治疗粘液分泌亢进的方法
【专利摘要】本发明一般涉及减少哺乳动物内不希望的气道组织粘液分泌的方法和用于相同目的的试剂。更具体地，本发明涉及通过使激活素功能水平下调或使滤泡抑素功能水平上调来减少哺乳动物气道组织粘液分泌过多的方法。本发明方法尤其有用于治疗和/或预防以气道组织粘液功能异常为特点的症状，例如粘液过度生成或粘液清除率降低，而使粘液分泌水平降低将减轻所述症状。
【专利说明】治疗粘液分泌亢进的方法
发明领域
[0001]本发明一般涉及减少哺乳动物的不希望的气道组织粘液分泌的方法和用于相同目的的试剂。更具体地，本发明涉及通过下调激活素功能水平或上调滤泡抑素功能水平来减少哺乳动物气道组织粘液分泌亢进的方法。本发明方法尤其有用于治疗和/或预防以气道组织粘液功能异常为特点的症状，例如粘液过度生成或粘液清除减少，而使粘液分泌水平降低将减轻所述状况。
[0002]发明背景
[0003]关于本说明书中作者的发表物详细书目在说明书的结尾按字母顺序集中。
[0004]在说明书中对任何在先出版物(或由此得到的资料)或任何已知事物的参考不作为并且不应被看作承认或认可或者以任何形式提示在先出版物(或由此得到的资料)或任何已知事物形成本说明书涉及的领域中的公知普通常识的一部分。
[0005]正常情况下，气道中的粘液分泌是呼吸道的第一道防线，并且是先天免疫系统的重要特征。因此，除连续吸入空气中的病原体、颗粒和毒素以外，肺对环境伤害很具抵抗力。保护气道表面不受这些病原体侵害的粘液是电解质类、内源性和外源性蛋白质、脂质和碳水化合物的复杂非均质稀释物(I~2% )水性溶液。粘液形成凝胶上层和溶胶下层。
[0006]粘液包含约2 % 的粘蛋白(Davies 等.2002，Novartis FoundationSymposium248(《诺华基金会研讨会文集248》).第76-93页)，所述粘蛋白是高分子量的糖蛋白，其提供有效粘液-纤毛相互作用所需的粘弹性。气道粘液由表面上皮中的杯状细胞(Rogers2003, Int.J.Biochem.Cell Biol.35:1-6)和粘膜下腺中的粘液细胞(Finkbeinerl999, Respir Physiol.118:77-83)分泌。成熟的粘蛋白是长螺纹样的分子，该分子由通过二硫桥首尾相连的单体组成。与肠的厚粘液层不同，气道的粘液层是薄且可移动的。因此，这便于通过所述粘液捕获吸入的颗粒并通过在收缩纤毛顶部运输将其从气道移出。该过程被称作粘液纤毛清除。
[0007]聚合粘蛋白的分泌受粘蛋白产量的独立调节(Davis和Dickey2008, AnnuRev Physiol70:487-512 ；Adler 和 Li2 OO I，Am.J.Respir.Ce11 Molec.Biol.25:397-400)。表面上皮的最重要的促分泌素似乎是ATP，其作用于顶端膜Ρ2Υ2受体(Kim 等.2003, J.Pharmacol.Sci, 92:301-307 ；Lazarowski 和 Boucher2009, CurrOpin Pharmacol.9:262-267 ； Dav i s 和 Lazarowski2008，Respir.Physiο I.Neurobiol.163:208-213)。气道表面液体持续存在低水平的ATP造成所述分泌器的持续低活性，导致提供常规屏障的粘蛋白的稳定释放。
[0008]有效的粘液清除是肺健康的基础，而气道疾病是较差清除的一致结果。健康的粘液是粘度低且弹性小的凝胶，其容易通过纤毛运动来运输，而病理性的粘液粘度高且弹性大，并且不易于被清除(Cone2009, Adv.Drug Deliv.Rev.61:75-85 ；Innes等.2006, Chestl30:1102-1108)。当粘蛋白产量增加从而粘蛋白在胞内累积，并且触发大量颗粒的分泌(粘液分泌允进)时，会发生气道管腔堵塞(Hayashi等.2004，VirchowsArch.444:66-73 ；Hoggl997, APMIS105:735-745 ；Hays 和 Fahy2003, Am.J.Med.115:68-69 ；Bosse等.2010, Annu.Rev.Physiol72:437-462)。从健康粘液向病理性粘液的转换通过多重机制产生，所述机制改变其水合作用和生化组成；这些包括盐与水的分泌异常和粘蛋白产量增加。粘液的累积由产量过度和清除减少的一些组合造成，并且持续的累积可导致因为微生物提供生长环境所致的感染和炎症。
[0009]粘液清除减弱的主要病症是咳嗽和呼吸困难。咳嗽是由肺内或咽喉气道中的迷走神经传入刺激引起的(Canning2006, Chestl29:增刊:33S-47S ;Rubin2010, Lungl88:增刊:S69-S72)。当粘液因占据多数气道管腔而阻塞气流时造成呼吸困难(Hogg2004, Lancet364:709-721 ；Hoggl997 同上；Hays 和 Fahy2003 同上;Boss6 等.2010 同上)。粘液清除减弱的生理现象包括咳嗽、支气管呼吸音、鼾音和喘鸣。未治疗或无法治疗的气道粘液分泌亢进显著促进了患者的发病和死亡，这不仅归因于过量粘液阻塞气道，而是因为其导致气道高响应性(hyperesponsiveness)。以粘液分泌允进为特征的疾病包括气喘、囊胞性纤维症、慢性阻塞性肺病、免疫缺陷状态(例如，低丙球蛋白血症、人免疫缺陷病毒感染、器官移植和恶性血液症状)。残留的粘液对插管患者固定化和肺部结构因麻痹、固定或手术而被破坏的那些人而言也是问题；在此类患者中，肺膨胀不全和肺炎是常见并发症。所有这些症状均难以有效治疗，并且目前无法治愈。然而，就患者护理和管理而言，仍然极其需要开发出用以有效减轻所述病症的方法，因为其能够有力协助进行中的疾病管理并由此改善治疗结果。因此，这必然将会大幅提高患者的生活质量。
[0010]迄今为止，对粘液分泌亢进事件的基础机制的了解有限。这已因大量不同疾病类型而高度复杂化，这些疾病类型均显示与粘液功能异常相关联的独特的病因学和作用机制。例如，一些气道炎性症状中会发生粘液分泌亢进，从而已根据以下方面考虑该病症:其是否形成炎性反应的部分并且是否将通过减少炎症而可被治疗。然而迄今为止，就这一点而言，简单的抗炎性疗法的效用有限。然而，就粘液分泌亢进发生的程度而言，任何理解的与炎性级联反应相关的联系对于如下情况几乎没有帮助:缺陷实际上在于清除减少机制而非分泌亢进，或分泌亢 进在炎症事件之前发生，或完全非炎性状况。这些复杂性在如下科技文献中有所反应，这些文献中得到矛盾且模糊的数据。例如，在如下文献内容中，Hardy等，2006 (Clin.Exp.Allergy36:941-950)，确定滤泡抑素处理鼠变应性气喘模型似乎导致较少数量的产粘液气道细胞。牢记小鼠实际上并不自然发展气喘，这些结果的相关性有限，这在Hardy等人之后的出版物中得到反映:Hardy等,2010 (Am.J.Respir.Cell Molec.Biol.42:667-675)，其中作者声称他们团队的后续研究显示没有证据证明激活素A和小鼠肺中的粘液产生有任何直接联系。这将意味着在该情况中，激活素A与粘液产生没有直接联系，并将无视激活素A在粘液分泌中的作用，以及此外的，粘液分泌亢进在非炎性反应中的调节。这些发现还得到Gregory等人的结果的支持:Gregory等，2010 (Am.J.Respir.Crit.Care Med.182:143-154)，其直接研究了给予针对激活素A的中和抗体对尘螨介导的气道重建和高响应性模型的作用。在该研究中，这些作者确定因结合至所述抗体而降低水平的生物活性的激活素A对上皮粘液分泌没有影响。因此，不仅有结果显示就炎性反应而言激活素A的减少对粘液分泌无直接影响，而且关于非炎性症状情况下或基于清除减少而非异常分泌亢进的粘液功能异常情况下的粘液分泌如何被调节没有任何建议。因此，在导致本发明的研究中，惊人地确定了气道组织粘液分泌(例如粘液分泌亢进)可通过使功能性激活素水平下调或使滤泡抑素水平提高来有效减少，而这与炎性状态的同时存在与否无关。因此，该发现提供了治疗广泛疾病特有的极严重病症的简单且有效的方法。尽管其自身不是对于任何这些疾病的治愈性疗法，减轻与极不利并发症和结果相关联的病症而无关该病症的起因性质，就患者护理和管理而言是一大进步。
【发明内容】
[0011]除非另有说明，在本说明书和所附权利要求书中，术语包含摂以及变化形式如包括摂和含有摂应理解为是指包括所述的整数或步骤或者多个整数或步骤的组，但是不排除任何其它整数或步骤或者多个整数或步骤的组。
[0012]本文中所用的术语“源自”应认为是指由指明品种源生的但无需从该指定来源直接获得的特定整体或整体的组。此外，除非另有说明，本文中所用的单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象。
[0013]除非另外定义，否则，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。
[0014]本发明的一方面涉及使哺乳动物气道组织粘液分泌减少的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中激活素的功能水平下调。
[0015]在另一方面，提供使哺乳动物气道组织粘液分泌减少的方法，所述方法包括使滤泡抑素的功能水平上调。
[0016]在又另一方面，提供使哺乳动物肺组织粘液分泌减少的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中的激活素的功能水平下调。
[0017]在又另一方面，提供使哺乳动物肺组织粘液分泌减少的方法，所述方法包括所述哺乳动物中的滤泡抑素的功能水平上调。
[0018]在又另一方面，提供使哺乳动物气道组织粘液分泌亢进降低的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中的激活素的功能水平下调。
[0019]在又另一方面，提供使哺乳动物气道组织粘液分泌亢进降低的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中的滤泡抑素的功能水平上调。
[0020]在又另一方面，本发明提供使哺乳动物气道组织粘液分泌减少的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中激活素A或激活素B的功能水平下调。
[0021]因此，在又另一个方面，提供使哺乳动物气道组织粘液分泌减少的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的滤泡抑素。
[0022]在又另一个方面，提供使哺乳动物气道组织粘液分泌减少的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的抑制素一段时间，并且所述给予在足以使所述哺乳动物中激活素的功能水平下调的条件下进行。
[0023]本发明的相关方面涉及一种治疗性或预防性治疗以气道组织粘液功能异常为特征的症状的方法，所述方法包括使激活素的水平下调以减少气道组织粘液分泌。
[0024]另一方面，本发明涉及一种治疗性或预防性治疗以气道组织粘液功能异常为特征的症状的方法，所述方法包括使减少气道组织粘液分泌的激活素的水平下调。
[0025]在又另一个方面，本发明涉及治疗性或预防性治疗哺乳动物囊胞性纤维症的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中的激活素的功能水平下调或使所述哺乳动物中的滤泡抑素的功能水平上调。[0026]在又另一个方面，提供治疗性或预防性治疗哺乳动物气喘的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中激活素的功能水平下调或滤泡抑素的功能水平上调。
[0027]在又另一个方面，提供治疗性或预防性治疗哺乳动物的慢性阻塞性肺疾病的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中的激活素的功能水平下调或使所述哺乳动物中的滤泡抑素的功能水平上调。
[0028]在又另一个方面，提供治疗性或预防性治疗肺清除机制受到破坏的哺乳动物的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中激活素的功能水平下调或使所述哺乳动物中的滤泡抑素的功能水平上调。
[0029]本发明的另一个方面涉及使激活素的功能水平下调或使滤泡抑素的功能水平上调的试剂在制备治疗以气道组织粘液功能异常为特征的症状的药物中的应用。
[0030]附图简要说明
[0031]图1:Scnnlb转基因小鼠肺中的气道粘液产生。肺切片用高碘酸席夫(PAS)染色并通过双盲分析来对气道粘液产生程度评分。O =无气道粘液产生，I =少有产气道粘液细胞，2 =中度气道粘液产生伴随偶然管腔粘液，3 =大多数气道内粘液产生，频繁管腔阻塞，至4 =严重粘液产生且大多数气道发生气道阻塞。图2 =Scnnlb新生小鼠的鼻内滤泡抑素处理使气道粘液产生减少。野生型或Scnnlb小鼠在3 - 21天龄的各第2天鼻内(1.η.)接受盐水或滤泡抑素。黑色箭头显示产粘液细胞。白色箭头显示炎性细胞。PAS染色，原始放大倍数400χ。
[0032]图3 =Scnnlb新生小鼠的鼻内滤泡抑素处理使气道粘液产生减少。新生小鼠从3-21天龄每隔一天用滤泡抑素或盐水1.η.处理。肺切片用PAS染色，并且如图1所示对粘液产生的程度评分。平均值土标准误差(sem)。*P〈0.05。
[0033]图4:用等张盐水(sal)或hrFS288 (FS) 1.η.处理的野生型(WT)和Scnnlb小鼠的BAL液中的平均值土sem IL-13浓度。短线指示相关组间的统计学显著性；**P〈0.01。
[0034]发明详述
[0035]本发明在测定结果的基础上部分断定哺乳动物气道组织粘液分泌可通过使激活素的功能水平下调或使滤泡抑素水平升高来减少。因此，该发现促进了预防性或治疗性治疗以气道组织粘液功能异常(例如粘液分泌亢进或粘液清除减少)为特征的情况的方法的发展，而粘液分泌水平的降低将减轻所述症状。此类情况包括但不限于，气喘、囊胞性纤维症、免疫缺陷症状和其中粘液残留的情况，例如插管和麻痹。
[0036]因此，本发明的一方面涉及减少哺乳动物气道组织粘液分泌的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中激活素的功能水平下调。
[0037]在另一方面，提供减少哺乳动物气道组织粘液分泌的方法，所述方法包括使滤泡抑素的功能水平上调。
[0038]在一个实施方式中，所述激活素拮抗剂或滤泡抑素水平是所述哺乳动物气道组织中的水平。
[0039]述及“气道组织”，指自口鼻延伸的通道的组织，包括口和鼻，进入肺连同肺泡。从口和鼻腔延伸的最大的通道是气管(也称为“风管(windpipe)”)。气管在胸部分成两个较小通道，称为支气管，这些支气管各自进一步分为三个区，称为初级支气管、次级支气管和三级支气管)。各支气管进入一个肺并进一步分成更狭窄通道，称为细支气管。终末细支气管供给肺泡。该通道网络常被通俗地称为“支气管树”。不受本发明的任何方式的限制，假复层柱状气管和支气管上皮细胞中的主要细胞类型包括基细胞、中间细胞、杯状细胞和纤毛细胞。支气管的简单柱状上皮细胞包括两种主要细胞类型，称为克拉拉细胞和纤毛细胞。最远端和功能上特定的肺上皮细胞包括气体交换气室；鳞状I型肺细胞和立方II型肺细胞。
[0040]在一个实施方式中，所述气道组织是肺组织。
[0041]根据该实施方式，提供使哺乳动物非组织粘液分泌减少的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中的激活素的功能水平下调。
[0042]在另一个实施方式中，提供减少哺乳动物肺组织粘液分泌的方法，所述方法包括所述哺乳动物中的滤泡抑素的功能水平上调。
[0043]提及“肺组织”，应理解为包括述及形成各肺中支气管树的部分的大气道通道。
[0044]提及“粘液”应理解为涉及粘液分泌物，包含述及由粘膜组织分泌的粘蛋白。本发明不受任何理论或作用模式的限制，气道管腔粘液是脂质、糖复合物和蛋白质的复杂稀释物水性溶液。其包含盐、酶和酶类抗体(ant1-enzyme)、氧化剂和抗氧化剂、外源性细菌产物、内源性抗细菌剂、细胞源性的介体和蛋白质、血浆源性的介体和蛋白质，以及细胞碎片如DNA。认为气道粘液形成液体双层，由此凝胶上层浮在较下方、更具水溶性或纤毛周围液(periciliary liquid)层上(Knowles 和 Boucher2002, J.Clin.1nvest.109:571-577)。呼吸道粘液需要粘度和弹性的正确组合以供纤毛相互作用的最佳效率。粘液的粘弹性主要由高分子量粘液糖蛋白(称为粘蛋白)造成，所述粘蛋白占粘液的至多2% (以重量计)(Davies 等.2002, Novartis Foundation Symposium248 (《诺华基金会研讨会文集》248).第76-93 页)。气道中，粘蛋白由上皮中的杯状细胞(Rogers2003，Int.J.Biochem.Cell.Biol.35:1-6)和粘膜下层中的衆液粘液腺体(Finkbeinerl999, Respir.Physiol.118:77-83)产生。粘蛋白是螺纹样分子，其包含线性肽序列(称为粘蛋白前体)，其常具有衔接重复区(tandemly repeated region),其主要通过0_连接高度糖基化。
[0045]因此，述及粘液“分泌”应理解为述及通过上皮细胞和气道组织粘膜下层中的浆液粘液腺体的粘液分泌。如本文后文详述，粘液功能异常具有以下特征中的一种或两种:粘液产生过度或粘液清除减少。述及粘液“分泌亢进”应理解为述及由气道组织产生的粘液相对于正常分泌水平而言过量。
[0046]因此，在一个实施方式中，提供使哺乳动物气道组织粘液分泌亢进减少的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中的激活素的功能水平下调。
[0047]在又另一个实施方式中，提供使哺乳动物气道组织粘液分泌亢进减少的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中的滤泡抑素的功能水平上调。
[0048]在又一个实施方式中，所述气道组织是肺组织。
[0049]如本文前文详述，无关且不依赖于炎性反应或炎性反应的存在，均可能发生粘液功能异常。迄今为止，在对于所述疾病症状的整体治疗仍为无效或未知的情况下，仍未知至少使这种非常严重的病症减轻的方法。然而，现在已确定气道组织粘液分泌可通过使激活素的功能水平下调或使滤泡抑素的功能水平上调来减少。述及粘液分泌被“减少”应理解为述及阻止、下调(例如减缓)或其它情况下抑制粘液分泌。例如，这可表现为使分泌亢进减少的形式以恢复正常分泌水平，或可表现为使正常分泌水平降低的形式。所述后者结果应在如下情况中有用:患者中的粘液功能异常表现为粘液清除减弱的形式。在该情况中，使粘液分泌减缓提供了使组合率(rate of buildup)降低的方法并因而使粘液清除功能的水平降低以更有效操作。
[0050]述及“激活素”应理解为述及激活素β亚基二聚体。主题二聚体可以是激活素β亚基(包括βΕ)的同型二聚体或异质二聚体。述及所述亚基应理解为包括可由替代性剪接激活素β mRNA或激活素β的突变体或多态形式产生的任何同种型。述及“激活素β ”并不意在限制并且应理解为包括激活素β的全部形式，包括由激活素β亚基基因编码的任何蛋白质、可产生的任何亚基多肽例如前体形式，以及任何β蛋白，无论以单体、多体或融合蛋白形式存在。激活素的多聚体蛋白形式包括，例如，同型二聚体激活素B ( β Β_ β Β)或异质二聚体激活素AB ( β Α- β Β)、激活素BC ( β Β- β。)、激活素BE ( β Β_ β Ε)激活素A ( β Α β Α)、激活素AC ( β Α β c)、激活素AE (βΑβΕ)、激活素C ( β c β c)、激活素CE ( β c β E)和激活素Ε(βΕβΕ)蛋白。优选地，所述激活素分子是激活素A或激活素B。
[0051]根据该实施方式，本发明提供使哺乳动物气道组织粘液分泌减少的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中激活素A或激活素B的功能水平下调。
[0052]在另一个实施方式中，所述气道组织是肺组织。
[0053]在又另一个实施方式中，所述粘液分泌是粘液分泌亢进。
[0054]述及“哺乳动物”应理解为包括以下哺乳动物但不限于人、灵长类、牲畜(动物(例如绵羊、母牛、马、驴 、猪)、伴侣动物(例如，狗、猫)、实验室测试动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、捕获的野生动物(例如，狐狸、鹿)。优选地，所述哺乳动物是人或灵长类。最优选地，所述哺乳动物是人。
[0055]表述使激活素的“功能水平”下调或使滤泡抑素的“功能水平”上调应理解为功能性的激活素或滤泡抑素的水平。本领域技术人员应理解，激活素的功能水平可通过使激活素的绝对水平降低或通过拮抗激活素的功能活性使其效力降低来下调。甚至对激活素的部分拮抗都有可能作用以降低(尽管不必消除)激活素的功能效率。使滤泡抑素的功能水平升高应理解为具有相反的意思。例如，可使滤泡抑素的绝对水平升高，或可增加其生物利用度(例如通过延长其半衰期)。
[0056]对于实现激活素下调，指实现该目的所用的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于:
[0057](i)将蛋白质或非蛋白质分子引入细胞，所述分子使基因的转录和/或翻译控制下调，其中，该基因可以是激活素基因或其功能部分或直接或间接调节激活素基因表达的一些其它基因或基因区域(例如，启动子区域)；或
[0058](ii)引入蛋白质或非蛋白质分子，所述分子作为激活素表达产物的拮抗剂起作用。
[0059]对于实现滤泡抑素的下调而言，这也可通过任何合适的方法实现，所述方法包括给予滤泡抑素蛋白本身或引入使滤泡抑素基因的转录和/或翻译下调的蛋白质或非蛋白质分子。
[0060]上述蛋白质分子可源自任何合适的来源，例如天然、重组或合成来源，并且包括经例如天然药物筛选之后鉴定的融合蛋白或分子述及非蛋白质分子可以是，例如，核酸分子或其可以是源自天然来源的分子，例如天然产物筛选，或可以是化学合成的分子。本发明设想能够作为拮抗剂的小分子。拮抗剂可以是能够阻断、抑制或其它情况下阻止激活素不行使其正常生物学功能的任何化合物。拮抗剂包括单克隆抗体和反义核酸，其防止哺乳动物细胞中激活素基因或mRNA的转录或翻译。表达的调节还可通过采用抗原、RNA、核糖体、DNA酶、适配子、抗体或适用于共同抑制的分子来实现。合适的激活素的反义寡核苷酸序列(单链DNA片段)可以通过其抑制激活素表达的能力来产生或鉴定。用于产生蛋白质的反义寡核苷酸的产生在以下文献中有描述，例如，Stein和Cohen, 1988 (Cancer Res48:2659-2668)以及van der Krol等，1988 (Biotechniques6:958-976)。拮抗剂还包括阻止激活剂与其受体相互作用的任何分子。
[0061]就抗体而言，本发明设想抗体的任何合适形式的应用，所述抗体的任何合适形式包括所述抗体的催化抗体或衍生物、同源物、类似物或模拟物。此类抗体可以是单克隆或多克隆抗体并且可以选自天然产生的激活素或其亚基或可以特定由激活素二聚体或其单体(本文称作“抗原”)产生。在后者情况中，所述抗原可能首先需要与载体分子相关联。或者，可采用抗体的片段，例如Fab片段或Fab’2片段。此外，本发明延伸至重组和合成抗体，以及抗体杂合物。本文中的“合成抗体”考虑包括抗体的片段和杂合物。所述抗原也可用于筛选天然产生的抗体。
[0062]多克隆和单克隆抗体均可通过采用抗原或其衍生物、同源物、类似物、突变体或模拟物的免疫来获得，并且任何类型均对治疗有利。获取两种血清类型的方法为本领域熟知。多克隆血清不太优选，但相对易于制备:通过向合适实验室动物注射有效剂量的免疫效应物或其抗原部分，从动物收集血清，并用任何已知免疫吸附剂技术分离特定血清。尽管此种方法产生的抗体是有利的，但它们通常因为产品的可能的异质性而不受青睐。
[0063]特别优选采用单克隆抗体，因为其能被大量生产并且产品均匀。通过融合永生细胞系和对免疫原性制品敏感的淋巴细胞获得用于单克隆抗体生产的杂交瘤细胞系制备可用本领域技术人员熟知的 术完成。(参见,例如，Douillard和Hoffman，1981，刊于Compendium of Immunology) ； Kohler 和 Milstein, 1975Nature256:495-497 ； K^hler'和Milstein(1976)Eur.J.Tmmunol.6:511-519)。
[0064]优选地，本发明的抗体与所述抗原特异性结合。“特异性结合”指抗体与特定抗原的结合具有高亲和力和/或高亲和性。抗体与该特定抗原上其表位的结合比相同抗体与其它表位的结合，尤其是那些可存在于和感兴趣的特异性抗原相关联的分子中或存在于相同样品中。特异性结合至感兴趣多肽的抗体可以弱的、但能检测的水平(例如，显示对感兴趣多肽的结合的10%或更低)结合其它多肽。此类弱结合或背景结合容易地和与感兴趣多肽结合的特异性抗体区分，例如，通过采用合适对照来进行所述辨别。
[0065]蛋白质和非蛋白质分子指，上述本文中共同指“调节剂”。就寻求激活素活性降低或滤泡抑素活性增高而言，所述调节剂优选是:
[0066](i)滤泡抑素。这可以蛋白质形式给予或可在体内通过腺病毒介导的系统诱导其过表达，所述腺病毒诱导的系统在如下文献中有描述=Takabe等，2003(Hepatology38:1107-1115)。
[0067](ii)使抑制素过表达或使抑制素的α亚基机能上调的任何试剂。所述α亚基能与激活素的β亚基二聚化以形成抑制素，从而使激活素水平有效下调。
[0068](iii)抑制素。该分子可结合至β -多糖并通过激活素受体来抑制激活素的作用。参见例如，Xu等人描述的机制:Xu等，1995 (J.Biol.Chem.270:6308-6313)或Smad7拮抗剂的应用(Bernard 等,2004 ；Molec.Endocrinol.18:606-623)。
[0069](iv)使β。水平上调的任何试剂，因为这导致激活素的无活性AC形式的形成。(V)激活素中和抗体。例如，如下文献中有描述:Poulaki等，2004(Am.J.Pathol.164:1293-1302)。
[0070](vi)抑制天然激活素与其受体结合的激活素突变体。例如，如下文献中有描述:Harrison 等，2004(J.Biol.Chem.279:28036-28044)。
[0071](vii)采用阻止正常激活素信号转导的突变激活素受体或作为竞争性抑制剂的可溶性激活素受体的转染或处理。参见例如,如下文献中描述的系统:Maeshima等，2004(Endocrinologyl45:3739-3745)。
[0072](viii)激活素反义寡核苷酸。
[0073]就此而言，述及“滤泡抑素”应理解为包括所有形式的滤泡抑素，例如，三个蛋白质核心和六分子量形式，其已被鉴定为由替代性剪接的mRNA FS315和FS288产生。因此，应理解其包括可由替代性剪接滤泡抑素mRNA或滤泡抑素的突变体或多态形式产生的任何同种型。还应理解其扩展至由滤泡抑素基因编码的任何蛋白质、任何亚基多肽，例如可能生成的前体形式，以及任何滤泡抑素蛋白或功能片段，无论以单体、多体还是融合蛋白形式存在。类似定义应用于“抑制素”。
[0074]上文定义的调节剂的筛选可通过数种合适方法的任何之一来实现，所述方法包括但不限于，使含激活素基因或其功能等价物或衍生物的细胞接触某一试剂，并就激活素蛋白或功能活性下调、编码激活素的核酸分子的表达下调或激活素或下游激活素细胞靶标的表达下调进行筛选。此类下调的检测可通过采用例如如下技术来实现=Western印迹、凝胶阻滞试验和/或激活素活性受体读出(例如荧光素酶、CAT等)。
[0075]应理解所述激活素基因或其功能等价物或衍生物可在细胞中天然产生，该细胞即为测试对象，或其可已被转染进入宿主细胞以供于测试目的。此外，可组成型地表达天然产生或转染的基因一从而提供可用于其中筛选在核酸或产物表达水平上使激活素活性下调的试剂的模型，或所述基因可需要激活一从而提供可用于其中筛选使激活素表达上调的试剂的模型。此外，就激活素核酸分子转染进入细胞而言，所述分子可包含完整激活素基因或其可仅包含所述基因的部分，例如调节激活素产物表达的部分。例如，可将该激活素启动子区域转染进入测试对象细胞。就此而言，当仅采用启动子时，可实现对该启动子活性调节的检测，例如，通过将该启动子接合至报告基因来进行所述检测。例如，可将所述启动子接合至荧光素酶或CAT报告子上，可分别通过荧光强度或CAT报告子活性的调节来检测该基因的表达下调。在另一个示例中，检测对象可以是下游激活素调节靶标，而非激活素本身。又另一个示例包括接合至最小受体的激活素结合位点。
[0076]这些方法提供对推定调节剂进行高通联筛选的机制，所述调节剂例如蛋白质或非蛋白质试剂，所述机制包括合成的、组合的、化学的或天然文库。这些方法还将便于对结合激活素核酸分子或其表达产物的试剂或调节上游分子表达的试剂进行检测，所述上游分子后续下调激活素表达或表达产物活性。因此，这些方法提供对直接或间接调节激活素表达和/或活性的试剂进行检测的机制。
[0077]根据本发明方法采用的试剂可以是任何合适的形式。例如，蛋白质试剂可以是不同程度糖基化的或未糖基化的、不同程度磷酸化的或去磷酸化的，和/或可包含一定范围的与所述蛋白质同用、连接、结合或其它情况下相关联其它分子，例如氨基酸、脂质、碳水化合物或其它肽、多肽或蛋白质。类似地，所述主题非蛋白质分子也可以是任何合适的形式。本文所述的蛋白质或非蛋白质试剂均可与任何其它蛋白质或非蛋白质分子连接、结合或其它情况下相关联。例如，在本发明的一个实施方式中，所述试剂与允许其靶向局部区域的分子相关联。
[0078]所述主题蛋白质或非蛋白质分子可直接或间接作用以使激活素或激活素表达产物活性下调。若所述分子与激活素核酸分子或表达产物相关联以分别调节表达或活性，则所述分子直接作用。若所述分子与除激活素核酸分子或表达产物以外的其它分子相关联，所述其它分子直接或间接下调所述激活素核酸分子或表达产物的表达或活性，则所述分子间接作用。因此，本发明方法涵盖通过诱导调节步骤级联反应对激活素核酸分子表达或表达产物活性进行调节。
[0079]术语“表达”指核酸分子的转录和翻译。述及“表达产物”指由核酸分子转录和翻译产生的产物。
[0080]本文所述的分子(例如激活素A、激活素B、滤泡抑素或其它蛋白质或非蛋白质试齐?)的“衍生物”包括来自天然或非天然来源的片段、局部、部分或变体。非天然来源包括，例如，重组或合成来源。“重组来源”指使获得的对象分子经遗传改变的细胞来源。例如，这将被用以增加或其它情况下增强特定细胞来源的生产速率和体积。局部或片段包括，例如，所述分子的活性区域。衍生物可源自氨基酸插入、缺失或取代。氨基酸插入的衍生物包括氨基和/或羧基末端融合以及单氨基酸或多氨基酸的序列内插入。插入的氨基酸序列变体是其中一个或多个氨基酸残基被导入蛋白质内的预定位点的那些，尽管在对所得产物进行合适筛选的情况下随机插入也是可取的。缺失变体以从序列去除一个或多个氨基酸为特征。取代氨基酸变体 是序列中至少一个残基已被去除并在其位置插入不同残基的那些。对氨基酸序列的添加包括与其它肽、多肽或蛋白质融合，如上文详述。
[0081]衍生物还包括具有与肽、多肽或其它蛋白质或非蛋白质分子融合的完整蛋白质的特定表位或局部的片段。例如，可使滤泡抑素或其衍生物与分子融合以促进其定位至特定位点。本文设想的分子的类似物包括但不限于，侧链修饰、非天然氨基酸和/或其衍生物在肽、多肽或蛋白质合成中的纳入以及交联剂的应用，以及对蛋白质分子或其类似物的构象限制的其它方法。可用于本发明方法的核酸序列的衍生物可类似地衍生自单核苷酸或多核苷酸取代、缺失和/或添加，包括与其它核酸分子融合。本发明中所用的核酸分子的衍生物包括寡核苷酸、PCR引物、反义分子、适用于核酸分子的共同抑制和融合的分子。核酸序列的衍生物还包括简并变体。
[0082]应理解“变体”或“突变体”指显示分子(例如，滤泡抑素)的形式的至少一些功能活性的分子，其为变体或突变体。变异或突变可以是任何形式，并可以是天然产生或非天然产生的。
[0083]“同源物”指分子源自与本发明方法处理的物质不同的物质。这在如下情况中可能发生，例如，当确定与被处理的物质不同的物质生成某种形式的滤泡抑素，例如，所述滤泡抑素显示与滤泡抑素相似且合适的功能特征，其通过经处理的对象天然产生。
[0084]应理解，化学和功能等同物是显示对象分子的任何一种或多种功能活性的分子，所述功能等同物可源自任何来源，例如，通过化学合成或通过筛选方法(例如天然产物筛选)鉴定。例如，化学或功能等同物可采用熟知方法设计和/或鉴定，所述方法例如组合化学或重组文库的高通量筛选或按照天然产物筛选。也可筛选用于此类方法的拮抗剂。
[0085]例如，可筛选包含小有机分子的文库，其中采用具有大量特异性母体基团(parentgroup)取代的有机分子。通用合成方案可按照如下公开的方法进行(例如，Bunin等.(1994) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 91:4708-4712 ；Deffitt 等.(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:6909-6913)。简言之，在各依次进行的合成步骤中，向阵列中各所选管的亚组添加多种不同选定的取代基之一，同时选择管的亚组为，例如，在所述文库生成过程中产生所有可能的所用不同取代基的置换。一个合适的置换方案在如下文献中有描述:美国专利号 5，763，263。
[0086]目前人们对采用随机有机分子的组合文库来搜索生物活性化合物的应用存在广泛的兴趣(参见例如，美国专利号5，763，263)。通过筛选该类型的文库发现的配体可用于模拟或阻断天然配体或干扰生物靶标的天然产生的配体。通过采用例如美国专利申请号N0.5，753，187公开的技术，可在少于数周的时间内常规筛选出数百万新化学物和/或生物学化合物。在鉴定出的大量化合物中，仅进一步分析显示合适生物学活性的那些。
[0087]就高通量文库筛选方法而言，采用组合文库装置来筛选出能够与选定生物学试剂(例如生物分子、大分子复合物或细胞)特异性相互作用的寡聚或小分子文库化合物，本领域技术人员容易 从熟知方法(例如上述那些)范围中选择所述组合文库装置。在所述方法中，对所述文库中各成员的与选定试剂特异性相互作用的能力进行筛选。在该方法实践中，将生物学试剂置入含有化合物的管中并允许其与各管中的单一文库化合物相互作用。所述相互作用被设计成产生可检测的信号，这可用于监测所需相互作用的存在。优选地，所述生物试剂存在于水性溶液中，但取决于所需相互作用，其它条件也是合适的。可通过例如任何熟知的基于功能或基于非功能的物质检测方法来进行检测。
[0088]在一个实施方式中，激活素的功能水平的下调通过给予滤泡抑素、抑制素、针对激活素的抗体、激活素反义寡核苷酸、竞争性抑制与激活素受体或突变或可溶的激活素受体结合的非功能性激活素分子，其中所述受体抑制正常激活素信号转导。
[0089]因此，在一个特定的实施方式中，提供使哺乳动物气道组织粘液分泌减少的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的滤泡抑素。
[0090]对于该特定实施方式，应理解，在一些情况中，滤泡抑素可作用以通过抑制激活素机能来减少粘液分泌，而在其它情况中，其可独立地作用于激活素。本发明不受任何理论或作用模式的限制，滤泡抑素是其它TGFii成员的阻断剂，并且能够不依赖激活素地减少粘液分泌。因此，提供在超出仅仅粘液分泌受激活素调节的那些情形的其它情况下使粘液分泌减少的有价值的方法。
[0091]在另一个特定实施方式中，提供使哺乳动物气道组织粘液分泌减少的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的抑制素一段时间，并且所述给予在足以使所述哺乳动物中激活素的功能水平下调的条件下进行。
[0092]如上文详述，本发明的另一个方面涉及本发明相关的治疗和/或预防以粘液功能异常为特点的疾病症状或其它不希望症状的应用。
[0093]因此，本发明的相关方面涉及一种治疗性或预防性治疗以气道组织粘液功能异常为特征的症状的方法，所述方法包括使激活素的水平下调以减少气道组织粘液分泌。
[0094]本发明的相关方面涉及一种治疗性或预防性治疗以气道组织粘液功能异常为特征的症状的方法，所述方法包括使减少气道组织粘液分泌的激活素的水平下调。
[0095]应理解，述及“粘液功能异常”指分泌的粘液水平高于正常水平，或者另一种情况，无论以何种水平分泌粘液，粘液清除机能降低。在这两种情况中，气道中粘液的形成增多，这对患者而言是极其严重的影响。因此，应理解，述及“以粘液功能异常为特征”指气道组织粘液功能异常的任何症状、病症或病因。因此，应理解，其指粘液分泌和清除正常但可能是不希望的或其它情况下引起问题的症状。此类症状的示例包括但不限于:气喘、囊胞性纤维症、慢性阻塞性疾病、支气管扩张、原发性纤毛运动障碍、泛细支气管炎、慢性支气管炎、肺动脉高血压、特发性肺纤维化、免疫缺陷状态(例如，低丙球蛋白血症、人免疫缺陷病毒感染、器官移植和恶性血液症状)、插管患者、粘液清除减弱以及因麻痹固定化或手术造成肺结构破坏的那些人。因此，在一个实施方式中，本发明涉及治疗性或预防性治疗哺乳动物囊胞性纤维症的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中的激活素的功能水平下调或使所述哺乳动物中的滤泡抑素的功能水平上调。
[0096]在另一个实施方式中，提供治疗性或预防性治疗哺乳动物气喘的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中激活素的功能水平下调或使所述哺乳动物中的滤泡抑素的功能水平上调。
[0097]在又另一个是实施方式中，提供治疗性或预防性治疗哺乳动物的慢性阻塞性肺疾病的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中的激活素的功能水平下调或使所述哺乳动物中的滤泡抑素的功能水平上调。
[0098]在又另一个实施 方式中，提供治疗性或预防性治疗肺清除机制受到破坏的哺乳动物的方法，所述方法包括使所述哺乳动物中激活素的功能水平下调或使所述哺乳动物中的滤泡抑素的功能水平上调。
[0099]根据该实施方式，所述肺清除机能因插管、麻痹、手术或固定化受到破坏。
[0100]在又一个实施方式中，所述症状是:
[0101]?非炎性症状；
[0102].在炎症发作之前出现的或经非炎性机制调节的不希望的粘液分泌或粘液分泌亢进的症状；或
[0103].粘液分泌水平与正常水平无异但却是不需要的且希望其减少的症状，无论是否是炎性或非炎性症状。
[0104]根据这些实施方式，所述气道组织是肺组织。
[0105]在另一个实施方式中，所述激活素是激活素A或激活素B。
[0106]给予以使激活素机能下调的试剂，以至少部分获得所需响应，或延迟发病或抑制发展或终止治疗的特定症状的所有发作或发展的必需量给予。所述量视待治疗的个体的健康和生理状况、待治疗个体的分类学组、希望的保护程度、组合物的制剂、医学状态的评估和其它相关因素而变化。预计所述量将落入可通过常规试验测定的相对较宽范围内。
[0107]在又另一个实施方式中，激活素的功能水平的下调通过给予下述来实现:滤泡抑素、抑制素、针对激活素的抗体、激活素反义分子、竞争性抑制与激活素受体或突变或可溶的激活素受体结合的非功能性激活素分子，其中所述受体抑制正常激活素信号转导。[0108]认为本文述及的“治疗”和“预防”是其最宽泛含义。术语“治疗”不必指对象经治疗直至完全康复。类似地，“预防”不必指对象将最终不具有疾病症状。因此，治疗和预防包括改善特定症状的病症或预防或其它情况下降低发展特定症状的风险。术语“预防”可认为是使特定症状的严重性或发作降低。“治疗”也可使存在的症状的严重性降低。
[0109]本发明还设想一种治疗组合物，例如将调节剂与其它蛋白质或非蛋白质分子一同给予，所述蛋白质或非蛋白质分子促进所需的治疗或预防结果。例如，可将本发明方法与标准气喘或囊胞性纤维症治疗方案结合。
[0110]本文所述的本发明分子的给予[本文统称“调节剂”]，可以药物组合物形式通过任何传统方式进行。设想所述药物组合物的调节剂在以基于具体病例确定的量给予时显示治疗活性。所述量的变化取决于，例如，人或动物以及选择的调节剂。可使用宽范围的剂量。就患者而言，例如可以约0.1 μ g~约Img调节剂/kg体重/天给予。可调节剂量方案以提供最佳治疗响应。例如，可每天、每周、每月或采取其它合适的时间间隔给予数个分开的剂量，或者该剂量可按情况危急程度的指示按比例减少。
[0111]调节剂可以传统方式给予，例如经口、静脉内(水溶性)、经呼吸、经皮、腹膜内、肌肉内、皮下、皮内或栓剂途径或植入(例如，采用缓释分子)方式。所述调节剂可以药学上可接受的 非毒性盐形式给予，例如酸加成盐或金属络合物，例如锌、铁等的金属络合物(其被认为是出于本申请目的的盐)。此类酸加成盐的说明性示例有:盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐等。若待给予的活性成分是片剂形式，该片剂可包含:粘合剂例如黄芪胶、谷物淀粉或明胶；崩解剂例如海藻酸；以及润滑剂，例如硬脂酸镁。
[0112]给予途径包括但不限于，全身性、局部、经皮、气管内、经鼻咽、静脉内、腹膜内、皮下、颅内、皮内、肌内、眼内、鞘内、脑内、鼻内、输注、经口、经直肠、通过IV点滴、贴片和植入给予。优选地，所述给予方式是关于气道粘液分泌治疗的吸入式给予，以及供于其它症状的静脉内、肌肉内或经皮给予。
[0113]尽管优选吸入式途径，所述调节剂可以任何方便或合适的方式给予。例如，可通过吸入或注气给予粉末或气溶胶(包括通过喷雾器)；气管内或鼻内给予。
[0114]就吸入而言，本发明化合物可采用本领域已知的任何系统递送，包括干粉气溶胶、液体递送系统、空气喷射喷雾器、推进系统等。参见例如，Patton(1998)Biotechniquesl6:141-143 ;由例如以下生产商提供的用于多肽大分子的产物或吸入式递送系统:杜拉制药公司(Dura Pharmaceuticals)(加利福尼亚州圣地亚哥)、阿拉迪姆公司(Aradigm)(加利福尼亚州海沃德)、产气菌公司(Aerogen)(加利福尼亚州圣克拉拉)、吸入治疗系统公司(Inhale Therapeutic Systems)(加利福尼亚州圣卡洛斯)、巴利制药公司(PARIPharma)(德国格雷费尔芬格)等。例如，药物制剂可以气溶胶或雾气形式给予。就气溶胶给予而言，该制剂可以精细分离形式与表面活性剂和推进物一同供给。在另一个方面，用于递送该制剂至呼吸组织的装置是其中所述制剂汽化的吸入器。其它液体递送系统包括，例如，气体喷射喷雾器。在又另一方面，所述制剂可以干燥喷雾形式给予。
[0115]在一个实施方式中，全身性给予所述激活素拮抗剂或滤泡抑素。
[0116]在另一个实施方式中，局部给予所述激活素拮抗剂或滤泡抑素至气道，尤其是肺，例如经由鼻和/或口吸入气溶胶或通过液体递送系统或喷雾器给予。[0117]根据这些方法，本发明定义的试剂可与一种或多种其它化合物或分子共同给予。“共同给予”是指在相同制剂或在两种不同制剂中通过相同或不同途径同时给予或通过相同或不同途径依次给予。例如，对象试剂可与激动剂一同给予以增强其效果。“依次”给予指两种分子类型的给予之间相差数秒、数分钟、数小时或数天的时间。这些分子可以任何顺
序给予。
[0118]本发明的另一个方面涉及使激活素的功能水平下调或使滤泡抑素的功能水平上调的试剂在制备治疗以气道组织粘液功能异常为特征的症状的药物中的应用。
[0119]在一个实施方式中，所述症状是:气喘、囊胞性纤维症、慢性阻塞性疾病、支气管扩张、原发性纤毛运动障碍、泛细支气管炎、慢性支气管炎、肺动脉高血压、特发性肺纤维化、免疫缺陷状态(例如，低丙球蛋白血症、人免疫缺陷病毒感染、器官移植和恶性血液症状)、插管患者，以及肺部结构因麻痹、固定化或手术遭到破坏的那些患者。在另一个实施方式中，所述激活素是激活素A或激活素B。
[0120]在又另一个实施方式中，激活素的功能水平的下调通过给予下述来实现:滤泡抑素、抑制素、针对激活素的抗体、激活素反义分子、竞争性抑制与激活素受体或突变或可溶的激活素受体结合的非功能性激活素分子，其中所述受体抑制正常激活素信号转导。
[0121]适于可注射应用的药物形式包括无菌水性溶液(水溶性)或分散剂以及供于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末，或可以是乳膏形式或适于局部施用的其它形式。它在制造和贮存的条件下必须是稳定的并且必须保存抵御微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。可维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂覆材料、分散液 情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂(superfactants)。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等引起微生物作用的防止。在很多情况中，优选包括等张剂，例如糖类或氯化钠。可通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶用于组合物中来延长可注射组合物的吸收。
[0122]通过将所需量的活性化合物和不同的其它上述组分掺入合适溶剂后过滤灭菌制得无菌注射液。通常，将不同的无菌活性成分纳入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载体中制备分散液。当制备无菌注射液制备所需的无菌粉末时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，由之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。
[0123]当活性成分被合适保护时，可将其经口给予，例如，采用惰性稀释剂或可吸收的可食用载体，或可将其封闭在硬质或软质壳状明胶胶囊中，或可将其压制成片剂，或可将其直接掺入饮食食物中。对口服治疗性给药而言，所述活性化合物可以与赋形剂掺和以可消化片剂、含服片剂、含片、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、薄片和类似形式使用。这种组合物和制剂应含有至少I重量％的活性化合物。当然，所述组合物和制剂的百分数可以改变，通常可以是单位重量的约5~约80%。在这样的治疗上使用的组合物中的活性化合物的量是这样的以使得可以得到合适的剂量。制备本发明的优选组合物或制备物从而口服单位剂型包含约
0.1 μ g~2000mg的活性化合物。
[0124]还可将该试剂制备成颗粒或可溶形式供于通过气道给予。例如，该试剂可通过经口吸入器或喷雾器给予。[0125]所述片剂、含片、丸剂等还可以包含下列成分:粘合剂如胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；并可添加甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精，或增味剂如薄荷、冬青油，或樱桃风味。当所述剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料以外，其可包含液体载体。可以存在各种各样的其它材料作为包衣或者来改变所述剂型的外形。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或者两者进行包衣。糖浆或酏剂可包含所述活性化合物、蔗糖作为甜味剂、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯作为防腐剂、染料和调味剂如樱桃或甜橙风味。当然，在制备任何单位剂型中所用的材料应当是药学上纯的并且在所用的量下基本无毒。此外，所述一种或多种活性化合物可以掺入缓释制备物和制剂中。
[0126]所述药物组合物还可包含遗传分子，例如能够转染靶细胞的载体，其中所述载体携带编码滤泡抑素或调节剂(如上所述)的核酸分子。所述载体可以是，例如，病毒载体。
[0127]下面参照以下非限制性实施例进一步描述本发明。
[0128]实施例1
[0129]囊胞性纤维症小鼠的繁育和表征
[0130]发展囊胞性纤维症样疾病的ScnnlM也称为PENaC)转基因小鼠成功引入并配对产出第二代小鼠(C57BL/6和C3H/HeJ系的串种)。两个系都良好繁殖。Scnnlb小鼠发展出预期的表型，并且40 - 50%的转基因小鼠在21天龄时死亡。Scnnlb小鼠还显示预期的肺部病理学(Mali等，2004, Nature Med.10:487-493)，其肺气道中过量产生粘液，反映其粘液产生多于正常小鼠(图1).[0131]滤泡抑素处理对肺部疾病的作用
[0132]一窝新生小鼠被随机分配给滤泡抑素处理组或盐水处理组。小鼠幼崽从3 - 21天龄每隔一天通过鼻内途径接受滤泡抑素或盐水。贯穿本文所述的研究采用250μ g/kg剂量。小鼠每天称重，并由此调节滤泡抑素的浓度和体积。存活至第21-23天或21-23天龄的幼崽通过CO2窒息法被人道地处死。之后，从下腔静脉收集血液。通过以11，350g离心4分钟从全血获得血清，并将样品储存在_20°C。
[0133]通过用0.3mL内含I %胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水(PBS)灌洗气道来收集支气管肺泡灌洗(BAL)液，然后另进行三次0.2mL灌洗，以获得约0.9mL/动物的总BAL液样品。BAL样品以350g离心4分钟，并储存在_70°C供于后续细胞因子/趋化因子分析。
[0134]处理BAL液之后，切除肺并置于新鲜配制的中性福尔马林缓冲液中。福尔马林固定的肺经石蜡包埋并切除3μπι切片。这些切片经高碘酸席夫(PAS)染色以供于分析杯状细胞和粘液存在。PAS染色程度指示粘液产量，而杯状细胞通过双盲分析(两个独立算子)评分。针对各肺的定性评分采用如下分数获得，O =无气道粘液产生。I =少有产气道粘液细胞，2 =中度气道粘液产生伴随偶然管腔粘液，3 =大多数气道内粘液产生，频繁管腔阻塞，至4 =严重粘液产生且大多数气道发生气道阻塞。
[0135]BAL液体样品中的各趋化因子和细胞因子浓度采用小鼠23-重试验试剂盒(伯乐公司(Bio-Rad) ；http://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/SKU/M60-009RDPD/Bio-Plex_Protrade_Mouse_Cytokine_23-plex_Assay)测定。该试剂盒检测趋化因子和细胞因子(包括IL-13)的数量。
[0136]囊胞性纤维症患者的肺中产生过量粘液，导致气道阻塞并丧失肺功能，这是Scnnlb小鼠中反映的结果，如上所述(图1)。滤泡抑素处理对粘液生成的效果通过用高碘酸席夫(PAS)对肺切片染色来评估，并对粘液生成程度进行半定量双盲分析。野生型小鼠普遍具有低水平粘液生成(图2和3)。重要的是，在盐水处理的Scnnlb小鼠中观察到的高水平粘液生成通过滤泡抑素处理而显著减少(图2和3)。当评估BAL液的IL13浓度时，滤泡抑素给予对野生型动物而言无作用(图4)。Scnnlb小鼠的BAL液中的IL13浓度已显著增高，而对Scnnlb小鼠的滤泡抑素处理导致IL13浓度显著减回至与野生型小鼠中观察到的相当水平(图4)。
[0137]滤泡抑素处理对寿命和总体健康的影响
[0138]囊胞性纤维症患者寿命显著缩短，而在Scnnlb小鼠中也观察到该特征。重要的是，盐水处理组(η = 24总计)中有25%的小鼠在21天龄时死亡,而该数据在滤泡抑素处理组(η = 22总计)中是18%。这些数据指示，滤泡抑素使总体生存率增加。另一个重要结果是，以每隔一天给予滤泡抑素持续三周的给药法不造成肺病理学或不健康。
[0139]本领域技术人员会理解，除了特定说明以外，可以对本文所述的发明进行变化和修改。应理解本发明包含所有这些变化和修改。本发明还包括说明书中单独或共同提到或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中任意两种或更多种的任意和全部组合。
[0140]文献目录
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【权利要求】
1.一种减少哺乳动物气道组织粘液分泌的方法，所述方法包括下调所述哺乳动物中的激活素功能水平或上调所述哺乳动物中的滤泡抑素功能水平。
2.一种治疗性或预防性处理以气道组织粘液功能异常为特征的症状的方法，所述方法包括下调所述哺乳动物中的激活素功能水平或上调所述哺乳动物中的滤泡抑素功能水平，其中下调所述激活素水平或上调所述滤泡抑素减少气道粘液分泌。
3.下调激活素功能水平或上调滤泡抑素功能水平的试剂在制备治疗以气道组织粘液功能异常为特征的症状的药物中的应用。
4.如权利要求1~3中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述激活素的拮抗剂或滤泡抑素水平是所述哺乳动物气道组织中的水平。
5.如权利要求1~4中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述气道组织是肺组织。
6.如权利要求1~54中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述粘液分泌是粘液分泌亢进。
7.如权利要求1~6中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述激活素是激活素A或激活素B。
8.如权利要求1~7中任一项所述的方法或应用，其特征在于，通过采用激活素拮抗剂来下调所述激活素功能水平。
9 .如权利要求8所述的方法或应用，其特征在于，所述激活素拮抗剂是抑制素，激活素 亚基、抑制素α亚基、针对激活素的抗体、非功能性激活素突变体、非功能性激活素受体突变体或可溶性激活素受体。
10.如权利要求1~7中任一项所述的方法或应用，其特征在于，通过采用下调激活素基因的转录或翻译的蛋白质或非蛋白质分子来下调所述激活素功能水平。
11.如权利要求10所述的方法或应用，其特征在于，所述蛋白质分子是针对激活素DNA或mRNA的抗体。
12.如权利要求10所述的方法或应用，其特征在于，所述非蛋白质分子是适用于共同抑制激活素表达的分子、适体、DNA酶或激活素反义寡核苷酸、。
13.如权利要求1~7中任一项所述的方法或应用，其特征在于，通过采用滤泡抑素或其功能片段来上调滤泡抑素功能水平。
14.如权利要求13所述的方法或应用，其特征在于，所述滤泡抑素是FS315或FS288。
15.如权利要求1~7中任一项所述的方法或应用，其特征在于，通过增加滤泡抑素转录或翻译来上调滤泡抑素功能水平。
16.如权利要求15所述的方法或应用，其特征在于，通过外源性遗传构建体使滤泡抑素体内表达。
17.如权利要求2~16中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述症状是非炎性症状。
18.如权利要求2~16中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述粘液分泌在炎症发作之前发生或通过非炎性机制调节。
19.如权利要求2~16中任一项所述的方法或应用，其特征在于，被降低的所述粘液分泌水平是正常水平。
20.如权利要求2~16中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述症状是其中肺清除机制受破坏的症状。
21.如权利要求2~16中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述症状是气喘、囊胞性纤维症、慢性阻塞性肺病、支气管扩张、原发性纤毛运动障碍、细支气管炎、肺动脉高血压、特发性肺纤维化免疫缺陷状态、低丙球蛋白血症、人免疫缺陷病毒感染、器官移植、血液学恶性症状、插管、粘液清除减弱、因麻醉、固定化或手术所致的肺清除机制破坏。
22.如权利要求8~21中任一项所述的方法或应用，其特征在于，全身性给予所述激活素拮抗剂或所述滤泡抑素。
23.如权利要求8~21中任一项所述的方法或应用，其特征在于，向气道组织局部给予所述激活素拮抗剂或所述滤泡抑素。
24.如权利要求23所述的方法或应用，其特征在于，所述气道组织是肺。
25.如权利要求24所述的方法或应用，其特征在于，所述给予通过鼻部或口部。
26.如权利要求25所述的方法或应用，其特征在于，所述给予通过吸入气溶胶或通过液体递送系统或喷雾器进行。
27.如权利要求1 ~26中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述哺乳动物是人。
【文档编号】A61K39/395GK104023731SQ201280064278
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2012年10月26日 优先权日:2011年10月28日
【发明者】R·奥赫希尔, C·哈迪, D·德克里斯尔 申请人:帕仁塔生物科技有限公司