用于神经保护的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本文公开了用于为内耳中的神经元提供神经保护的方法和试剂盒及治疗内耳疾病和病症，包括耳鸣和美尼尔氏症的方法。
【专利说明】用于神经保护的方法和组合物
[0001]相关申请
[0002]本申 请要求2011年11月3日提交的标题为“Compositions and Methods ForTreatingMeniereJ sDisease”的美国临时申请序列 N0.61/554，982 和 2012 年 6 月 25 日提交的标题为“Compositions and Methods For TreatingM6ni6re’sDisease”的美国临时申请序列N0.61/663，627的权益，其通过引用整体并入本文并用于所有目的。
[0003]序列表
[0004]本申请通过引用并入命名为“240_PCT1_ST25.txt”，大小为33kb并于2012年11月I日以IBM-PCT机器格式创建，具有与MS-Windows的操作系统兼容性的文件中存在的核
苷酸和/或氨基酸序列。
【技术领域】
[0005]本文提供了靶向CASP2、N0X3、CAPNS1或RHOA的双链RNA化合物，用于受试者耳内神经元的神经保护和丧失的耳蜗和/或前庭功能的恢复和/或伴随症状的缓解的用途。进一步提供了用于治疗处于美尼尔氏症(Μ?η--re’ sdisease)或类似疾病和病症的风险或患有美尼尔氏症或类似疾病和病症的受试者的方法和试剂盒。
[0006]发明背景
[0007]人耳由3个主要结构组件组成:外耳、中耳和内耳，一起起到将声波转换为神经冲动的作用，神经冲动传送到大脑，在大脑内将神经冲动感知为声音。内耳也帮助维持平衡。
[0008]中耳和内耳的解剖对于本领域的普通技术人员而言众所周知(见，例如，Atlasof Sensory Organs:Functional and Clinical Analysis,Andrs CsiIlag，HumanaPress (2005)，第1_82页，通过引用并入本文)。简言之，中耳由鼓膜和含有3个称为听小骨的小骨头的小充气室组成，听小骨连接鼓膜与内耳。
[0009]内耳(迷路)是由听觉器官耳蜗和平衡器官前庭系统组成的复杂结构。前庭系统由决定位置感觉的球囊和椭圆囊及帮助维持平衡的半规管组成。
[0010]耳蜗收容部分由约20，000个称为“内耳毛细胞”或“毛细胞”的特化感觉细胞组成的Corti器官。这些细胞具有延伸到耳蜗流体中的小发际突出部分(纤毛)。从中耳内的听小骨发射到内耳中的卵圆窗的声振动引起流体和纤毛振动。耳蜗不同部分的毛细胞响应于不同声频振动并且将振动转换为神经冲动，神经冲动发送到大脑进行处理和解释。内耳毛细胞被内耳支持细胞包围。支持细胞位于内耳中的感觉毛细胞之下，至少部分包围并物理上支持感觉毛细胞。支持细胞的代表性实例包括内杆(柱细胞)、外杆(柱细胞)、内指细胞、外指细胞(Deiters)、Held细胞、Hensen细胞、Claudius细胞、Boettcher细胞、齿间细胞和听齿(Huschke)。
[0011]螺旋神经节是将一种声音表现从耳蜗发送到大脑的一类神经细胞。在耳蜗的螺旋结构中发现螺旋神经节神经元的细胞体并且是中枢神经系统的一部分。其树突产生与毛细胞基部的突触性接触，并且其轴突捆在一起形成第八脑神经(前庭蜗神经)的听觉部分。前庭神经节(也称为史卡巴神经节(Scarpa’s ganglion))是前庭神经的神经节,其含有周围突与前庭感觉末梢器官的毛细胞形成突触性接触的双极初级传入神经元的细胞体。
[0012]美国专利申请公布N0.20090162365和20110112168涉及siRNA化合物、包含SiRNA化合物的组合物及其用于治疗与促凋亡基因表达相关的疾病和病症的使用方法。
[0013]美国专利N0.7，825，099涉及通过抑制促凋亡基因治疗听力损伤的方法。
[0014]美国专利N0.8，088, 359和美国专利申请公布N0.20120252868涉及治疗听力丧失和幻听的方法。
[0015]美国专利申请公布N0.20110142917公开了将dsRNA分子递送到耳内的非侵入性方法。
[0016]美国专利申请公布N0.20110034534尤其涉及靶向CAPNSl的dsRNA分子。
[0017]美国专利申请公布N0.20110229557涉及用于治疗眼病的各种基因靶标(包括CASP2)的 dsRNA 分子。
[0018]PCT 专利公布 N0.W02011/163436 公开了靶向 RHOA 的 dsRNA。
[0019]耳鸣和美尼尔氏症在全世界影响了许多人并且当前疗法在预防神经元变性和伴随听力丧失的进展上尚未成功。保护内耳神经元，包括毛细胞及螺旋和前庭神经节细胞，免受损伤和细胞死亡(例如，凋亡)，从而减少或预防听力丧失(例如在美尼尔氏症患者中)的治疗性治疗将非常可取。相应地，一方面提供了使用先前不知道具有此类活性的dsRNA化合物，用于受试者，包括患有耳鸣或美尼尔氏症或有类似症状的人受试者的耳内神经元的神经保护的方法。
[0020]发明概述
[0021]本发明涉及为受试者耳内的神经元，例如螺旋神经节细胞和前庭神经节细胞提供神经保护的方法和试剂盒。一方面，本文公开了一种双链RNA(dsRNA)化合物，其下调编码具有 SEQ ID NO: 1-3,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5_6 或 SEQ ID NO:7 中任一个列出的序列的mRNA的CASP2基因、N0X3基因、CAPNSl基因或RHOA基因的表达，用于有需要的受试者耳内神经元的神经保护。在各个方面提供了为耳内神经元提供神经保护的方法，所述方法包括向所述受试者的耳部施用治疗有效量的下调CASP2基因、N0X3基因、CAPNSl基因或RHOA基因的表达的双链RNA (dsRNA)分子化合物，从而为所述受试者耳内的神经细胞提供神经保护。在一些实施方案中，所述神经元为神经节。在一些实施方案中，所述神经元包含在神经节内。在一些实施方案中，所述神经元包含螺旋神经节细胞和/或前庭神经节细胞。在一些实施方案中，CASP2基因编码具有SEQ ID NO: 1_3中任一个列出的序列的mRNA。在一些实施方案中，N0X3基因编码具有SEQ ID N0:4中列出的序列的mRNA。在一些实施方案中，CAPNSl基因编码具有SEQ ID NO:5_6中任一个列出的序列的mRNA。在一些实施方案中，RHOA基因编码具有SEQ ID NO: 7中列出的序列的mRNA。在一些实施方案中，CASP2为优选靶基因并且在优选实施方案中dsRNA分子化合物包含具有SEQ ID N0:8中列出的核苷酸序列的有义链和具有SEQ ID N0:9中列出的核苷酸序列的反义链。在一些实施方案中神经保护包括减少、预防或降低神经元细胞死亡，优选凋亡性细胞死亡。根据一些实施方案，神经元的细胞死亡与疾病或病症、局部 缺血、物理/机械创伤、对化学试剂或传染物的暴露、免疫反应或营养失衡中的一项或多项相关。在一些实施方案中神经元的细胞死亡与局部缺血相关。在一些实施方案中神经元的细胞死亡与疾病或病状相关。在一些实施方案中，所述疾病为遗传性疾病或病症。在各个实施方案中，所述疾病或病状选自与听觉器官病理异常相关的病症和与前庭器官病理异常相关的病症。在一些实施方案中，听觉器官为Corti器官。前庭神经节是第八脑神经前庭部分的感觉神经节，位于内耳道外侧端的上部。在一些实施方案中，前庭器官选自椭圆囊、球囊、内耳道和壶腹。
[0022]在一些实施方案中，所述受试者患有或处于发展一种或多种疾病或病状或其选自阵发性眩晕、听力丧失、耳鸣和耳胀的症状的风险。在某些实施方案中，所述受试者患有或易于发展美尼尔氏症。
[0023]在一些实施方案中，本文提供了一种治疗患有美尼尔氏症的受试者的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的下调CASP2、N0X3、RHOA或CAPNSl基因的表达的dsRNA化合物，从而治疗所述受试者。
[0024]在一些实施方案中，所述方法包括减弱患有美尼尔氏症的受试者中美尼尔氏症的症状，包括向所述受试者施用治疗有效量的下调CASP2、N0X3、RHOA或CAPNSl基因的表达的dsRNA化合物，从而减弱美尼尔氏症的症状。在一些实施方案中，所述症状包括耳鸣、进行性听力丧失、ELH、眩晕、恶心或耳胀中的一种或多种。在一些实施方案中所述方法包括缓解美尼尔氏症的一种或多种症状。在一些实施方案中所述方法提供了听力的部分恢复或完全恢复。
[0025]在一些实施方案中所述方法和试剂盒包括在受试者中挽救螺旋神经节和/或前庭神经节免于凋亡。在一些实施方案中所述方法包括促进螺旋神经节和/或前庭神经节的存活。在一些实施方案中所述方法包括预防受试者中螺旋神经节细胞和或前庭神经节细胞的凋亡性细胞死亡。在一些实施方案中所述方法包括提供受试者中螺旋神经节细胞和或前庭神经节细胞的神经保护。在一些实施方案中所述方法包括恢复受试者中的耳蜗功能。耳蜗功能包括部分或完全恢复听力。在一些实施方案中所述方法包括恢复受试者中的前庭功能。前庭功能包括部分或完全恢复平衡。
[0026]进一步提供了治疗患有美尼尔氏症的受试者的试剂盒，其包含治疗有效量的下调CASP2、N0X3、RH0A或CAPNSl基因的表达的dsRNA化合物。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括向受试者施用dsRNA化合物的装置；并且任选包括使用说明。在一些实施方案中，所述试剂盒包含下调CASP2基因的表达的dsRNA化合物。在优选实施方案中，CASP2基因编码SEQ ID NO: 1-3中任一个列出的mRNA。在优选实施方案中，所述试剂盒提供了包含具有SEQ ID N0:8中列出的核苷酸序列的有义链和具有SEQ ID N0:9中列出的核苷酸序列的反义链的dsRNA化合物。
[0027]在一些实施方案中，所述方法和试剂盒牵涉使用dsRNA化合物(例如，短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA))，其结合编码选自SEQ IDNO: 1-3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5-6 和 SEQ ID NO: 7 分别例示的 CASP2、N0X3、CAPNSl 和RHOA的人靶基因的核苷酸序列(例如mRNA序列)。在优选实施方案中，所述方法和试剂盒牵涉使用结合SEQ ID 1-3中任一个列出的人CASP2 mRNA的dsRNA化合物。
[0028]在优选实施方案中，CASP2 dsRNA化合物包含有义链和反义链，其中所述反义链包含核苷酸序列(5’ >3’ ) AGGAGUUCCACAUUCUGGC (SEQ ID NO: 9)。在优选实施方案中，dsRNA化合物具有结构:
[0029]5' z" -GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z' 3'(有义链，SEQ ID NO:8)
[0030]3' z-CGGUCUUACACCUUGAGGA 5'(反义链，SEQ ID NO:9)[0031]其中每个A、C、U和G均为未经修饰的核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸或非常规部分并且每个连续核糖核苷酸或非常规部分通过共价键与下一个核糖核苷酸或非常规部分连接；
[0032]其中Z和Z’的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在，独立地包括在其所在链的3’端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合；并且
[0033]其中z”可能存在或不存在，但是如果存在，为在所述有义链的5’端共价连接的加帽部分。在一些实施方案中，dsRNA化合物包含未经修饰和经修饰的核糖核苷酸。在优选实施方案中，dsRNA化合物包含未经修饰和经修饰的核糖核苷酸至少一个非常规部分。
[0034]在一些实施方案中，dsRNA进一步包含至少一个非常规部分。在某些优选实施方案中，CASP2dsRNA具有结构:
[0035]5' z" -GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z' 3'(有义链，SEQ ID NO:24)
[0036]3' z-CGGUCUUACACCUUGAGGA 5'(反义链，SEQ ID NO:25)
[0037]其中每个A、C、U和G均为未经修饰或经修饰的核糖核苷酸或非常规部分并且每个连续核糖核苷酸或非常规部分通过磷酸二酯键与下一个核糖核苷酸或非常规部分连接；其中所述有义链包含，从5’端开始计数，在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17和19的未经修饰的核糖核苷酸、位置18的L-脱氧胞苷；其中所述反义链包含至少五
(5)个交替的未经修饰和经2’ -O-甲基糖修饰的核糖核苷酸；并且其中z”、Z和V任选不存在。在一些实施方案中，反义链包含位置(5’ >3’)1、3、5、79、11、13、15、17和19存在的经2’ -O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和位置2、4、6、8、10、12、14、16和18存在的未经修饰的核糖核苷酸；优选地，反义链包含位置(5’ >3’)2、4、6、8、11、13、15、17和19上经2’ O-甲基糖修饰的核糖核苷酸。
[0038]在优选实施方案中，dsRNA化合物具有结构:
[0039]5' iB-GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z' 3'(有义链，SEQ ID NO:26)
[0040]3' Z-CGGUCUUACACCUUGAGGA5'(反义链，SEQ ID NO:27)
[0041]其中每个A、C、U和G均为未经修饰的核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸或非常规部分并且每个连续核糖核苷酸或非常规部分通过共价键与下一个核糖核苷酸或非常规部分连接；
[0042]其中每个Z和Z’均不存在，其中所述有义链包含，从5’端开始计数，在位置1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和19的未经修饰的核糖核苷酸、位置18的L-脱
氧胞苷并且z”存在且包含反向脱氧脱碱基部分；并且
[0043]其中所述反义链包含，从5’端开始计数，在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19的每一处的2’0_甲基糖修饰的核糖核苷酸和在位置1、3、5、7、9、10、12、14、16和18的每一处的未经修饰的核糖核苷酸。这种分子也称为1007。
[0044]dsRNA化合物通过常规施用途径的任一种施用，包括牵涉侵入性和非侵入性递送方法。应该注意的是，dsRNA化合物可作为化合物本身或作为药学上可接受的盐施用或可单独施用或作为活性成分与药学上 可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和媒介物组合施用。
[0045]dsRNA化合物优选经鼓室，包括局部或经注射施用。可制备液体形式进行施用。液体组合物包括有或无有机共溶剂的水溶液、水或油悬浮液、具有食用油的乳液以及类似药物媒介物。在一个实施方案中，施用包括局部施用，尤其是向耳道的局部施用、向鼓膜的局部施用或其组合，从而使dsRNA化合物通过鼓膜。在一些实施方案中，将本申请的化合物作为滴耳剂施加鼓膜上。在一些优选实施方案中，通过经鼓室注射或通过滴耳剂施用dsRNA化合物。
[0046]在各个实施方案中，特别是局部施用本发明的药物组合物的实施方案中，药物组合物进一步包含也称为促渗剂的渗透性促进剂。
[0047]在各个实施方案中，促渗剂选自促进治疗性寡核苷酸渗透过患有美尼尔氏症的受试者耳内的鼓膜的任何化合物或两种或更多种化合物的任何组合。在某些实施方案中，渗透性促进剂为多元醇。在一些实施方案中，寡核苷酸与多元醇混合。在一些实施方案中，多元醇选自甘油、丙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇及其组合。
[0048]根据一个实施方案，多元醇为甘油。在各个实施方案中，按药物组合物的体积计，甘油存在的最终浓度为约0.1 %至约35%、约I %至约30%、约5%至约25%，优选约10%至约20%。
[0049]在一些实施方案中，当受试者的头部斜向一侧而治疗的耳部朝上时，向耳道施加药物组合物。在一些实施方案中，对于液体而言使用容器，例如使用(例如)10-100μ I/滴的滴管或管芯向耳部施加药物组合物。
[0050]本发明的另一实施方案提供了以上任一组合物在制备用于治疗患有美尼尔氏症的受试者的药剂中的用途。进一步提供了抑制CASP2的表达，为有需要的受试者耳内的神经元提供神经保护的化合物。
[0051]现将描述的方法、材料和实施例仅为说明性而非旨在限制；与本文所述材料和方法类似或等效的材料和方法可用于本发明的实践或试验中。本发明的其它特征和优点从下列发明详述和权利要求中将显而易见。
[0052]本公开旨在包括在本文各个实施方案中公开的特征组合的任何和所有改编或变化。虽然本文已经说明和描述了特定实施方案，但是应认识到，本发明涵盖这些实施方案的特征的任何排列以达到相同目的。查看本说明书后，对于本领域的技术人员而言，以上形成本文未特别描述的实施方案的特征的组合将显而易见。
[0053]附图简述
[0054]图1示出了野生型(左图)和Phexhyp_Duk突变(右图)内耳组织的组织切片。箭头示出了内淋巴积水(ELH)。在左下图中，G指螺旋神经节神经元，而在右下图中M指突变螺旋神经节神经元，其中在Phexhyp_Duk突变小鼠中的更少(比较G与M)。Phexhyp_Duk突变小鼠自发发展内淋巴积水并因此呈现平衡问题和听力丧失表现型。主要缺陷之一是因细胞死亡或凋亡引起内耳神经节(前庭和螺旋)中的神经元损失。
[0055]图2示出了通过滴耳剂递送对siRNA安全性评估的实验设计。“Px”指产后X天。
[0056]图3为柱状图，显示用dsRNA或媒介物滴耳剂对内耳的每周治疗不影响野生型小鼠的听力功能。
[0057]图4A和4B示出了测试试验分子在鼠美尼尔氏症模型中保护听力功能的功效的实验设计。(P15、P29、P90-产后天数；在P15之前递送siRNA不可能，因为耳通道关闭；P29_30之前的ABR测量在技术上不可能)。
[0058] 图5A-?示出了对阴性对照(经媒介物治疗或经SiEGFP治疗)或经siRNA治疗的Phexhyp-Duk/Y小鼠的听力功能(ABR)的时程分析。图上的数据示出在指定试验声频(kHz)下的听觉诱发脑干反应(ABR)阈值(db)。图5E为柱状图，显示与经媒介物治疗和经siEGFP治疗的动物相比，在P90时经siRNA治疗的动物体内ABR相对提高。
[0059]图6A-6F示出了 PhexhylrfluVY小鼠内耳神经元的组织学评估和siCASP2(1007)对螺旋和前庭神经节提供的显著神经保护。图6A和6B中的箭头示出了螺旋神经节(SG)。图6A和6B示出了经媒介物治疗的Phexhyp_Duk/Y小鼠SG的病症和死亡并且图6B和6D示出了对经siCASP2治疗的Phexhyp_Duk/Y小鼠SG的挽救。图6E和6F分别示出了经媒介物治疗的phexhyp-Duk/Y小鼠和经siCASP2治疗的pheXhW_Duk/Y小鼠中前庭神经节的单独组织切片。
[0060]图7A-7D示出了 PheXhyp_Duk/Y小鼠内耳神经元的组织学评估和与经媒介物治疗和经 siEGFP 治疗的动物(图 7A)相比，siCAPNSI (图 7B)、siN0X3(图 7C)和 siRH0A(图 7D)对螺旋神经节提供的显著神经保护。
[0061]图8A-8D示出了 PheXhyp_Duk/Y小鼠内耳神经元的组织学评估和与经媒介物治疗和经 siEGFP 治疗的动物(图 8A)相比，siCAPNSI (图 8B)、siN0X3(图 8C)和 siRH0A(图 8D)对前庭神经节提供的显著神经保护。
[0062]图9A和9B示出了在P90时对经siCASP2治疗的耳内螺旋神经节细胞的保护。
[0063]发明详述
[0064]本申请提供了寡核苷酸分子、包含寡核苷酸分子的组合物、其使用方法和治疗美尼尔氏症和改善一种或多种伴随症状，包括波动性听力丧失、阵发性眩晕和/或耳鸣的试剂盒。本发明部分基于发现对选自半胱天冬酶2 (CASP2)、NADPH氧化酶3 (N0X3)、钙蛋白酶SI (CAPNSl)和Ras同源基因家族成员A(RHOA)中的任一靶基因的抑制。
[0065]一方面，本文提供了一种对有需要的受试者的螺旋神经节细胞和/或前庭神经节细胞提供神经保护的方法，包括向受试者施用治疗有效量的抑制CASP2表达的寡核苷酸分子，从而在螺旋神经节细胞和/或前庭神经节细胞中提供神经保护。另一方面，本文提供了一种治疗患有美尼尔氏症的受试者的方法，包括向受试者施用抑制CASP2表达的寡核苷酸分子，从而治疗患者。美尼尔氏症，也称为特发性内淋巴积水(ELH)，是导致眩晕和耳鸣的内耳病症，并且最终神经元损害导致听力丧失。美尼尔氏症的确切原因未知，但是认为潜在机制是归因于内淋巴积累的膜迷路变形。内淋巴主要由耳蜗中的血管纹产生并且也由半月板和前庭迷路中的暗细胞产生(Saj jadi H, Paparella MM.M6ni6re’s disease.Lancet.372(9636):406-14)。如果内淋巴从内淋巴流动空间通过前庭导水管流到内淋巴囊受阻，则可发生内淋巴积水。美尼尔氏症可影响受试者的一只或两只耳朵。与美尼尔氏症相关的主要病态是眩晕虚弱性和进行性听力丧失。
[0066]在各个实施方案中，所述方法包括减轻受试者的听力丧失。在一些实施方案中，所述方法包括预防患有美尼尔氏症的受试者的进行性听力丧失。在一些实施方案中，所述方法包括保护螺旋神经节细胞免于细胞死亡。在一些实施方案中，所述方法包括保护前庭神经节细胞免于细胞死亡。
[0067]在一个优选实施方案中，受试者为哺乳动物,优选为人受试者。
[0068]在各个实施方案中，下调CASP2的分子为半胱天冬酶2抑制剂，例如双链RNA寡核苷酸，任选siNA，更优选在下文表A中详述的dsRNA分子并且尤其是，包含下列反义序列5’ AGGAGUUCCACAUUCUGGC (也称为CASP2_4)的siNA，并且使用这种寡核苷酸制备用于治疗本文公开的病状和病症的药剂。在一个实施方案中，所述病症牵涉螺旋神经节死亡或前庭神经节死亡。在一些实施方案中，细胞死亡包括凋亡性细胞死亡。
[0069]表A:用于本文公开的方法中的半胱天冬酶2寡核苷酸序列的非限制性实例
【权利要求】
1.一种双链RNA(dsRNA)化合物，其下调编码具有SEQ ID NO: 1_3中任一个列出的序列的mRNA的CASP2基因的表达，用于有需要的受试者耳内神经元的神经保护。
2.一种为有需要的受试者的耳内神经元提供神经保护的方法，其包括向所述受试者的耳部施用治疗有效量的下调CASP2基因的表达的双链RNA (dsRNA)化合物，其中所述CASP2基因编码具有SEQ ID NO: 1-3中任一个列出的序列的mRNA，从而为所述受试者耳内的神经元提供神经保护。
3.根据权利要求1或2所述的用途或方法，其中所述dsRNA化合物包含具有SEQIDN0:8中列出的核苷酸序列的有义链和具有SEQ ID N0:9中列出的核苷酸序列的反义链。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途或方法，其中所述神经元是神经节或包含在神经节内。
5.根据权利要求4所述的用途或方法，其中所述神经节为螺旋神经节或前庭神经节。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用途或方法，其中所述神经保护包括保护所述神经元免于细胞死亡。
7.根据权利要求6所述的用途或方法，其中所述神经元的细胞死亡包括凋亡性细胞死亡。
8.根据权利要求6或7所述的用途或方法，其中所述神经元的细胞死亡与疾病或病症、局部缺血、物理/机械创伤、化学试剂、传染物、免疫反应和营养失衡中的一项或多项相关。
9.根据权利要求8所述的用途或方法，其中所述神经元的细胞死亡与疾病或病症相关。
10.根据权利要求1或2所述的用途或方法，其中所述受试者患有或处于发展与听觉器官或前庭器官病理异常相关的一种或多种疾病或病状的风险。
11.根据权利要求10所述的用途或方法，其中所述疾病或病状与选自阵发性眩晕、听力丧失、耳鸣和耳胀的症状相关。
12.根据权利要求10所述的用途或方法，其中所述受试者患有或易患美尼尔氏症。
13.根据权利要求1或2所述的用途或方法，其中所述神经保护包括恢复耳蜗功能和或前庭功能。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的用途或方法，其中所述dsRNA化合物下调所述受试者内耳中细胞内的CASP2表达。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的用途或方法，其中所述dsRNA化合物具有结构: 5’z" -GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z’3’(有义链，SEQ ID NO:24) 3’Z-CG⑶CUUACACCUUGAGGA5’(反义链，SEQ ID NO:25) 其中每个A、C、U和G均为未经修饰或经修饰的核糖核苷酸或非常规部分并且每个连续核糖核苷酸或非常规部分通过磷酸二酯键与下一个核糖核苷酸或非常规部分连接；其中所述有义链包含，从5，端开始计数，在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和19的未经修饰的核糖核苷酸、位置18的L-脱氧胞苷；其中所述反义链包含至少5个交替的未经修饰和经2’ -O-甲基糖修饰的核糖核苷酸；并且其中z”、Z和V是任选的。
16.根据权利要求15所述的用途或方法，其中所述共价键为磷酸二酯键；其中每个Z和Z’均不存在，其中所述有义链包含，从5’端开始计数，在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、。11、12、13、14、15、16、17和19的未经修饰的核糖核苷酸、位置18的L-脱氧胞苷(在SEQ IDNO:24中列出);并且其中所述反义链包含，从5’端开始计数，在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19的每一处的2’ O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和在位置1、3、5、7、9、10、12、14、16和18的每一处的未经修饰的核糖核苷酸(在SEQ ID NO:25中列出)。
17.根据权利要求16所述的用途或方法，其中z”与所述有义链(SEQID NO: 26)的5端共价连接并且包含反向脱氧脱碱基部分。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的用途或方法，其中配制所述dsRNA分子用于经鼓室施用。
19.根据权利要求18所述的用途或方法，其中将所述dsRNA分子配制成滴耳剂。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的用途或方法，其中所述受试者为哺乳动物。
21.根据权利要求20所述的用途或方法，其中所述受试者为人。
22.—种双链RNA(dsRNA)化合物，其下调编码具有SEQ ID NO: 5_6中任一个列出的序列的mRNA的CAPNSl基因的表达，用于有需要的受试者耳内神经元的神经保护。
23.一种为有需要的受试者的耳内神经元提供神经保护的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的下调CAPNSl基因的表达的双链RNA (dsRNA)分子，其中所述CAPNSl基因编码具有SEQ ID NO: 5-6中任一个列出的序列的mRNA,从而为所述受试者耳内的神经元提供神经保护。
24.根据权利要求22或23所述的用途或方法，其中所述神经元是神经节或包含在神经节内。
25.根据权利要求24所述的用途或方法，其中所述神经节为螺旋神经节或前庭神经节。
26.根据权利要求22或23所述的用途或方法，其中所述神经保护包括保护所述神经元免于细胞死亡。
27.根据权利要求26所述的用途或方法，其中所述神经元的细胞死亡包括凋亡性细胞死亡。
28.根据权利要求26或27所述的用途或方法，其中所述神经元的细胞死亡与疾病或病症、局部缺血、物理/机械创伤、化学试剂、传染物、免疫反应和营养失衡中的一项或多项相关。
29.根据权利要求28所述的用途或方法，其中所述神经元的细胞死亡与疾病或病症相关。
30.根据权利要求22或23所述的用途或方法，其中所述受试者患有或处于发展与听觉器官或前庭器官病理异常相关的一种或多种疾病或病状的风险。
31.根据权利要求30所述的用途或方法，其中所述疾病或病状与选自阵发性眩晕、听力丧失、耳鸣和耳胀的症状相关。
32.根据权利要求31所述的用途或方法，其中所述受试者患有或易患美尼尔氏症。
33.根据权利要求22或23所述的用途或方法，其中所述神经保护包括部分或完全恢复耳蜗功能和/或前庭功能。
34.根据权利要求22-33中任一项所述的用途或方法，其中所述dsRNA化合物下调所述受试者内耳中细胞内的CAPNSl表达。
35.一种双链RNA (dsRNA)化合物，其下调编码具有SEQ ID NO: 4中列出的序列的mRNA的N0X3基因的表达，用于有需要的受试者耳内神经元的神经保护。
36.一种为有需要的受试者的耳内神经元提供神经保护的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的下调N0X3基因的表达的双链RNA (dsRNA)分子，其中所述N0X3基因编码具有SEQ ID N0:4中列出的序列的mRNA,从而为所述受试者耳内的神经元提供神经保护。
37.根据权利要求35或36所述的用途或方法，其中所述神经元是神经节或包含在神经节内。
38.根据权利要求37所述的用途或方法，其中所述神经节为螺旋神经节或前庭神经节。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的用途或方法，其中所述神经保护包括保护所述神经元免于细胞死亡。
40.根据权利要求39所述的用途或方法，其中所述神经元的细胞死亡包括凋亡性细胞死亡。
41.根据权利要求39或40所述的用途或方法，其中所述神经元的细胞死亡与疾病或病症、局部缺血、物理/机械创伤、化学试剂、传染物、免疫反应和营养失衡中的一项或多项相关。
42.根据权利要求41所述的用途或方法，其中所述神经元的细胞死亡与疾病或病症相关。
43.根据权利要求35或36所述的用途或方法，其中所述受试者患有或处于发展与听觉器官或前庭器官病理异常相关的一种或多种疾病或病状的风险。
44.根据权利要求42所述的用途或方法，其中所述疾病或病状与选自阵发性眩晕、听力丧失、耳鸣和耳胀的症状相关。
45.根据权利要求43所述的用途或方法，其中所述受试者患有或易患美尼尔氏症。
46.根据权利要求35或36所述的用途或方法，其中所述神经保护包括部分或完全恢复耳蜗功能和/或前庭功能。
47.根据权利要求35-46中任一项所述的用途或方法，其中所述dsRNA化合物下调所述受试者内耳中细胞内的NOX3表达。
48.一种双链RNA (dsRNA)化合物，其下调编码具有SEQ ID NO: 7中列出的序列的mRNA的RHOA基因的表达，用于有需要的受试者耳内神经元的神经保护。
49.一种为有需要的受试者的耳内神经元提供神经保护的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的下调RHOA基因的表达的双链RNA (dsRNA)分子，其中所述RHOA基因编码具有SEQ ID N0:7中列出的序列的mRNA，从而为所述受试者耳内的神经元提供神经保护。
50.根据权利要求48或49所述的用途或方法，其中所述神经元是神经节或包含在神经节内。
51.根据权利要求50所述的用途或方法，其中所述神经节为螺旋神经节或前庭神经节。
52.根据权利要求48-51中任一项所述的用途或方法，其中所述神经保护包括保护所述神经元免于细胞死亡。
53.根据权利要求52所述的用途或方法，其中所述神经元的细胞死亡包括凋亡性细胞死亡。
54.根据权利要求52或53所述的用途或方法，其中所述神经元的细胞死亡与疾病或病症、局部缺血、物理/机械创伤、化学试剂、传染物、免疫反应和营养失衡中的一项或多项相关。
55.根据权利要求54所述的用途或方法，其中所述神经元的细胞死亡与疾病或病症相关。
56.根据权利要求48或49所述的用途或方法，其中所述受试者患有或处于发展与听觉器官或前庭器官病理异常相关的一种或多种疾病或病状的风险。
57.根据权利要求56所述的用途或方法，其中所述疾病或病状与选自阵发性眩晕、听力丧失、耳鸣和耳胀的症状相关。
58.根据权利要求56所述的用途或方法，其中所述受试者患有或易患美尼尔氏症。
59.根据权利要求48或49所述的用途或方法，其中所述神经保护包括部分或完全恢复耳蜗功能和/或前庭功能。
60.根据权利要求48-59中任一项所述的用途或方法，其中所述dsRNA化合物下调所述受试者内耳中细胞内的RHOA表达。
61.一种为有需要的受试者的耳内神经元提供神经保护的试剂盒，其包含下调受试者体内CASP2、N0X3、CAPNSl或RHOA的表达的dsRNA化合物。
62.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述dsRNA化合物下调CASP2的表达。
63.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述dsRNA化合物下调N0X3的表达。
64.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述dsRNA化合物下调CAPNSl的表达。
65.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述dsRNA化合物下调RHOA的表达。
66.根据权利要求61-65中任一项所述的试剂盒，其中所述神经元是神经节或包含在神经节内。
67.根据权利要求66所述的试剂盒，其中所述神经节为螺旋神经节或前庭神经节。
68.根据权利要求61、62、66或67中任一项所述的试剂盒，其中所述dsRNA具有双链结构: 5' z" -GCCAGAAUGUGGAACUCCU-Z' 3'(有义链，SEQ ID NO:8) 3' z-CGGUCUUACACCUUGAGGA 5'(反义链，SEQ ID NO:9) 其中每个A、C、U和G均为未经修饰的核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸或非常规部分并且每个连续核糖核苷酸或非常规部分通过共价键与下一个核糖核苷酸或非常规部分连接; 其中Z和V的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在，独立地包括在其所在链的.3’端共价连接的1-5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合；并且 其中z”可能存在或不存在，但是如果存在，为在所述有义链的5’端共价连接的加帽部分。
69.根据权利要求68所述的试剂盒，其中所述共价键为磷酸二酯键；其中每个Z和V均不存在，其中所述有义链包含，从5’端开始计数，在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、.13、14、15、16、17和19的未经修饰的核糖核苷酸、位置18的L-脱氧胞苷、与5’端共价连接的反向脱氧脱碱基部分(在SEQ ID NO:26中列出)；并且其中所述反义链包含，从5’端开始计数，在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19的每一处的2’ O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和在位置1、3、5、7、9、10、12、14、16和18的每一处的未经修饰的核糖核苷酸(在SEQ ID NO: 27中列出)。
70.根据权利要求69所述的试剂盒，其中z”存在并且包含反向脱氧脱碱基部分。
71.根据权利要求61-70中任一项所述的试剂盒，其进一步包含用于向所述受试者经鼓室施用所述dsRNA化合物的装置。
【文档编号】A61K31/713GK103917647SQ201280054213
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年11月1日 优先权日:2011年11月3日
【发明者】埃琳娜·费因斯坦 申请人:夸克制药公司