任选地形成内酰胺桥；i是选自12到24的整数；或其药学上可接受的盐。2.根据权利要求1所述的GIP类似物，其中，在通式I中:A3是Glu；A13选自由具有芳香基团的氨基酸残基组成的组并选自Tyr、Phe,Phe(4_F)、Phe(4-N02)、Phe(4_NH2)、Ala(2_噻吩基)、Ala(苯并噻吩基)和苯基甘氨酸；A15是Glu；A18是Ala；A19选自由Val和Ala组成的组；A20选自由Arg、Lys-Z、Glu、Asp和Cys-Z组成的组；A21选自由Glu和Leu组成的组；A22是Phe；A23是Ile；A27选自由Val和Lys-Z组成的组；A28选自由Lys-Z和Asn组成的组；且A29是Gly；Z选自由-(Glu)m_PEG、-(Glu)m-生物素和-(Glu)m-脂肪酸或缺失组成的组；m是选自O到3的整数。3.根据权利要求1-2任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中，Y是A30或缺失；A30选自由-(Lys)n-Z和-Cys-Z或缺失组成的组；Z选自由-(Glu)m_PEG、-(Glu)m-生物素和-(Glu)m-脂肪酸或缺失组成的组；n是选自I到6的整数；m是选自O到3的整数。4.根据权利要求1-2任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中，Y是-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-A40；A40选自由-(Lys)n-Z和-Cys-Z或缺失组成的组；Z选自由-(Glu)m_PEG、-(Glu)m-生物素和-(Glu)m-脂肪酸或缺失组成的组；n是选自I到6的整数；m是选自O到3的整数。5.根据权利要求1-3任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中:Y是缺失。6.根据权利要求1、2和4任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中:Y是Gly-Pix)-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro—Ser。7.根据权利要求1-6任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中:A7是Thr。8.根据权利要求1-7任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中:A2是Aib。9.根据权利要求1-8任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中:A13是Tyr。10.根据权利要求1-9任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中:A17是Glu。11.根据权利要求1-10任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中:A19是Val。12.根据权利要求1-11任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中:A20是Arg。13.根据权利要求1-12任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中:A24是Cys-Z；Z是-(Glu)m-PEG;m是选自0到3的整数。14.根据权利要求1-13任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中:A30和A40独立地是-(Lys)n-Z；Z选自由-(Glu)m_PEG、-(Glu)m-生物素和-(Glu)m-脂肪酸或缺失组成的组；N是选自I到6的整数；M是选自0到3的整数。15.根据权利要求1-14任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中:Z选自由-(Glu)m-PEG和-(Glu)m-脂肪酸组成的组；m是选自O到2的整数，例如Glu是Y-Glu。16.根据权利要求1-15任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中:Z是-(Glu)m-PEG;M是选自O到2的整数，例如Glu是Y-Glu。17.根据权利要求1-15任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中:Z选自由-(Glu)m-脂肪酸组成的组；M是选自O到2的整数，例如Glu是Y-Glu。18.根据权利要求1-17任意一项所述的GIP类似物，其中在通式I中，在GIP类似物的第i位和第i+4位的氨基酸之间形成内酰胺桥；i是选自12、16和24的整数。19.根据权利要求1-18任意一项所述的GIP类似物，其中脂肪酸选自由肉豆蘧酸、棕榈酸、硬脂酸和胆酸组成的组。20.根据权利要求1-19任意一项所述的GIP类似物，其中PEG的分子量选自5kDa_40kDa,例如20kDa、30kDa或40kDa。21.根据权利要求1-19任意一项所述的GIP类似物，其中GIP类似物或其药学上可接受的盐所包括的氨基酸序列选自由SEQIDNO:65、2-64和66-98所示的序列组成的组。22.根据权利要求1-21任意一项所述的GIP类似物，其中GIP类似物或其药学上可接受的盐所包括的氨基酸序列选自由SEQIDN0:3、18、19、20、21、35、45、52、63、65、72、74、80,97和98所示的序列组成的组。23.根据权利要求1、2和4-22任意一项所述的GIP类似物，其中GIP类似物或其药学上可接受的盐所包括的氨基酸序列选自由SEQIDNO:52、72和74所示的序列组成的组，其中所述序列具有在第20位、24位和/或C-末端连接的至少一个脂肪酸半体。24.根据权利要求1、2和4-22任意一项所述的GIP类似物，其中GIP类似物或其药学上可接受的盐所包括的氨基酸序列选自由SEQIDNO:65、74和98所示的序列组成的组，其中所述序列具有在第20位、24位和/或C-末端连接的至少一个PEG半体。25.根据权利要求1、2和4-22任意一项所述的GIP类似物，其中GIP类似物或其药学上可接受的盐包括SEQIDNO:74所示的氨基酸序列，其具有在第24位连接的PEG半体和在C-末端连接的脂肪酸半体。26.—种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-25任意一项所述的GIP类似物、药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂，和任选的抗糖尿病剂，所述抗糖尿病剂选自胰岛素类、双胍类、磺酰脲类、罗格列酮或匹格列酮、a-葡萄糖苷酶抑制剂以及氨基二肽酶IV抑制剂。27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中药物组合物的形式为注射剂或冻干粉的形式。28.根据权利要求1-25任意一项所述的GIP类似物或其药学上可接受的盐或根据权利要求26或27所述的药物组合物，其用于治疗代谢疾病。29.根据权利要求1-25任意一项所述的GIP类似物或其药学上可接受的盐或根据权利要求26或27所述的药物组合物，其中代谢疾病选自由糖尿病、肥胖症和骨质疏松症组成的组。30.权利要求1-25任一项所述的GIP类似物或其药学上可接受的盐或权利要求26或27所述的药物组合物在制备用于治疗代谢疾病的药物中的用途。31.根据权利要求30所述的用途，其中代谢疾病选自由糖尿病、肥胖症和骨质疏松症组成的组。32.—种治疗和/或预防代谢疾病的方法，其包括向有此需求的受试者施予有效量的权利要求1-25任意一项所述的GIP类似物或其药学上可接受的盐或权利要求26或27所述的药物组合物。33.根据权利要求32所述的方法，其中代谢疾病选自由糖尿病、肥胖症和骨质疏松症组成的组。34.一种在体内和/或体外同时激活GIP和GLP-1受体的方法，其包括将权利要求1-25任意一项所述的GIP类似物或其药学上可接受的盐与GIP和GLP-1受体接触。【文档编号】A61P3/04GK103764673SQ201280028164【公开日】2014年4月30日申请日期:2012年6月8日优先权日:2011年6月10日【发明者】马涛,许树森,刘志军,张波,沈宁,杨海,张炜,李玉花,文圣焕,金孟燮申请人:北京韩美药品有限公司