包含脱细胞并再群体化的胎盘血管支架的类器官的制作方法

包含脱细胞并再群体化的胎盘血管支架的类器官的制作方法
【专利摘要】本文提供了包含脱细胞胎盘血管支架的类器官，其包含脱细胞胎盘血管支架或由其组成，以及其制备和使用方法。
【专利说明】包含脱细胞并再群体化的胎盘血管支架的类器官
[0001] 本申请要求2011年12月23日提交的美国临时申请第61/579, 942号、2012年1 月30日提交的美国临时申请第61/592, 350号和2012年9月4日提交的美国临时申请第 61/696, 527号的优先权，其中每一篇的公开内容以其全文引入本文作为参考。 1.

【技术领域】
[0002] 本文提供了包含脱细胞的胎盘血管支架的类器官（organoid)，其包含脱细胞胎盘 血管支架或由其组成，以及其制备和使用方法。 2.

【背景技术】
[0003] 对于生理功能性疾病的、损伤的或手术切除的组织的替代存在很大的医疗需求。 本文提供了包含脱细胞的胎盘血管支架的类器官，以及其制备和使用方法，满足了该需要。
[0004] 3.概述
[0005] 本文提供了包含一种或多种类型的细胞和脱细胞胎盘血管支架的类器官，其中所 述类器官执行器官或来自器官的组织的至少一种功能，其中所述器官或来自器官的组织的 至少一种功能是产生来自所述器官或组织的至少一种细胞类型所特有的蛋白、生长因子、 细胞因子、白介素或小分子；并且其中所述脱细胞胎盘血管支架包含基本上完整的胎盘脉 管基质；即，在脱细胞和随后的类器官产生过程中从中获得基质的胎盘的脉管结构基本上 得以保留。
[0006] 在各种实施方式中，所述类器官包含约，不多于，或至少1〇12、10 11、IOltl个细胞、IO9 个细胞、IO8个细胞、IO7个细胞、IO6个细胞、IO5个细胞、IO4个细胞、IO3个细胞或IO2个细胞。
[0007] 在本文任一实施方式的一种【具体实施方式】中，所述类器官另外还包含合成基质。 在更具体的实施方式中，所述合成基质稳定了所述类器官的三维结构。在某些具体实施方 式中，所述合成基质包含聚合物或热塑性材料。在某些【具体实施方式】中，所述合成基质为聚 合物或热塑性材料。在更具体的实施方式中，所述热塑性材料是聚己酸内酯（PCL)、聚乳酸、 聚对苯二甲酸丁二酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚酯、聚醋酸乙烯酯或聚氯乙烯。在 一种具体的实施方式中，热塑性材料为合成聚合物PCL。在某些其他【具体实施方式】中，所述 聚合物是聚偏二氯乙烯、聚（邻羧基苯氧基）-对二甲苯）（聚（O-CPX))、聚（交酯-酸酐） (PLAA)、n-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺、戊赤藓糖醇二丙烯酸酯、聚丙烯酸甲酯、羧甲基纤维 素、或聚（乳酸-羟基乙酸共聚物）（PLGA)。在某些其他【具体实施方式】中，所述聚合物是聚 丙烯酰胺。
[0008] 在某些【具体实施方式】中，所述所述类器官中的一种或多种类型的细胞包含自然杀 伤（NK)细胞，例如，⑶56+CD16^胎盘中间自然杀伤（PiNK)细胞。在某些其他【具体实施方式】 中，所述类器官包含树突状细胞。
[0009] 在某些【具体实施方式】中，所述类器官包含胸腺细胞。在某些其他实施方式中，所述 类器官包含胸腺细胞、淋巴细胞、上皮网状细胞和胸腺基质细胞。
[0010] 在某些其他【具体实施方式】中，所述类器官包含甲状腺滤泡细胞。在某些其他实施 方式中，所述类器官包含表达甲状腺球蛋白的细胞。在某些其他【具体实施方式】中，所述类器 官另外包含甲状腺上皮细胞和滤泡旁细胞。
[0011] 在某些【具体实施方式】中，所述类器官包含干细胞或祖细胞。在【具体实施方式】中，所 述干细胞或祖细胞为胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、诱导的多潜能干细胞、间充质干细胞、骨 髓间充质干细胞、骨髓来源的间充质基质细胞、⑶34_、⑶10+、⑶105+和⑶200+胎盘组织塑 料贴壁胎盘干细胞（PDAC?)、脐带干细胞、羊水干细胞、羊膜来源的贴壁细胞（AMDACs)， 成骨胎盘贴壁细胞（OPACs)、脂肪干细胞、角膜缘干细胞、牙髓干细胞、成肌细胞、内皮祖细 胞、神经元干细胞、脱落牙齿（exfoliatedteeth)来源的干细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞、 孤雌生殖（parthenogenically)来源的干细胞、重编程干细胞、羊膜来源的贴壁细胞、或侧 群干细胞。在某些其他【具体实施方式】中，所述类器官包含造血干细胞或造血祖细胞。在某 些其他【具体实施方式】中，所述类器官包含组织培养塑料贴壁⑶34_、⑶10+、⑶105+和⑶200+ 胎盘干细胞。在更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞另外是⑶45 -、⑶80 -、⑶86 -或⑶90+ 的一种或多种。在更具体的实施方式中，所述胎盘干细胞另外还是⑶45'⑶80'⑶86^和 CD90+。在另一更具体的实施方式中，当所述类器官被移植入受体时，所述胎盘干细胞抑制 所述受体中的免疫应答，例如，局部抑制所述受体中的免疫应答。
[0012] 在某些其他【具体实施方式】中，本文描述的任一类器官包含分化的细胞。在更加具 体的实施方式中，所述分化的细胞包含以下的一种或多种：
[0013] 内皮细胞、上皮细胞、真皮细胞、内胚层细胞、中胚层细胞、成纤维细胞、骨细胞、软 骨细胞、自然杀伤细胞、树突细胞、肝细胞、胰腺细胞、或间质细胞；
[0014] 唾液腺粘液细胞、唾液腺浆液细胞、vonEbner腺细胞、乳腺细胞、泪腺细胞、聍腺 细胞、外分泌汗腺暗细胞、外分泌汗腺清除细胞、顶泌汗腺细胞、Moll腺细胞、皮脂腺细胞、 鲍曼腺细胞（bowman'sglandcell)、Brunner腺细胞、精囊细胞、前列腺细胞、尿道球腺细 胞、Bartholin腺细胞、Littre腺细胞、子宫内膜细胞、分离的杯状细胞、胃粘膜粘液细胞、 胃底腺胃酶细胞、胃底腺泌酸细胞、胰腺腺泡细胞、潘氏细胞、II型肺泡细胞、克拉拉细胞、
[0015] 促生长激素细胞（somatotrope)、乳促素细胞、促甲状腺细胞、促性腺细胞、促皮 质激素细胞、中间垂体细胞、大细胞神经分泌细胞、肠细胞、呼吸道细胞、甲状腺上皮细胞、 滤泡旁细胞、副甲状腺细胞、副甲状腺主细胞、嗜酸细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸间质 细胞、鞘内细胞、黄体细胞、颗粒黄体细胞、鞘黄体细胞、近血管球细胞、致密斑细胞、极周细 胞、系膜细胞，
[0016] 血管和淋巴管内皮穿孔细胞、血管和淋巴管内皮连续细胞、血管和淋巴管内皮脾 脏细胞、滑膜细胞、浆膜细胞（腹膜、胸膜和心包腔）、鳞状细胞、柱状细胞、暗细胞、前庭膜 细胞（耳朵的衬内淋巴空间）、血管纹基底细胞，血管纹边缘细胞（耳朵的衬内淋巴空间）、 Claudius细胞、Boettcher细胞、脉络丛细胞、软膜蛛网膜鳞片状细胞、色素睫状上皮细胞、 非色素睫状上皮细胞、角膜内皮细胞、钉形细胞，
[0017] 呼吸道纤毛细胞、输卵管纤毛细胞、子宫内膜纤毛细胞、睾丸网纤毛细胞、输精小 管纤毛细胞、纤毛室管膜细胞，
[0018] 表皮角质细胞，表皮基底细胞、手指甲和脚趾甲角质细胞、甲床基底细胞、脊髓毛 干细胞、外皮毛干细胞、表皮毛干细胞、表皮毛根鞘细胞、Huxley层毛根鞘细胞、Henle层毛 根鞘细胞、外毛根鞘细胞、毛基质细胞，
[0019] 复层扁平上皮的表面上皮细胞、上皮基底细胞、泌尿上皮细胞，
[0020] 柯蒂氏器官听觉内毛细胞、柯蒂氏器官听觉外毛细胞、嗅上皮基底细胞、冷敏感的 初级感觉神经元、热敏初级感觉神经元、Merkel表皮细胞、嗅觉受体神经元、痛觉初级感觉 神经元、光受体视杆细胞、光受体蓝色敏感圆锥细胞、光受体绿色敏感圆锥细胞、光受体红 色敏感圆锥细胞、本体感受初级感觉神经元、触摸感应初级感觉神经元、I型颈动脉体细胞、 II型颈动脉体细胞（血液PH传感器）、耳前庭器官I型毛细胞（加速度和重力）、耳前庭器 官II型毛细胞、I型味蕾细胞，
[0021] 胆碱能神经细胞、肾上腺素能神经细胞、肽能神经细胞，
[0022] 柯蒂氏器官内柱细胞、柯蒂氏器官外柱细胞、柯蒂氏器官内指细胞、柯蒂氏器官外 指细胞、柯蒂氏器官边缘细胞、柯蒂氏器官Hensen细胞、前庭器官支持细胞、味蕾支持细 胞、嗅上皮支持细胞、Schwann细胞、卫星细胞、肠胶质细胞，
[0023] 星形细胞、神经原、寡树突细胞、纺锤体神经元，
[0024] 前晶状体上皮细胞、含晶体蛋白的晶状体纤维细胞，
[0025] 肝细胞、脂肪细胞、白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞、肝脂肪细胞，
[0026] 肾小球壁细胞、肾小球足细胞、肾近端小管刷状缘细胞、亨利氏套薄段细胞、肾远 端小管细胞、肾集合管细胞、I型肺泡壁细胞、胰管细胞、无横纹管细胞、管细胞、肠刷状缘 细胞、外分泌腺纹状管细胞、胆囊上皮细胞、输精小管非纤毛细胞、附睾主细胞、附睾基底细 胞，
[0027] 造釉上皮细胞、半月面上皮细胞、柯蒂氏器官牙间上皮细胞、疏松结缔组织成纤维 细胞、角膜基质细胞、肌腱成纤维细胞、骨髓网状组织成纤维细胞、非上皮成纤维细胞、周细 胞、髓核细胞、成牙骨质细胞/牙骨质细胞、成牙质细胞、牙质细胞、透明软骨软骨细胞、纤 维软骨软骨细胞、弹性软骨软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、骨祖细胞、玻璃体细胞、 星状细胞（耳）、肝星状细胞（Ito细胞）、胰星状细胞，
[0028] 红色骨骼肌细胞、白色骨骼肌细胞、中间骨骼肌细胞、肌梭核袋细胞、肌梭核链细 胞、卫星细胞、普通心肌细胞、节点心肌细胞、浦肯野纤维细胞、平滑肌细胞、虹膜肌上皮细 胞、外分泌腺肌上皮细胞，
[0029] 网织红细胞、巨核细胞、单核细胞、结缔组织巨噬细胞、表皮Langerhans细胞、树 突状细胞、小胶质细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、 抑制T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞，
[0030] 黑素细胞、视网膜色素上皮细胞，
[0031] 卵原细胞/卵母细胞、精子细胞、精母细胞、精原细胞、精细胞、卵巢卵泡细胞、 Sertoli细胞、胸腺上皮细胞和/或间质肾细胞。
[0032]在某些其他【具体实施方式】中，所述细胞是原代培养细胞。在另一【具体实施方式】 中，细胞是已在体外培养的细胞。在某些其他【具体实施方式】中，所述细胞经过基因工程改 造以产生该细胞天然不产生的蛋白或多肽，或经过基因工程改造以产生比该细胞天然产生 的量更多的蛋白或多肽。在【具体实施方式】中，所述蛋白或多肽是细胞因子或包含其活性部 分的肽。在更具体的实施方式中，所述细胞因子是肾上腺髓质素（AM)、血管生成素（Ang)、 骨形态发生蛋白（BMP)、脑源性神经营养因子（BDNF)、表皮生长因子（EGF)、促红细胞生成 素（Epo)、成纤维细胞生长因子（FGF)、胶质细胞系来源的神经营养因子（GNDF)、粒细胞集 落刺激因子（G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、生长分化因子（GDF-9)、 肝细胞生长因子（HGF)、肝癌衍生生长因子（HDGF)、胰岛素样生长因子（IGF)、迁移-刺激 因子、肌生成抑制蛋白（⑶F-8)、髓单核细胞生长因子（MGF)、神经生长因子（NGF)、胎盘 生长因子（PlGF)、血小板来源的生长因子（PDGF)、促血小板生成素（Tpo)、转化生长因子 α(TGF-α)、TGF-β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮生长因子（VEGF)、或Wnt蛋白中 的一种或多种。在任一上述实施方式中，个体的所述类器官，例如，包含IXlO8个细胞的类 器官，在生长培养基中体外培养24小时后产生至少1. 0-10μM的所述细胞因子。
[0033] 在其他更具体的实施方式中，所述蛋白或多肽是AM、Ang、BMP、BDNF、EGF、Epo、FGF、 GNDF、G-CSF、GM-CSF、⑶F-9、HGF、HDGF、IGF、迁移-刺激因子、⑶F-8、MGF、NGF、PIGF、PDGF、Tpo、TGF-a、TGF-β、TNF-a、VEGF、或Wnt蛋白的可溶性受体。在其他【具体实施方式】中，个 体的所述类器官，例如，包含IXIO8个细胞的类器官，在生长培养基中体外培养24小时产 生后至少1. 0-10μM的所述可溶性受体。
[0034] 在其他【具体实施方式】中，所述蛋白或多肽是白介素或其活性部分。在多种更具 体的实施方式中，所述白介素是白介素-la(IL-Ia)、IL-Ιβ、IL-1F1、IL-1F2、IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-8、IL-9、IL-10、IL-ll、IL-1235kDaa亚单位、IL-1240kDaP亚单位、IL-12a和β亚 单位、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F同种 型 1、IL-17F同种型 2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23pl9 亚单位、IL-23p40 亚 单位、IL-23pl9 亚单位和IL-23p40 亚单位一起、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27B、IL-27-p28、 IL-27B和IL-27-p28 -起、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、 IL-35、IL-36a、IL-36i3、IL-36γ。在其他更具体的实施方式中，个体的所述类器官，例如， 包含IXIO8个细胞的类器官，在生长培养基中体外培养24小时后产生至少1. 0-10μM的 所述白介素或其活性部分。
[0035]在某些更加具体的实施方式中，所述蛋白或多肽是IL-Ia、IL-Iβ、IL-1F1、 IL-1F2、IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-1235kDaa亚单位、IL-1240kDaβ亚单位、IL-13、 IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F同种型 1、IL-17F 同种型 2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23pl9 亚单位、IL-23p40 亚单位、IL-24、 IL-25、IL-26、IL-27B、IL-27-p28、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、 IL-34、IL-35、IL-36a、IL-36 0、IL-36y的可溶性受体。在更具体的实施方式中，个体的 所述类器官，例如，包含IXIO8个细胞的类器官，在生长培养基中体外培养24小时后产生 至少1. 0-10μM的所述可溶性受体。
[0036] 在另一更具体的实施方式中，所述蛋白是干扰素（IFN)。在【具体实施方式】中，所述 干扰素是IFN-a、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-K、IFN-ε、IFN-κ、 IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ω、或IFN-v。在其他【具体实施方式】中，个体的所述类器官，例 如，包含IXIO8个细胞的类器官，在生长培养基中体外培养24小时后产生至少1. 0-10μM 的所述干扰素。
[0037]在其他更具体的实施方式中，所述蛋白或多肽是IFN-a、IFN-β、IFN-Y、 IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-K、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ω、或 IFN-v的可溶性受体。在某些【具体实施方式】中，个体的所述类器官，例如，包含IXIO8个细 胞的类器官，在生长培养基中体外培养24小时后产生至少1. 0-10μM的所述可溶性受体。
[0038] 在另一【具体实施方式】中，所述蛋白是胰岛素或前胰岛素。在一种具体的实施方式 中，个体的所述类器官，例如，包含IXIO8个细胞的类器官，在生长培养基中体外培养24小 时后产生至少1.〇-1〇μΜ的所述胰岛素。在另一种【具体实施方式】中，所述蛋白是胰岛素受 体。在某些更为具体的实施方式中，所述产生胰岛素或前胰岛素的细胞被另外基因工程改 造以产生前激素转化酶1、前激素转化酶2、或羧肽酶E中的一种或多种。
[0039] 在另一【具体实施方式】中，所述蛋白是瘦蛋白（LEP)。在另一种【具体实施方式】中，个 体的所述类器官，例如，包含IX10*个细胞的类器官，在生长培养基中体外培养24小时产 生至少1. 0-10μM的所述瘦蛋白。
[0040] 在另一【具体实施方式】中，所述蛋白是促红细胞生成素。在另一【具体实施方式】中，个 体的所述类器官，例如，包含IX10*个细胞的类器官，在生长培养基中体外培养24小时后 产生至少I.O-IOyM的所述促红细胞生成素。在另一【具体实施方式】中，所述蛋白是促血小 板生成素。在另一【具体实施方式】中，该类器官，例如，包含IXIO8个细胞，且例如，在生长培 养基中体外培养24小时产生至少1. 0-10μM的所述促血小板生成素。
[0041] 在另一【具体实施方式】中，所述蛋白是酪氨酸3-单氧酶。在某些【具体实施方式】 中，包含被基因工程改造以表达酪氨酸3-单氧酶的细胞的个体的所述类器官，例如，包含 IXIO8个此种细胞的类器官，在生长培养基中体外培养24小时后产生至少1. 0-10μM的 L-D0PA。在更具体的实施方式中，所述表达酪氨酸3-单氧酶的细胞被进一步工程化以表达 芳香族L-氨基酸脱羧酶。在更具体的实施方式中，个体的所述类器官，例如，包含IXIO8个 细胞的类器官，在生长培养基中体外培养24小时后产生至少1. 0-10μM的多巴胺。
[0042] 在某些其他【具体实施方式】中，所述蛋白是激素或前激素。在多个【具体实施方式】 中，所述激素是缪氏管抑制激素（ΑΜΗ)、脂联素（Acrp30)、促肾上腺皮质激素（ACTH)、血 管紧张素（AGT)、血管紧张素原（AGT)、抗利尿激素（ADH)、血管加压素、心房-利尿钠肽 (ANP)、降钙素（CT)、胆囊收缩素（CCK)、促肾上腺皮质素-释放激素（CRH)、促红细胞生成 素（Epo)、卵泡-刺激激素（FSH)、睾酮、雌激素、胃泌素（GRP)、饥饿素、胰高血糖素（GCG)、 促性腺素-释放激素（GnRH)、生长激素（GH)、生长激素释放激素（GHRH)、人绒膜促性腺激 素（hCG)、人胎盘催乳素（HPL)、抑制素、黄体生成素（LH)、黑素细胞刺激激素（MSH)、食欲 素、催产素（OXT)、副甲状腺激素（PTH)、催乳素（PRL)、松弛素（RLN)、分泌素（SCT)、生长抑 素（SRIF)、促血小板生成素（Τρο)、甲状腺-刺激激素（Tsh)、和/或促甲状腺素-释放激素 (TRH)。
[0043] 在另一【具体实施方式】中，蛋白是细胞色素P450侧链裂解酶（P450SCC)。
[0044] 在另一【具体实施方式】中，所述蛋白是患有遗传缺陷或疾病的个体中缺失或失能的 蛋白。在某些【具体实施方式】中，所述遗传疾病是家族性高胆留醇血症，所述蛋白是低密度脂 蛋白受体（LDLR);所述遗传疾病是多囊性肾病，所述蛋白是多囊蛋白-l(PKDl)、PKD-2或 PKD3;或所述遗传疾病是苯丙酮尿症，所述蛋白是苯丙氨酸羟化酶。
[0045] 在本文公开的任一类器官的一种具体的实施方式中，所述类器官包含免疫抑制性 化合物或抗炎性化合物。在【具体实施方式】中，所述免疫抑制性或抗炎性化合物是非留体抗 炎性药物（NSAID)、对乙酰氨基酚、萘普生、布洛芬、阿司匹林、留体、抗-T细胞受体抗体、 抗-IL-2受体抗体、巴利昔单抗、达利珠单抗（ZENAPAX?)、抗T细胞受体抗体（例如， 莫罗莫那-CD3)、咪唑硫嘌呤、皮质类固醇、环孢霉素、他克莫司、霉酚酸酯、西罗莫司、钙调 神经磷酸酶抑制剂，等等。在一种具体的实施方式中，免疫抑制剂是抗巨噬细胞炎性蛋白 (MIP)-Ia或MIP-Iβ中和抗体。
[0046] 在本文公开的任一类器官的某些实施方式中，所述类器官在对个体给药后维持所 述至少一种生理功能1、2、3、4、5、6或7天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周或更多周。
[0047] 在本文所述的任一类器官的某些【具体实施方式】中，所述类器官执行肝、肾、胰腺、 甲状腺或肺的至少一种功能。
[0048]类器官可以包含垂体特异性细胞和/或执行垂体特异性功能的细胞。在某些实施 方式中，本文所述的任一类器官包含垂体腺嗜酸细胞。在某些其他实施方式中，本文所述的 任一类器官包含垂体嗜碱细胞。在某些其他实施方式中，本文所述的任一类器官包含垂体 腺嗜酸细胞和嗜碱细胞。在另一种实施方式中，本文所述的任一类器官包含垂体促生长激 素细胞（somatotrope)。在另一种实施方式中，本文所述的任一类器官包含垂体催乳激素细 胞。在另一种实施方式中，本文所述的任一类器官包含垂体促肾上腺皮质激素细胞。在另 一种实施方式中，本文所述的任一类器官包含垂体促甲状腺激素细胞。在另一种实施方式 中，本文所述的任一类器官包含垂体促性腺细胞。在另一种实施方式中，本文所述的任一类 器官包含所述类器官包含两种或更多种的垂体生长激素细胞（somatotroph)、垂体催乳激 素细胞、垂体促肾上腺皮质激素细胞、垂体促甲状腺激素细胞、和/或垂体促性腺细胞。在 本文所述的任一类器官的另一种实施方式中，所述类器官在体外培养中产生可检测量的生 长激素（GH)。在本文所述的任一类器官的另一种实施方式中，所述类器官在体外培养中产 生可检测量的促生长激素（STH)。在本文所述的任一类器官的另一种实施方式中，所述类器 官在体外培养中产生可检测量的催乳素（PRL)。在本文所述的任一类器官的另一种实施方 式中，所述类器官在体外培养中产生可检测量的促肾上腺皮质激素（ACTH)。在本文所述的 任一类器官的另一种实施方式中，所述类器官在体外培养中产生可检测量的黑素细胞-刺 激激素（MSH)。在本文所述的任一类器官的另一种实施方式中，所述类器官在体外培养中产 生可检测量的甲状腺-刺激激素（TSH)。在本文所述的任一类器官的另一种实施方式中，所 述类器官在体外培养中产生可检测量的卵泡-刺激激素（FSH)。在本文所述的任一类器官 的另一种实施方式中，所述类器官在体外培养中产生可检测量的黄体生成素（LH)。在本文 所述的任一类器官的另一种实施方式中，所述类器官包含产生GH、STH、PRL、ACTH、MSH、TSH、 FSH、和/或LH中的一种或多种的细胞。在一种具体的实施方式中，所述细胞经过基因工程 改造以产生GH、STH、PRL、ACTH、MSH、TSH、FSH、和/或LH中的一种或多种。
[0049]在本文所述的任一类器官的另一种实施方式中，所述类器官包含下丘脑神经元和 /或垂体细胞。在本文所述的任一类器官的另一种实施方式中，所述类器官在体外培养中 产生可检测量的抗利尿激素（ADH)。在本文所述的任一类器官的另一种实施方式中，所述 类器官在体外培养中产生可检测量的催产素。在本文所述的任一类器官的另一种实施方式 中，所述类器官包含产生ADH和/或催产素中的一种或两种的细胞。在一种具体的实施方 式中，所述类器官包含经过基因工程改造以产生ADH和/或催产素中的一种或两种的细胞。
[0050] 在【具体实施方式】中，本文提供的任一类器官包含内皮血管形成细胞。
[0051] 类器官可以包含甲状腺特异性细胞和/或执行甲状腺特异性功能的细胞。在某些 实施方式中，本文提供的任一类器官包含甲状腺上皮细胞。在某些实施方式中，本文提供的 任一类器官包含甲状腺滤泡旁细胞。在某些实施方式中，本文提供的任一类器官包含产甲 状腺球蛋白细胞。在某些实施方式中，本文提供的任一类器官包含两种或更多种的甲状腺 上皮细胞、甲状腺滤泡旁细胞和产甲状腺球蛋白细胞。在【具体实施方式】中，本文提供的任一 类器官包含内皮血管形成细胞。在其他【具体实施方式】中，所述类器官包含多种血管，例如， 血管和/或淋巴管。在本文所述的任一类器官的某些实施方式中，所述类器官在体外培养 中产生可检测量的甲状腺素（T4)。在本文呈现的任一类器官的某些其他实施方式中，所述 类器官在体外培养中产生可检测量的三碘甲状腺原氨酸（T3)。在本文呈现的任一类器官的 某些其他实施方式中，所述类器官产生可检测量的降钙素。在本文所述的任一类器官的某 些其他实施方式中，所述类器官包含产生T3、T4和/或降钙素中的一种或多种的细胞。在 更为具体的实施方式中，所述类器官包含基因工程改造以产生T3、T4和/或降钙素中的一 种或多种的细胞。
[0052] 类器官可以包含副甲状腺特异性细胞、或执行副甲状腺特异性功能的细胞。在本 文所述的任一类器官的某些实施方式中，所述类器官包含副甲状腺主细胞。在本文呈现的 任一类器官的其他实施方式中，所述类器官包含副甲状腺嗜酸细胞。在本文呈现的任一类 器官的其他实施方式中，所述类器官包含副甲状腺主细胞和副甲状腺嗜酸细胞。在某些实 施方式中，本文提供的任一类器官包含内皮血管形成细胞。在其他【具体实施方式】中，所述类 器官包含多种血管，例如，血管和/或淋巴管。在本文所述的任一类器官的某些实施方式 中，所述类器官在体外培养中产生可检测量的副甲状腺激素（PTH)。在本文呈现的任一类器 官的其他实施方式中，所述类器官包含产生PTH的细胞。在更为具体的实施方式中，所述类 器官包含被基因工程改造以产生所述PTH的细胞。
[0053] 类器官可以包含肾上腺特异性细胞和/或执行肾上腺特异性功能的细胞。在本文 所述的任一类器官的某些实施方式中，所述类器官包含肾上腺球状带细胞。在本文呈现的 任一类器官的其他实施方式中，所述类器官包含肾上腺束状细胞。在本文呈现的任一类器 官的其他实施方式中，所述类器官包含肾上腺网状带细胞。在本文呈现的任一类器官的其 他实施方式中，所述类器官包含肾上腺嗜铬细胞。在某些实施方式中，本文提供的任一类器 官包含内皮血管形成细胞。在其他【具体实施方式】中，所述类器官包含多种血管，例如，血管 和/或淋巴管。在本文所述的任一类器官的某些实施方式中，所述类器官在体外培养中产 生可检测量的醛固酮。在本文呈现的任一类器官的其他实施方式中，所述类器官在体外培 养中产生可检测量的18羟基11脱氧皮质酮。在本文呈现的任一类器官的其他实施方式中， 所述类器官在体外培养中产生可检测量的氟氢可的松。在本文呈现的任一类器官的其他实 施方式中，所述类器官产生可检测量的可的松。在本文呈现的任一类器官的其他实施方式 中，所述类器官产生可检测量的非可的松糖皮质激素。在本文呈现的任一类器官的其他实 施方式中，所述类器官产生可检测量的肾上腺素。在本文呈现的任一类器官的其他实施方 式中，所述类器官产生可检测量的肾上腺留酮。在本文呈现的任一类器官的其他实施方式 中，所述类器官产生可检测量的脱氢表雄（留）酮。在本文呈现的任一类器官的其他实施 方式中，所述类器官包含产生醛固酮、18羟基11脱氧皮质酮、可的松、氟氢可的松、非可的 松糖皮质激素、肾上腺素、肾上腺留酮、和/或脱氢表雄酮中的一种或多种的细胞。在本文 所述的任一类器官的其他实施方式中，所述类器官产生醛固酮、18羟基11脱氧皮质酮、可 的松、氟氢可的松、非可的松糖皮质激素、肾上腺素、肾上腺留酮、和/或脱氢表雄酮中的两 种或更多种。在更为具体的实施方式中，所述类器官包含被基因工程改造以产生醛固酮、18 羟基11脱氧皮质酮、可的松、氟氢可的松、非可的松糖皮质激素、肾上腺素、肾上腺留酮、和 /或脱氢表雄酮中的一种或多种的细胞。
[0054] 本文提供的类器官可包含肝特异性细胞、或执行一种或多种肝特异性功能的细 胞。在本文提供的任一类器官的某些实施方式中，所述类器官包含肝细胞。在本文提供 的任一类器官的多种实施方式中，所述类器官产生可检测量的凝血因子I(纤维蛋白原）； 凝血因子II(凝血酶原）；凝血因子V(第5因子）；凝血因子VII(前转变素）；凝血因子 IX(Christmas因子）；凝血因子X(Stuart-Prower因子；凝血酶原酶）；凝血因子XI(血楽 促凝血酶原激酶前体）；蛋白C(自凝血酶原IIA;血凝血因子XIV)、蛋白S和/或抗凝血酶 中的一种或多种。在本文提供的任一类器官的多种其他实施方式中，所述类器官从氨基酸、 乳酸盐、甘油或糖原产生可检测量的葡萄糖。在其他实施方式中，所述类器官产生可检测量 的胰岛素样生长因子（IGF-I)或促血小板生成素。在其他实施方式中，所述类器官产生胆 汁。在本文提供的任一类器官的某些实施方式中，所述类器官包含产生凝血因子I(纤维 蛋白原）；凝血因子II(凝血酶原）；凝血因子V(第5因子）；凝血因子VII(前转变素）； 凝血因子IX(Christmas因子）；凝血因子X(Stuart_Prower因子；凝血酶原酶）；凝血因子 XI(血浆促凝血酶原激酶前体）；蛋白C(自凝血酶原IIA;血凝血因子XIV)、蛋白S、抗凝血 酶、IGF-I或促血小板生成素中的一种或多种的细胞。在本文提供的任一类器官的某些实 施方式中，所述类器官包含肝血管内皮细胞。在一种具体的实施方式中，所述肝血管内皮细 胞在所述类器官中配置以定义一条或多条血管。在更具体的实施方式中，所述肝细胞沿着 并基本平行于所述血管进行配置。
[0055] 本文提供的类器官还可包含胰腺细胞，或可包含执行至少一种胰腺细胞特异性功 能的细胞。在某些实施方式中，所述胰腺细胞是胰腺α细胞。在本文提供的任一类器官的 某些实施方式中，所述类器官包含胰腺β细胞。在本文提供的任一类器官的其他实施方式 中，所述类器官包含胰腺S细胞。在本文提供的任一类器官的其他实施方式中，所述类器 官包含胰腺PP细胞。在本文提供的任一类器官的其他实施方式中，所述类器官包含胰腺ε 细胞。在本文提供的任一类器官的其他实施方式中，所述类器官包含胰腺α细胞、胰腺β 细胞，胰腺S细胞、胰腺PP细胞和/或胰腺ε细胞中的两种或更多种。在本文提供的任 一类器官的其他实施方式中，所述类器官产生可检测量的胰高血糖素。在本文提供的任一 类器官的其他实施方式中，所述类器官产生可检测量的胰岛素。在本文提供的任一类器官 的其他实施方式中，所述类器官产生可检测量的胰淀素。在更具体的实施方式中，所述类器 官产生可检测量的胰岛素和可检测量的胰淀素。在更具体的实施方式中，所述胰岛素和所 述胰淀素比例为约50:1至约200:1。在本文提供的任一类器官的其他实施方式中，所述类 器官产生可检测量的生长抑素。在本文提供的任一类器官的其他实施方式中，所述类器官 产生可检测量的生长激素释放肽（Grehlin)。在本文提供的任一类器官的其他实施方式中， 所述类器官产生可检测量的胰多肽。在本文提供的任一类器官的其他实施方式中，所述类 器官包含产生可检测量的胰岛素、胰高血糖素、胰淀素、生长抑素、胰多肽、和/或生长激素 释放肽中的一种或多种的细胞。
[0056] 在另一方面，本文提供了本文提供的类器官在治疗个体的方法中的使用方法，例 如，患有器官或组织的一种或多种生物分子或生理功能缺陷的个体。在一种实施方式中，例 如，本文提供了一种治疗需要人生长激素（hGH)的个体的方法，包括向所述个体施用产生 hGH的类器官，或包含产生hGH的细胞的类器官，例如，治疗有效量的hGH。在某些其他实施 方式中，本文提供了一种治疗需要促生长激素（STH)的个体的方法，包括向所述个体施用 产生STH的类器官，或包含产生STH的细胞的类器官，例如，治疗有效量的STH。
[0057] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要催乳素（PRL)的个体的方法，包 括向所述个体施用产生PRL的类器官，或包含产生PRL的细胞的类器官，例如，治疗有效量 的PRL。在【具体实施方式】中，所述个体患有代谢综合征、动脉性勃起功能障碍、早泄、少精症、 弱精子症、精囊机能减退、或雄激素缺乏中的一种或多种。
[0058] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要促肾上腺皮质激素（ACTH)的个 体的方法，包括向所述个体施用产生ACTH的类器官，或包含产生ACTH的细胞的类器官，例 如，治疗有效量的ACTH。在一种具体的实施方式中，所述个体患有阿狄森氏病。
[0059] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要黑素细胞-刺激激素（MSH)的个 体的方法，包括向所述个体施用产生MSH的类器官，或包含产生MSH的细胞的类器官，例如， 治疗有效量的MSH。在一种具体的实施方式中，所述个体患有阿尔茨海默病。
[0060] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要甲状腺-刺激激素（TSH)的个体 的方法，包括向所述个体施用产生TSH的类器官，或包含产生TSH的细胞的类器官，例如，治 疗有效量的TSH。在一种具体的实施方式中，所述个体患有或表现为呆小症。
[0061] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要卵泡-刺激激素（FSH)的个体的 方法，包括向所述个体施用产生FSH的类器官，或包含产生FSH的细胞的类器官，例如，治疗 有效量的FSH。在一种具体的实施方式中，所述个体患有或表现为不孕或无精症。
[0062] 在另一种实施方式中，本文提供了治疗需要黄体生成素（LH)的个体的方法，包括 向所述个体施用产生LH的类器官，或包含产生LH的细胞的类器官，例如，治疗有效量的LH。 在一种具体的实施方式中，所述个体患有或表现为低睾酮、低精子数或不孕。
[0063] 本文进一步提供了一种治疗需要抗利尿激素（ADH)的个体的方法，包括向所述个 体施用产生ADH的类器官，或包含产生ADH的细胞的类器官，例如，治疗有效量的ADH。在一 种具体的实施方式中，所述个体患有下丘脑性尿崩症。
[0064] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要催产素的个体的方法，包括向所 述个体施用产生催产素的类器官，或包含产生催产素的细胞的类器官，例如，治疗有效量的 催产素。
[0065] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要甲状腺素（T4)的个体的方法，包 括向所述个体施用产生T4的类器官，或包含产生T4的细胞的类器官，例如，治疗有效量的T4。在一种具体的实施方式中，所述个体患有或表现为智障、侏儒症、虚弱、昏睡、不耐寒、或 满月脸（moonface)。
[0066] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要三碘甲状腺原氨酸（T3)的个体 的方法，包括向所述个体施用产生Τ3的类器官，或包含产生Τ3的细胞的类器官，例如，治疗 有效量的Τ3。在一种具体的实施方式中，所述个体患有心脏病。在更具体的实施方式中，所 述个体在施用所述类器官前具有低于3.lpmol/L的Τ3血清浓度。
[0067] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要降钙素的个体的方法，包括向所 述个体施用产生降钙素的类器官，或包含产生降钙素的细胞的类器官，例如，治疗有效量的 降钙素。在一种具体的实施方式中，所述个体患有骨质疏松或慢性自身免疫性甲状腺机能 减退。
[0068] 本文进一步提供了一种治疗需要副甲状腺激素（PTH)的个体的方法，包括向所述 个体施用产生PTH的类器官，或包含产生PTH的细胞的类器官，例如，治疗有效量的PTH。 [0069] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要醛固酮的个体的方法，包括向所 述个体施用产生醛固酮或包含产生醛固酮的细胞的类器官，例如，治疗有效量的醛固酮。在 一种具体的实施方式中，所述个体患有自发性醛留酮过少症、血肾素过高的醛留酮过少症 或血肾素减少的醛留酮过少症。在另一【具体实施方式】中，所述个体患有慢性肾功能不全。
[0070] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要18羟基11脱氧皮质酮的个体的 方法，包括向所述个体施用产生18羟基11脱氧皮质酮的类器官，或包含产生18羟基11脱 氧皮质酮的细胞的类器官，例如，治疗有效量的18羟基11脱氧皮质酮。
[0071] 本文进一步提供了一种治疗需要氟氢可的松的个体的方法，包括向所述个体施用 产生氟氢可的松的类器官，或包含产生氟氢可的松的细胞的类器官，治疗有效量的氟氢可 的松。
[0072] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要可的松的个体的方法，该方法包 括向所述个体施用产生可的松的类器官，或包含产生可的松的细胞的类器官，例如，治疗有 效量的可的松。在一种具体的实施方式中，所述个体患有急性肾上腺不足、阿狄森氏病或低 血糖。
[0073] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要非可的松糖皮质激素的个体的方 法，该方法包括向所述个体施用产生非可的松糖皮质激素的类器官，或包含产生非可的松 糖皮质激素的细胞的类器官，例如，治疗有效量的所述非可的松糖皮质激素。
[0074] 本文进一步提供了一种治疗需要肾上腺素的个体的方法，该方法包括向所述个体 施用产生肾上腺素的类器官，或包含产生肾上腺素的细胞的类器官，例如，治疗有效量的肾 上腺素。
[0075] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要肾上腺留酮的个体的方法，包括 向所述个体施用产生肾上腺留酮的类器官，或包含产生肾上腺留酮的细胞的类器官，例如， 治疗有效量的肾上腺甾酮。
[0076] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要脱氢表雄酮的个体的方法，包括 向所述个体施用多种，例如，治疗有效量的，产脱氢表雄酮的类器官或包含产脱氢表雄酮的 细胞的类器官。
[0077] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要化合物的个体的方法，包括施用 产生所述化合物的类器官或包含产生所述化合物的细胞的类器官，例如，治疗有效量的所 述化合物，其中所述化合物为凝血因子1(纤维蛋白原）；凝血因子11(凝血酶原）；凝血 因子V(第5因子）；凝血因子VII(前转变素）；凝血因子IX(Christmas因子）；凝血因 子X(Stuart-Prower因子；凝血酶原酶）；凝血因子XI(血楽促凝血酶原激酶前体）；蛋白 C(自凝血酶原IIA;血凝血因子XIV)，蛋白S和/或抗凝血酶。
[0078] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要IGF-I的个体的方法，包括向所 述个体施用产生IGF-I的类器官，或包含产生IGF-I的细胞的类器官，例如，治疗有效量的 IGF-I。
[0079] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要促血小板生成素的个体的方法， 包括向所述个体施用产生促血小板生成素的类器官，或包含产生促血小板生成素的细胞的 类器官，例如，治疗有效量的促血小板生成素。
[0080] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要胰高血糖素的个体的方法，包括 向所述个体施用产生胰高血糖素的类器官，或包含产生胰高血糖素的细胞的类器官，例如， 治疗有效量的膜1?血糖素。
[0081] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要胰岛素的个体的方法，包括向所 述个体施用产生胰岛素的类器官，或包含产生胰岛素的细胞的类器官，例如，治疗有效量的 胰岛素。在一种具体的实施方式中，所述个体患有糖尿病。
[0082] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要胰淀素的个体的方法，包括向所 述个体施用产生胰淀素的类器官，或包含产生胰淀素的细胞的类器官，例如，治疗有效量的 胰淀素。
[0083] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要生长激素释放肽（grehlin)的个 体的方法，包括向所述个体施用产生生长激素释放肽的类器官，或包含产生生长激素释放 肽的细胞的类器官，例如，治疗有效量的生长激素释放肽。
[0084] 本文进一步提供了一种治疗需要胰多肽的个体的方法，包括向所述个体施用产生 胰多肽的类器官，或包含产生胰多肽的细胞的类器官，例如，治疗有效量的胰多肽。
[0085] 本文使用的"类器官"指至少一种细胞种类和胎盘血管支架或其部分的组合，其中 该组合执行组织、腺体或器官的至少一种生理功能。在某些实施方式中，本文描述的类器官 的胎盘血管支架包含脱细胞人胎盘血管支架（DHPVS)。在某些实施方式中，本文描述的类 器官包含完整DHPVS，S卩，包含已按照本文描述的方法脱细胞的完整人胚胎胎盘。在某些实 施方式中，本文描述的类器官包含一部分胎盘，例如，一部分DHPVS。在一种具体的实施方 式中，本文描述的类器官包含一部分胎盘，例如，一部分DHPVS，其中所述部分包含脉管的一 个或多个胎盘区域，例如，一个或多个子叶，其是包含不同血管域的胎盘的底蜕膜的分隔体 (separations)。在另一【具体实施方式】中，本文描述的类器官包含一部分胎盘，例如，一部分 DHPVS，其中所述部分包含从胎盘剩余部分移除并按照本文描述的方法脱细胞的一部分胎 盘，脱细胞在所述从胎盘剩余部分移除之前或随后。例如，该部分具有期望的大小和形状， 例如立方体，其从胎盘（例如，DHPVS)移除（例如，切除或压出（stampedout))。
[0086] 在某些实施方式中，产生本文描述的类器官的方法包括生物打印一种或多种细胞 类型至脱细胞胎盘血管支架上或其内部。本文使用的"生物打印"一般指使用标准或改进的 打印技术（例如喷墨印刷技术）将材料（例如活细胞）以及任选的其他元件（例如，胞外 基质；合成基质）沉积至表面上。将细胞沉积至表面上和生物打印细胞（包括细胞组合水 凝胶）的基本方法描述于Warren等人，US6, 986, 739,Boland等人，US7, 051，654,Yoo等 人，US2009/0208466和Xu等人，US2009/0208577,其各自公开内容在此全文引入作为参 考。另外，可用于产生本文提供的类器官的生物打印机是可商购的，例如，来自Envisiontec GmbH(Gladbeck，Germany)的 3D_BioplotterTM;和来自Organovo(SanDiego，CA)的NovoGen MMXBioprinter?。
[0087] 3· 1附图简述
[0088] 图1描述了生长于脱细胞人胎盘血管支架（DHPVS;"P1+细胞"）上的293/GFP细 胞相对于该细胞在对照培养基中（"细胞"）的生长。
[0089] 图2描述了胎盘干细胞在DHPVS( "有基质"）中的生长相对于该细胞在对照培养 基（"无基质"）中的生长。
[0090] 图3描述了肝细胞细胞在DHPVS中随时间的生长。
[0091] 图4描述了白蛋白分泌分析结果。对由在DHPVS("T+C"）中培养的肝细胞分泌的 白蛋白与单独的培养基（"Med"）、单独的DHPVS和培养物中生长的肝细胞（"细胞"）中的 白蛋白水平进行了对比。
[0092] 图5描述了包含聚己酸内酯（PCL)的支架，其以各种角度生物打印，从而产生了具 有多种孔大小的支架。
[0093] 图6描述了生物打印的支架的多个视图，该支架两侧均应用胞外基质（ECM)并继 而进行脱水。
[0094] 图7描述了细胞增殖分析结果。在包含生物打印的PCL和脱水ECM的混合 (hybrid)支架上培养的胎盘干细胞在8天的培养周期中增殖。
[0095] 图8描述了细胞活性分析结果。在包含生物打印的PCL和脱水ECM的混合支架上 培养的胎盘干细胞在在8天的培养周期中增殖并保持活性。
[0096] 图9描述了包含PCL、ECM和胎盘干细胞的完整的三维混合支架，其各自被生物打 印为各层（PCL层和ECM/细胞层）。
[0097] 图10表明在7天培养周期中胎盘干细胞遍布整个三维生物打印的支架进行分布。
[0098] 图11描述了细胞活性分析结果。用ECM和PCL生物打印形成三维混合支架的胎 盘干细胞在7天培养周期中增殖并保持活性。
[0099] 图12表明在7天培养周期中用ECM和PCL生物打印形成三维混合支架的干细胞 在混合支架中遍布ECM。
[0100] 图13描述了细胞增殖分析结果。在通过生物打印PCL、ECM和胎盘干细胞产生的 三维混合支架中培养的胎盘干细胞在7天培养周期中增殖。
[0101] 图14描述了在存在或不存在脱细胞胎盘血管支架下共培养后和在存在或不存在 脱细胞胎盘血管支架下单独培养后TT细胞和HUVEC的活性。
[0102] 图15描述了在存在或不存在脱细胞胎盘血管支架下与HUVEC共培养后和在存在 或不存在脱细胞胎盘血管支架下单独培养后TT细胞的降钙素产生。还显示了在存在或不 存在脱细胞胎盘血管支架下单独培养的HUVEC的降钙素产生。
[0103] 图16描述了在存在或不存在脱细胞胎盘血管支架下共培养后和在存在或不存在 脱细胞胎盘血管支架下单独培养后的TT细胞和PDAC?活性。
[0104] 图17描述了在存在或不存在脱细胞胎盘血管支架下与PDAC?共培养后和在存 在或不存在脱细胞胎盘血管支架下单独培养后TT细胞的降钙素产生的时间进程。还显示 了在存在或不存在脱细胞胎盘血管支架下单独培养的PDAC?的降钙素产生的时间进程。
[0105] 图18描述了在存在或不存在脱细胞胎盘血管支架下与TT细胞共培养后和在存在 或不存在脱细胞胎盘血管支架下单独培养后PDAC?的HGF产生的时间进程。还显示了在 存在或不存在脱细胞胎盘血管支架下单独培养的TT细胞的HGF产生的时间进程。
[0106] 图19描述了在灌注进入脱细胞胎盘血管支架的脉管后HCT116细胞的分布模式。
[0107] 图20描述了在存在或不存在脂肪细胞分化培养基下和单独培养的或在脱细胞胎 盘血管支架上培养的PDAC?的脂联素产生。
[0108] 图21描述了在脱细胞胎盘血管支架上培养的H印aRG的代谢。（A)在单独培养的 或在脱细胞胎盘血管支架上培养的PDAC?的培养时间进程后培养基中葡萄糖和乳酸盐 的水平。（B-D)分别在培养第3周、第2周和第4周时单独培养的或在脱细胞胎盘血管支架 上培养的PDAC?的ΛL/ΛG值。
[0109] 4.详细描述
[0110] 本文提供了一种类器官，其包含一种或多种类型的细胞和脱细胞胎盘血管支架， 其中所述类器官执行器官或来自器官的组织的至少一种功能，其中所述器官或来自器官的 组织的至少一种功能是产生来自所述器官或组织的至少一种细胞类型所特有的蛋白、生长 因子、细胞因子、白介素或小分子；并且其中所述脱细胞胎盘血管支架包含基本上完整的胎 盘脉管基质；即，在脱细胞和随后的类器官产生过程中从中获得基质的胎盘的脉管结构基 本上得以保留。在某些实施方式中，一旦完成了该类器官，血液或其他营养溶液即流过所述 胎盘脉管。
[0111]4. 1.获得胎盘的方法
[0112] 一般地，人胎盘在正常出生或剖腹产后的胎盘排出后不久回收。在优选的实施方 案中，在征得同意以后，并且在取得患者的完整病史且将其与胎盘相关联以后，从患者回收 胎盘。优选地，病史在产后继续。这种病史可用于协调胎盘或从其收获的干细胞的随后的 应用。例如，根据病史，人胎盘干细胞可用作与该胎盘相关的婴儿或婴儿的双亲、同胞或其 他的亲属的个性化医疗。
[0113] 除去脐带血和胎盘血，并可用于其他目的或抛弃。在某些实施方案中，在产后回 收胎盘中脐带血。胎盘可以进行常规的脐带血回收程序。一般地，使用针或套管，借助于 重力，给胎盘放血（参见，例如，Anderson,美国专利号5, 372, 581 ;Hessel等，美国专利号 5, 415, 665)。针或套管通常放入脐静脉中，而且可以轻轻地按摩胎盘以帮助从胎盘中排出 脐带血。这种脐带血回收可以商业化地进行，例如，通过LifeBankUSA,CedarKnolls,N. J.。优选地，胎盘通过重力排空而不进行进一步操作，以便在脐带血回收期间将组织破坏最 小化。
[0114] 一般地，胎盘从分娩或出生房间被转移到另一个位置，例如，实验室，用于回收脐 带血和通过例如灌注或组织解离来收集干细胞。胎盘优选在无菌的，隔热的转运装置中 进行转运（保持胎盘的温度为20-28°C)，例如，通过把近端脐带夹紧的胎盘放在无菌的 拉链-锁塑料袋中，然后放入保温容器中。在另一实施方案中，基本上如未决美国专利号 7, 147, 626所述，把胎盘放在脐带血收集试剂盒中转运。优选地，在分娩之后4至24小时内 把胎盘转运到实验室。在某些实施方案中，在脐带血回收之前，近端脐带被夹紧，优选在插 入到胎盘圆盘的4-5cm(厘米）内。在其他的实施方案中，在脐带血回收以后，但是在胎盘 的进一步处理之前，夹紧近端脐带。
[0115]胎盘可以储存在无菌条件下，而且是室温或者5°C到25°C(摄氏度）的温度。在灌 注胎盘以除去任何残余的脐带血之前，胎盘可以储存4到24小时、长达48小时、或长于48 小时。在一种实施方案中，从娩出后大约0小时到大约2小时收获胎盘。胎盘优选于5°C到 25°C(摄氏度）储存在抗凝血溶液中。适合的抗凝血溶液是本领域公知的。例如，可以使 用肝素或华法林钠的溶液。在一种优选实施方案中，抗凝血溶液包括肝素溶液（例如，1% w/w，在1:1000溶液中）。在收集胎盘干细胞之前，被放血的胎盘优选储存至多36小时。
[0116] 还可灌注胎盘，例如，以收集胎盘干细胞和/或胎盘灌注液细胞，例如，描述于美 国专利号7, 468, 276,其公开内容在此全文引入作为参考。
[0117] 在某些实施方式中，本文描述的类器官仅包含一部分按照上述方法获得的脱细胞 胎盘。例如，可以在期望的胎盘部分被进一步处理（例如，按照本文描述的进行处理，例如， 脱细胞）前操作胎盘以获得该部分，例如获得期望的胎盘循环单元（例如，子叶）。在某些 实施方式中，当在产生本文描述的类器官中仅使用一部分胎盘时，根据需要对完整胎盘进 行处理（例如，如下述脱细胞），然后分离待使用的胎盘特定部分（例如，从整个处理的胎盘 中通过剪切或压出期望的胎盘部分）。
[0118]4. 2.将胎盘脱细朐的方法
[0119] 在对胎盘进行如上制备并可选的进行灌注后，对其进行脱细胞，脱细胞的方式能 保留胎盘脉管的天然结构，例如，保持胎盘脉管基本上完整。本文使用的"基本上完整"表 示脱细胞后剩余的胎盘脉管保留全部或大部分脱细胞前的胎盘脉管整体结构。在某些实施 方式中，胎盘脉管能够被例如用血管内皮细胞或其他细胞再接种，从而再造胎盘脉管。
[0120] 胎盘组织可通过例如在含抗菌剂（例如与移植组织相容的抗细菌剂、抗真菌剂和 /或灭菌剂）的无菌缓冲营养液中孵育进行灭菌。灭菌的胎盘组织然后可以进行冷冻保存 以备之后进一步处理或可按照本流程的之后步骤立即进行进一步处理，包括对本流程的组 织基质或其他组织产物进行随后的冷冻保存。
[0121] 已知降低组织和器官中天然细胞的活性的几种方法，包括物理的、化学的和生物 化学的方法。参见，例如美国专利号5, 192, 312 (Orton)，其在此引入作为参考。可按照本文 描述的流程使用这些方法。然而，所使用的脱细胞技术优选不导致胎盘组织解剖学的总体 破坏，也基本上不改变其结构元件的生物力学性质，并且优选基本上完整地保留胎盘脉管。 在某些实施方式中，为了产生脱细胞组织基质对胎盘组织进行处理不会产生阻碍随后用受 体异体或自体细胞进行基质再群体化（repopulation)的细胞毒性环境。本文使用的对受 体"异体"的细胞和组织是源于或来自与胎盘血管支架受体相同种群的供体的那些细胞和 组织，"同体"的细胞或组织是源于或来自胎盘血管支架受体的那些细胞和组织。
[0122] 物理力，例如形成细胞内冰，可被用于移植组织脱细胞。从而，在某种实施方式中， 胎盘首先进行冷冻保存作为脱细胞的一部分。例如，可以进行胎盘组织气相冷冻（温度降 低缓慢）。可选地，在一种或多种冷冻保护剂存在下对胎盘组织进行冷冻保存。可在冻融 循环过程中添加胶体形成材料以改变组织中冰形成模式。例如，可以在标准冷冻保存溶液 (01^11，10%01^0、10%胎牛血清）中添加聚乙烯吡咯烷酮（10%?八）和透析的羟乙基淀粉 (10%w/v)以降低胞外冰形成并允许胞内冰形成。
[0123] 在某些实施方式中，可以使用多种酶促或其他化学处理以从移植组织或器官中消 灭活性天然细胞。例如，将细胞长期暴露于蛋白酶（例如胰蛋白酶）会导致细胞死亡。
[0124] 在某些其他实施方式中，使用洗涤剂或其组合对胎盘组织进行脱细胞，例如，非离 子性洗涤剂，例如，TritonX-100,和阴离子洗涤剂，例如，十二烷基硫酸钠，可以破坏细胞 膜并帮助从组织中去除细胞碎片。优选地，例如，通过用缓冲液洗涤去除在脱细胞组织基质 中残留的洗涤剂，从而避免干扰随后的用活细胞进行的组织基质再群体化。
[0125] 胎盘组织的脱细胞优选的通过使用有效裂解天然胎盘细胞的溶液来完成。优选 地，该溶液是配制为有效裂解细胞的水性低渗溶液或低离子强度溶液。在某些实施方式中， 水性低渗溶液是例如去离子水或水性低渗缓冲液。在【具体实施方式】中，水性低渗缓冲液包 含一种或多种添加剂，其提供针对一种或多种蛋白酶（例如胶原酶）的次优条件，其可能作 为细胞裂解的结果被释放。例如金属离子螯合物等的添加剂，例如1，10-邻二氮杂菲和乙 二胺四乙酸（EDTA)，会产生对很多蛋白水解酶不利的环境。在其他实施方式中，低渗裂解液 被配制用以消除或限制溶液中存在的二价阳离子（例如钙离子和/或锌离子）的数量，其 会转而降低依赖这些离子的蛋白酶活性。
[0126] 优选地，低渗裂解液的制备要选择pH条件、降低的钙锌离子可得性、存在金属离 子螯合剂和使用胶原酶特异性蛋白水解抑制剂，从而该溶液会最优地裂解天然细胞而保护 下面的组织基质不被蛋白水解降解。在某些实施方式中，低渗裂解液可包括缓冲水溶液， pH5. 5-8,优选pH7-8,不含或基本上不含钙锌离子，和/或包括金属离子螯合剂如EDTA。另 夕卜，也可以在用低渗裂解液处理组织基质时控制温度和时间参数以限制蛋白酶活性。
[0127] 在一些实施方式中，胎盘组织脱细胞包括用一种或多种例如能有效抑制细胞代 谢、蛋白产生和细胞分裂而不会降解下面的胶原基质的核酸酶处理组织。可用于天然细胞 DNA和RNA消化的核酸酶包括核酸外切酶或核酸内切酶之一或两者。用于脱细胞的合适的 核酸酶是可商购的。例如，有效抑制细胞活性的核酸外切酶包括DNA酶I(SIGMAChemical Company，St.Louis，Mo.)和RNA酶A(SIGMAChemicalCompany，St.Louis，Mo.)，有效抑 制细胞活性的核酸内切酶包括EcoRI(SIGMAChemicalCompany，St.Louis，Mo.)和Hind III(SIGMAChemicalCompany,St.Louis,Mo.)〇
[0128] 选定的核酸酶可包含在生理缓冲液中，后者包含对核酸酶活性最佳的离子，例如 镁盐或钙盐。还优选的是缓冲液浓度、处理温度和处理时间是选定的，以保证期望的有效核 酸酶活性水平。缓冲液优选是低渗的以促进核酸酶进入细胞内部。在某些实施方式中，该 一种或多种核酸酶包含DNA酶I和RNA酶A。优选地，该核酸酶降解溶液包含约0. 1微克/ mL至约50微克/mL，或约10微克/mL的核酸酶DNA酶I，和约0. 1微克/mL至约10微克/ mL，优选的约1. 0微克/mL的RNA酶A。胎盘组织可通过应用前述酶在约20°C-38°C，优选 约37°C的温度下，反应例如约30分钟至6小时进行脱细胞。
[0129] 在其他实施方式中，脱细胞化溶液包含一种或多种磷脂酶，例如磷脂酶A和/或磷 脂酶C，例如，在缓冲溶液中。优选地，所使用的磷脂酶应当对组织基质蛋白不具有有害作 用。载体的PH以及载体的组成也会针对所选择使用的酶的pH活性谱进行调整。此外，在 各种实施方式中，对于将酶应用到组织的过程中所使用的温度进行调整以最优化酶活性。
[0130] 脱细胞后，组织基质在某些实施方式中在洗涤液中清洗以保证去除细胞碎片，后 者可能包括细胞蛋白、细胞脂质和细胞核酸，以及任何胞外碎片。该细胞和胞外碎片的去除 降低了移植的组织基质诱发受体产生针对移植的不利免疫应答的可能性。例如，组织可以 用洗涤液清洗一次或多次，其中洗涤液为，例如，PBS或Hanks'平衡盐溶液（HBSS)。可选择 平衡盐溶液洗涤的组成和其被应用于移植组织基质的环境以减少或消除脱细胞过程中使 用的蛋白酶或核酸酶的活性。在【具体实施方式】中，洗涤液不含镁或钙，例如镁盐或钙盐，且 洗涤过程在约2°C和42°C之间，例如，最优选的4°C的温度下进行。移植组织基质可被清洗， 例如，在平衡盐溶液中孵育多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天，例如，每13天更换洗 涤液。可选地，洗涤液中可包括抗细菌剂、抗真菌剂或消毒剂或其组合，以保护移植组织基 质不受环境病原体污染。可通过浸湿胎盘组织进行洗涤，通式进行温和搅拌或不搅拌。
[0131] 脱细胞后的组织基质可通过冷冻保存进行保存。组织冷冻保存技术是本领域 公知白勺。参见，例如，Brockbank，K.G.M.在TransplantationTechniquesandUseof CryopreservedAllograftCardiacValvesandVascularTissue,D.R.Clarke(编辑）， AdamsPublishingGroup，Ltd·,Boston，第 9-23 页中的"BasicPrinciplesofViable TissuePreservation"（讨论了组织和器官的冷冻保存）。
[0132] 在某些实施方式中，无论是否被冷冻保存，组织基质都被处理以增强异体或自体 细胞在体外的贴壁和向内迁移，其将被用于再群体化移植组织。
[0133] 在某些实施方式中，可通过在例如用异体或自体细胞准备再群体化中在例如 放置脱细胞胎盘血管支架的培养基中使例如胎盘血管支架接触血清（人或胎牛的，1 % 血清最大结合）和/或纯化的纤连蛋白来增加自体或异体细胞向脱细胞胎盘血管支架 的附着。纤连蛋白的两个同源亚单位的每一个具有两个细胞识别位点，包括一个包含 Arg-Gly-Asp(RGD)序列的位点。结合粘多糖的第二个位点协同地发挥作用，且似乎能稳定 由RGD序列介导的纤连蛋白-细胞相互作用。
[0134] 从而，在一种具体的实施方式中，脱细胞胎盘血管支架接触纤连蛋白和粘多糖 (例如，肝素）一段时间，以有效结合纤连蛋白至胎盘血管支架表面，以使用异体或自体 细胞进行再群体化。纤连蛋白，和可选的粘多糖，可被包含在生理可接受的缓冲液或培养 基中，例如磷酸钠/甘油/牛血清白蛋白和达尔伯克改良的伊格尔培养基（DMEM)(例如， GIBC0)。缓冲液或培养基优选的维持在生理学可接受的pH，例如，约6. 8-7. 6。纤连蛋白可 从人血获得，经过处理以限制病毒污染，或可从商业来源获得。纤连蛋白和/或糖蛋白的浓 度可以为约1微克/mL至约100微克/mL，例如，约10微克/mL。纤连蛋白与肝素的优选重 量比是约100:1至约1:100,或约10:1至约1:10,例如，10:1的纤连蛋白：粘多糖，例如肝 素。
[0135] 脱细胞胎盘血管支架可以与一种或多种组合物接触，例如用其处理，后者作用为 例如增强细胞趋化性，增加在溶液中沿着底物浓度梯度定向移动的速率。对于成纤维细胞 而言，成纤维细胞生长因子、血小板来源的生长因子、转化生长因子-β(TGF-β)、纤维胶 原、胶原片段和纤连蛋白是趋化性的。
[0136] 在一种具体的优选的实施方式中，胎盘按如下进行脱细胞。胎盘组织，例如， 已去除血液的整个胎盘或胎盘小叶（子叶）首先被冷冻在-20°C至-180°C下，例如， 约-80°C，例如，约24小时。然后在约4°C下将组织解冻过夜。然后用0.1%胰蛋白酶在 室温下消化解冻的组织2小时至24小时，以在25°C至约37°C下产生消化的胎盘组织。在 该消化和随后的步骤中，将溶液流过胎盘脉管（灌注脱细胞）。然后依次用1%、2%和3% Triton-XlOO各自在室温或约25°C下处理消化的组织24小时。Triton-XlOO处理后用 0. 1%SDS-PBS在室温或约25°C下处理组织24小时，其后细胞材料基本上被去除。然后用 1-10倍稀释的磷酸盐缓冲盐水（PBS)彻底洗涤组织，随后用DNA酶I(150U/mL)在室温下处 理1小时，每一步骤在室温或约25°C下。最后，剩余的脱细胞胎盘血管支架再次在室温或约 25°C下用PBS+1%抗生素（青霉素+链霉素）彻底洗涤，可选地进行干燥，并在4°C保存。
[0137] 脱细胞后，得到的胎盘血管支架可与一种或多种合成基质组合，例如，合成聚合 物。在一种具体的实施方式中，合成基质稳定了胎盘血管支架的三维结构，例如，以利于类 器官的产生。在另一【具体实施方式】中，所述合成基质包含聚合物或热塑性材料。在更具体的 实施方式中，所述合成基质为聚合物或热塑性材料。在更为具体的实施方式中，所述热塑性 材料为聚己酸内酯、聚乳酸、聚对苯二甲酸丁二酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚酯、聚 醋酸乙烯酯或聚氯乙烯。在其他更具体的实施方式中，所述聚合物是聚偏二氯乙烯、聚（邻 羧基苯氧基）-对二甲苯）（聚（0-CPX))、聚（交酯-酸酐）（PLAA)、n-异丙基丙烯酰胺、丙 烯酰胺、戊赤藓糖醇二丙烯酸酯、聚丙烯酸甲酯、羧甲基纤维素、或聚（乳酸-羟基乙酸共聚 物）（PLGA)。在另一更具体的实施方式中，所述聚合物是聚丙烯酰胺。
[0138] 在任一上述实施方式中，胎盘血管支架可通过将上述任何脱细胞和/或洗涤成分 流过胎盘脉管进行脱细胞，例如流过胎盘动脉和/或胎盘静脉。灌注流过胎盘脉管的方法 描述于，例如，美国专利号8, 057, 788,其公开内容在此全文引入作为参考。
[0139]4. 3.将细朐加载到某质h的方法
[0140] 可以通过任何生理可接受的方法将细胞加载到脱细胞胎盘血管支架上。在某些实 施方式中，细胞悬浮于例如液体培养基、盐溶液或缓冲液中，含细胞的液体通过一种或多种 的血管基质灌注进胎盘血管支架。胎盘血管支架也可以在这种含细胞的培养基、盐溶液或 缓冲液中培养足以使得多种细胞附着于所述胎盘血管支架的一段时间。也可以通过在支架 表面接种将细胞加载到胎盘血管基质上，或通过使用针或输液泵将细胞注射进血管中。在 某些实施方式中，细胞通过生物打印被加载到脱细胞胎盘血管支架上。
[0141] 在某些实施方式中，在细胞被加载到脱细胞胎盘血管支架后，细胞和支架被培养 期望的一段时间。在一种具体的实施方式中，在转瓶（roller)生物反应器中培养细胞和支 架。
[0142]4. 4.所俥用的细朐
[0143] 根据生理功能，类器官被设计为增大或替代，本文提供的类器官可包含一种或多 种相关细胞类型。
[0144] 在本文提供的任一类器官的某些实施方式中，例如，该一种或多种类型的细胞包 含免疫系统细胞，例如，T细胞、B细胞、树突状细胞和/或自然杀伤（NK)细胞。在一种具体 的实施方式中，所述NK细胞包括，或为⑶56+⑶16^胎盘中间自然杀伤（PiNK)细胞，例如， US2009/0252710中描述的胎盘NK细胞，其公开内容在此全文引入作为参考。
[0145] 在某些本文提供的任一类器官的其他实施方式中，一种或多种细胞为，或包含分 离的干细胞或祖细胞。在【具体实施方式】中，所述分离的干细胞或祖细胞为分离的胚胎干细 胞、胚胎生殖细胞、诱导的多潜能干细胞、间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、骨髓来源的间 充质基质细胞、组织塑料贴壁胎盘干细胞（PDAC? )、脐带干细胞、羊水干细胞、羊膜来源 的贴壁细胞（AMDACs)、成骨胎盘贴壁细胞（OPACs)、脂肪干细胞、角膜缘干细胞、牙髓干细 胞、成肌细胞、内皮祖细胞、神经元干细胞、脱落牙齿来源的干细胞、毛囊干细胞、皮肤干细 胞、孤雌生殖来源的干细胞、重编程干细胞、羊膜来源的贴壁细胞、或侧群干细胞。在其他

【具体实施方式】中，类器官中所包含的一种或多种细胞为，或包含，分离的造血干细胞或造血 祖细胞。在其他【具体实施方式】中，类器官中所包含的一种或多种细胞为组织培养塑料贴壁 CD34'CD10+、CD105+、和CD200+胎盘干细胞，例如，US7, 468, 276 和US8, 057, 788 中描述 的胎盘干细胞，其公开内容在此全文引入作为参考。在一种具体的实施方式中，所述胎盘干 细胞另外是⑶45'⑶80'⑶86^或⑶90+的一种或多种。在更具体的实施方式中，所述胎 盘干细胞另外还是CD45 'CD8(T、CD86-和CD90+。
[0146] 该胎盘干细胞是免疫调节性的。参见，例如，US7, 682, 803和US2008/0226595， 其公开内容在此全文引入作为参考。因此，在另一【具体实施方式】中，当所述类器官被移植 入受体时，所述胎盘干细胞或包含所述胎盘干细胞的所述类器官抑制所述受体中的免疫应 答。在另一【具体实施方式】中，当所述类器官被移植入受体时，任何如上所述分离的干细胞， 或所述包含所述分离的干细胞的类器官（其中所述分离的干细胞是免疫调节性的）抑制受 体中的免疫应答。在一种具体的实施方式中，所述类器官或其中包含的免疫调节干细胞在 例如给药或移植位点处或附近抑制所述受体中的局部免疫应答。在另一【具体实施方式】中， 所述类器官或其中包含的免疫调节干细胞抑制所述受体中的全身免疫应答。
[0147] 在各种其他【具体实施方式】中，类器官包含一种或多种细胞类型，其中所述一种或 多种细胞类型为分化的细胞，或包含分化的细胞，例如，内皮细胞、上皮细胞、真皮细胞、内 胚层细胞、中胚层细胞、成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、自然杀伤细胞、树突细胞、肝细胞、 胰腺细胞、或间质细胞中的的一种或多种。在多种更具体的实施方式中，所述分化的细胞 为，或包含，唾液腺粘液细胞、唾液腺浆液细胞、vonEbner腺细胞、乳腺细胞、泪腺细胞、聍 腺细胞、外分泌汗腺暗细胞、外分泌汗腺清除细胞、顶泌汗腺细胞、Moll腺细胞、皮脂腺细 胞、鲍曼腺细胞、Brunner腺细胞、精囊细胞、前列腺细胞、尿道球腺细胞、Bartholin腺细 胞、Littre腺细胞、子宫内膜细胞、分离的杯状细胞、胃粘膜粘液细胞、胃底腺胃酶细胞、 胃底腺泌酸细胞、胰腺腺泡细胞、潘氏细胞、II型肺泡细胞、克拉拉细胞、促生长激素细胞 (somatotrope)、乳促素细胞、促甲状腺细胞、促性腺细胞、促皮质激素细胞、中间垂体细胞、 大细胞神经分泌细胞、肠细胞、呼吸道细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、副甲状腺细胞、 副甲状腺主细胞、嗜酸细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸间质细胞、鞘内细胞、黄体细胞、 颗粒黄体细胞、鞘黄体细胞、近血管球细胞、致密斑细胞、极周细胞、系膜细胞、血管和淋巴 管内皮穿孔细胞、血管和淋巴管内皮连续细胞、血管和淋巴管内皮脾脏细胞、滑膜细胞、浆 膜细胞（腹膜、胸膜和心包腔）、鳞状细胞、柱状细胞、暗细胞、前庭膜细胞（耳朵的衬内 淋巴空间）、血管纹基底细胞、血管纹边缘细胞（耳朵的衬内淋巴空间）、Claudius细胞、 Boettcher细胞、脉络丛细胞、软膜蛛网膜鳞片状细胞、色素睫状上皮细胞、非色素睫状上皮 细胞、角膜内皮细胞、钉形细胞、呼吸道纤毛细胞、输卵管纤毛细胞、子宫内膜纤毛细胞、睾 丸网纤毛细胞、输精小管纤毛细胞、纤毛室管膜细胞、表皮角质细胞、表皮基底细胞、手指甲 和脚趾甲角质细胞、甲床基底细胞、脊髓毛干细胞、外皮毛干细胞、表皮毛干细胞、表皮毛根 鞘细胞、Huxley层毛根鞘细胞、Henle层毛根鞘细胞、外毛根鞘细胞、毛基质细胞、复层扁平 上皮的表面上皮细胞、上皮基底细胞、泌尿上皮细胞、柯蒂氏器官的听觉内毛细胞、柯蒂氏 器官的听觉外毛细胞、嗅上皮基底细胞、冷敏感的初级感觉神经元、热敏初级感觉神经元、 Merkel表皮细胞、嗅觉受体神经元、痛觉初级感觉神经元、光受体视杆细胞、光受体蓝色敏 感圆锥细胞、光受体绿色敏感圆锥细胞、光受体红色敏感圆锥细胞、本体感受初级感觉神经 元、触摸感应初级感觉神经元、I型颈动脉体细胞、Π型颈动脉体细胞（血液pH传感器）、耳 前庭器官I型毛细胞（加速度和重力）、耳前庭器官II型毛细胞、I型味蕾细胞、胆碱能神 经细胞、肾上腺素能神经细胞、肽能神经细胞、柯蒂氏器官的内柱细胞、柯蒂氏器官的外柱 细胞、柯蒂氏器官的内指细胞、柯蒂氏器官的外指细胞、柯蒂氏器官的边缘细胞、柯蒂氏器 官Hensen细胞、前庭器官支持细胞、味蕾支持细胞、嗅上皮支持细胞、Schwann细胞、卫星细 胞、肠胶质细胞、星形细胞、神经原、寡树突细胞、纺锤体神经元、前晶状体上皮细胞、含晶体 蛋白的晶状体纤维细胞、肝细胞、脂肪细胞、白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞、肝脂肪细胞、肾 小球壁细胞、肾小球足细胞、肾近端小管刷状缘细胞、亨利氏套薄段细胞、肾远端小管细胞、 肾集合管细胞、I型肺泡壁细胞、胰管细胞、无横纹管细胞、管细胞、肠刷状缘细胞、外分泌腺 纹状管细胞、胆囊上皮细胞、输精小管非纤毛细胞、附睾主细胞、附睾基底细胞、造釉上皮细 胞、半月面上皮细胞、柯蒂氏器官牙间上皮细胞、疏松结缔组织成纤维细胞、角膜基质细胞、 肌腱成纤维细胞、骨髓网状组织成纤维细胞、非上皮成纤维细胞、周细胞、髓核细胞、成牙骨 质细胞/牙骨质细胞、成牙质细胞、牙质细胞、透明软骨软骨细胞、纤维软骨软骨细胞、弹性 软骨软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、骨祖细胞、玻璃体细胞、星状细胞（耳）、肝星 状细胞（Ito细胞）、胰星状细胞、红色骨骼肌细胞、白色骨骼肌细胞、中间骨骼肌细胞、肌梭 核袋细胞、肌梭核链细胞、卫星细胞、普通心肌细胞、节点心肌细胞、浦肯野纤维细胞、平滑 肌细胞、虹膜肌上皮细胞、外分泌腺肌上皮细胞、网织红细胞、巨核细胞、单核细胞、结缔组 织巨噬细胞、表皮Langerhans细胞、树突状细胞、小胶质细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、 嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细 胞、自然杀伤细胞、黑素细胞、视网膜色素上皮细胞、卵原细胞/卵母细胞、精子细胞、精母 细胞、精原细胞、精细胞、卵巢卵泡细胞、Sertoli细胞、胸腺上皮细胞和/或间质肾细胞。
[0148] 在包含本文列举的任何细胞类型的类器官的任一【具体实施方式】中，该至少一种类 型的细胞是原代培养细胞、直接从组织或器官中获得而不经过培养的细胞、体外培养的细 胞、或细胞系的细胞，例如，部分地、条件地或完全永生化细胞。
[0149] 可用于产生本文提供的类器官的细胞可以使用一种或多种本领域已知的蛋白酶 (例如，胶原酶、分散酶、胰蛋白酶、释放酶，等等）从相关组织或器官（例如，从特定腺体） 中分离。器官，例如，腺体组织可以在用蛋白酶处理组织前、中或后期进行物理分散，例如通 过切割、浸渍、过滤，等等。在类器官产生前，可使用标准的、本领域已知的细胞培养技术进 行细胞培养，例如，以产生均质的或基本上均质的细胞群，以选择特定细胞类型，等等。
[0150] 垂体腺细胞的分离、培养和鉴定可按照本领域已知的流程进行使用例如 脂皮质蛋白I(LCl)作为标志物，按照Christian等人，"Characterizationand localizationoflipocortinI-bindingsitesonratanteriorpituitarycellsby fluorescence-activatedcellanalysis/sortingandelectronmicroscopy，，'Endocri nologyl38 (12) :5341-5351 (1997)中公开的流程；还参见Kim等人，"Isolation，culture andcel1-typeidentificationofadulthumanpituitarycells，''Acta Neuropathol. 68 (3) :205-208(1985);Baranowska等人，"Directeffectofcortistatin onGHreleasefromculturedpituitarycellsintherat，"NeuroEndocrinol Lett. 27(1-2) : 153-156 (2006)。
[0151] 甲状腺细胞的分离、培养和鉴定可按照本领域已知的流程进行。参见，例如， Pavlov等人，''Isolationofcellsforcytologicalandcytogeneticstudiesof thethyroidepithelium，"Morfologiial30 (6) :81-83 (2006);Fayet等人，"Isolation ofanormalhumanthyroidcellline:hormonalrequirementforthyroglobulin regulation, Thvro id 12 (7) :539-546 (2002)。
[0152] 肾上腺细胞的分离、培养和鉴定可按照本领域已知的流程进行。参见， 例 如，Creutz，" Isolation of chromaffin granules,，'Curr Protoc Cell Biol. 第3章：Unit3.39.1_10(Sept· 2010) ;Caroccia等人，"Isolation of human adrenocortical aldosterone-producing cells by a novel immunomagnetic beads method,"Endocrinologyl51 (3) : 1375-80 (2010) ;Fawcett等人，"Isolation and properties in culture of human adrenal capillary endothelial cells,，'Biochem Biophys Res Commun.1 74 (2) :903-8 (1991) ;Notter等人，"Rodent and primate adrenal medullary cells in vitro:phenotypic plasticity in response to coculture with C6 glioma cells or NGF，"Exd Brain Res. 76 (I) :38-46(1989)。
[0153]4. 5.由类器官复制的牛理功能
[0154] 本文提供的类器官的初级功能是该类器官，通过其中包含的细胞，执行一种或多 种生理功能，例如，个体中需要增强或代替的一种或多种生理功能。更具体地，该类器官和 /或其中包含的细胞复制或增强了作为所述类器官受体的个体中的器官或组织的一种或多 种生理功能。在某些实施方式中，如上所述，该类器官包含分离的原代或培养的细胞，其执 行该一种或多种生理功能。在其他实施方式中，该类器官包含被基因工程改造以执行该生 理功能的细胞。在一种具体的实施方式中，所述基因工程改造的细胞产生对应的未改造的 细胞所不会天然产生的蛋白或多肽，或该细胞被基因工程改造以比对应的未改造的细胞更 大量地产生蛋白或多肽，其中所述细胞组合物包含分化的细胞。
[0155] 在生理功能是产生蛋白或多肽的实施方式中，在【具体实施方式】中，所述蛋白或多 肽是细胞因子或包含其活性部分的肽。在更加具体的实施方式中，所述细胞因子是肾上腺 髓质素（AM)、血管生成素（Ang)、骨形态发生蛋白（BMP)、脑源性神经营养因子（BDNF)、表 皮生长因子（EGF)、促红细胞生成素（Epo)、成纤维细胞生长因子（FGF)、胶质细胞系来源 的神经营养因子（GNDF)、粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、生长分化因子（⑶F-9)、肝细胞生长因子（HGF)、肝癌衍生生长因子（HDGF)、胰 岛素样生长因子（IGF)、迁移-刺激因子、肌生成抑制蛋白（GDF-8)、髓单核细胞生长因子 (MGF)、神经生长因子（NGF)、胎盘生长因子（PlGF)、血小板来源的生长因子（PDGF)、促血小 板生成素（Τρο)、转化生长因子a(TGF-a)、TGF_P、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮 生长因子（VEGF)、或Wnt蛋白。在所述类器官更具体的实施方式中，个体的所述类器官，例 如，包含IXIO8个细胞的类器官，在生长培养基中体外培养24小时后产生至少1. 0-10μM 的所述细胞因子。
[0156] 在其他【具体实施方式】中，所述蛋白或多肽是AM、Ang、BMP、BDNF、EGF、Epo、FGF、 GNDF、G-CSF、GM-CSF、⑶F-9、HGF、HDGF、IGF、迁移-刺激因子、⑶F-8、MGF、NGF、PIGF、PDGF、 Tpo、TGF-a、TGF-β、TNF-a、VEGF、或Wnt蛋白的可溶性受体。在所述类器官更具体的实 施方式中，个体的类器官，例如，包含IX10*细胞的类器官，在生长培养基中体外培养24小 时产生至少1. 0-10μM的所述可溶性受体。
[0157]在其他【具体实施方式】中，所述蛋白或多肽是白介素，例如，白介素-la (IL-Ia)、 IL-Ιβ、IL-1F1、IL-1F2、IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、 IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-1235kDaa亚单位、 IL-1240kDaP亚单位、IL-12a和β亚单位、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F同种型 1、IL-17F同种型 2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、 IL-22、IL-23pl9亚单位、IL-23p40亚单位、IL-23pl9亚单位和IL-23p40亚单位一起、 IL-24、IL-25、IL-26、IL-27B、IL-27-p28、IL-27B和IL-27-p28 -起、IL-28A、IL-28B、 IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36a、IL-36β、IL-36γ。在所述类 器官更具体的实施方式中，个体的所述类器官，例如，包含IXIO8个细胞的类器官，在生长 培养基中体外培养24小时后产生至少1. 0-10μM的所述白介素。
[0158] 在其他【具体实施方式】中，所述蛋白或多肽是IL-Ia、IL-Ιβ、IL-1F1、IL-1F2、 IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-1235kDaa亚单位、IL-1240kDaP亚单位、IL-13、 IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F同种型 1、IL-17F 同种型 2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23pl9 亚单位、IL-23p40 亚单位、IL-24、 IL-25、IL-26、IL-27B、IL-27-p28、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、 IL-34、IL-35、IL-36a、IL-36i3、IL-36Y的可溶性受体。在所述类器官更具体的实施方式 中，个体的类器官，例如，包含IXIO8个细胞的类器官，在生长培养基中体外培养24小时后 产生至少1. 0-10μM的所述可溶性受体。
[0159] 在其他【具体实施方式】中，所述蛋白或多肽是干扰素（IFN)，例如，IFN-a、IFN-β、 IFN-γ、IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-K、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、 IFN-ω或IFN-v。在所述类器官更具体的实施方式中，个体的所述类器官，例如，包含IXIO8 个细胞的类器官，在生长培养基中体外培养24小时后产生至少1. 0-10μM的所述干扰素。
[0160] 在其他【具体实施方式】中，所述蛋白或多肽是IFN-a、IFN-β、IFN-Y、IFN-λ1、 IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-K、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ω或IFN-v的可 溶性受体。在所述类器官更具体的实施方式中，个体的类器官，例如，包含IXlO8个细胞的 类器官，在生长培养基中体外培养24小时后产生至少1. 0-10μM的所述可溶性受体。
[0161] 在其他【具体实施方式】中，所述蛋白或多肽是胰岛素或前胰岛素。在所述类器官更 具体的实施方式中，个体的所述类器官，例如，包含IXIO8个细胞的类器官，在生长培养基 中体外培养24小时后产生至少1. 0-10μM的所述胰岛素。在其他【具体实施方式】中，所述蛋 白是胰岛素受体。在更具体的实施方式中，所述细胞被另外基因工程改造以产生前激素转 化酶1、前激素转化酶2或羧肽酶E中的一种或多种。
[0162] 在另一【具体实施方式】中，所述蛋白或多肽是瘦蛋白（LEP)。在所述类器官更具体的 实施方式中，个体的所述类器官，例如，包含IXIO8个细胞的类器官，在生长培养基中体外 培养24小时后产生至少1. 0-10μM的所述瘦蛋白。
[0163] 在其他【具体实施方式】中，所述蛋白是促红细胞生成素（Epo)。在所述类器官更具体 的实施方式中，个体的所述类器官，例如，包含IXIO8个细胞的类器官，在生长培养基中体 外培养24小时后产生至少1. 0-10μM的所述Epo。
[0164] 在另一【具体实施方式】中，所述蛋白是促血小板生成素（Tpo)。在所述类器官更具体 的实施方式中，个体的所述类器官，例如，包含IXIO8个细胞的类器官，在生长培养基中体 外培养24小时后产生至少1. 0-10μM的所述Τρο。
[0165] 在某些实施方式中类器官可以包含经过工程化改造产生多巴胺或多巴胺前体的 细胞。在本文提供的任一类器官的一种具体的实施方式中，例如，所述蛋白是酪氨酸3-单 氧酶。在所述类器官更具体的实施方式中，个体的类器官，例如，包含IXIO8细胞的类器官， 在生长培养基中体外培养24小时产生至少1. 0-10μM的L-DOPA。在更具体的实施方式中， 所述类器官中的所述细胞被进一步工程化以表达芳香L-氨基酸脱羧酶。在所述类器官更 具体的实施方式中，个体的所述类器官，例如，包含IXIO8个细胞的类器官，在生长培养基 中体外培养24小时后产生至少1. 0-10μM的多巴胺。
[0166] 在所述类器官的另一【具体实施方式】中，所述蛋白或多肽是激素或前激素。在更为 具体的实施方式中，所述激素是缪氏管抑制激素（ΑΜΗ)、脂联素（Acrp30)、促肾上腺皮质 激素（ACTH)、血管紧张素（AGT)、血管紧张素原（AGT)、抗利尿激素（ADH)、血管加压素、心 房-利尿钠肽（ANP)、降钙素（CT)、胆囊收缩素（CCK)、促肾上腺皮质素-释放激素（CRH)、 促红细胞生成素（Epo)、卵泡-刺激激素（FSH)、睾酮、雌激素、胃泌素（GRP)、饥饿素、胰高 血糖素（GCG)、促性腺素-释放激素（GnRH)、生长激素（GH)、生长激素释放激素（GHRH)、人 绒膜促性腺激素（hCG)、人胎盘催乳素（HPL)、抑制素、黄体生成素（LH)、黑素细胞刺激激 素（MSH)、食欲素、催产素（OXT)、副甲状腺激素（PTH)、催乳素（PRL)、松弛素（RLN)、分泌素 (SCT)、生长抑素（SRIF)、促血小板生成素（Τρο)、甲状腺-刺激激素（Tsh)和/或促甲状腺 素-释放激素（TRH)。
[0167] 在另一【具体实施方式】中，所述蛋白或多肽是细胞色素Ρ450侧链裂解酶 (P450SCC)〇
[0168] 在其他【具体实施方式】中，所述蛋白是患有遗传缺陷或疾病的个体中缺失或失能的 蛋白。在【具体实施方式】中，所述遗传疾病是家族性高胆留醇血症，所述蛋白是低密度脂蛋白 受体（LDLR);所述遗传疾病是多囊性肾病，所述蛋白是多囊蛋白-I(PKDl)、PKD-2或PKD3 ; 或所述遗传疾病是苯丙酮尿症，所述蛋白是苯丙氨酸羟化酶。
[0169] 在如本文其他部分描述的类器官包含免疫调节细胞的实施方式中，该类器官可进 一步包含一种或多种免疫调节化合物，例如，该化合物为非留体抗炎性药物（NSAID)、对乙 酰氨基酚、萘普生、布洛芬、阿司匹林、类固醇、抗-T细胞受体抗体、抗-IL-2受体抗体、巴 利昔单抗、达利珠单抗（ZENAPAX?)、抗τ细胞受体抗体（例如，莫罗莫那-CD3)、咪唑 硫嘌呤、皮质类固醇、环孢霉素、他克莫司、霉酚酸酯、西罗莫司、钙调神经磷酸酶抑制剂，等 等。在一种具体的实施方式中，免疫抑制剂是抗巨噬细胞炎性蛋白（MIP)-Ia或MIP-Iβ 中和抗体。
[0170]4. 6.类器官的具体实例
[0171] 在下述第4. 6. 1节至第4. 6. 6节各自提供了腺体特异性类器官的【具体实施方式】。
[0172]4. 6. 1.垂体腺
[0173] 垂体腺包含大量细胞，垂体前叶中的嗜酸细胞和易染细胞，和垂体后叶中的神经 分泌细胞，其被血管连通网络包围。在某些实施方式中，因此，本文提供了执行至少一种垂 体腺生理功能的类器官，例如，本文提供了垂体类器官。在【具体实施方式】中，所述至少一种 垂体腺生理功能是产生可检测量的一种或多种垂体特异性激素，或所述垂体类器官产生可 检测量的一种或多种垂体特异性激素，例如，人生长激素（hGH)、催乳素（PRL)、促肾上腺皮 质激素（ACTH)(也被称为促肾上腺皮质素）、黑素细胞-刺激激素（MSH)、甲状腺-刺激激 素（TSH)(也被称为促甲状腺激素）、卵泡-刺激激素（FSH)、黄体生成素（LH)、抗利尿激素 (ADH)、和/或催产素。在某些实施方式中，所述类器官包含（例如，另外包含）被基因工 程改造以产生可检测量的一种或多种垂体特异性激素的细胞，例如，一种或多种的人生长 激素（hGH)、催乳素（PRL)、促肾上腺皮质激素（ACTH)(也被称为促肾上腺皮质素）、黑素细 胞-刺激激素（MSH)、甲状腺-刺激激素（TSH)(也被称为促甲状腺激素）、卵泡-刺激激素 (FSH)、黄体生成素（LH)、抗利尿激素（ADH)、和/或催产素中的一种或多种。
[0174] 可以分析所述类器官产生的所述一种或多种垂体特异性激素，例如，通过可商购 的试剂盒和分析方法。例如，hGH的产生可在体外使用人GHELISA试剂盒（AbFrontier Co.，Ltd. ;Seoul，KR)进行分析；ACTH的产生可在体外使用ACTH(1-39)EIA试剂盒 (Bachem，Torrance，CA)进行分析；MSH的产生可在体外通过人/小鼠/大鼠MSHEIA试剂盒 (Raybiotech，Inc.;NorcrossGA)进行分析；TSH的产生可在体外使用人TSHELISA试剂盒 (Calbiotech，Inc. ,SpringValley，CA)进行分析；FSH的产生可在体外使用人FSHELISA 试剂盒（八11(^611，1^88丨8831^3,〇11丨31'；[0，加拿大）进行分析；1^的产生可在体外使用用于黄 体生成激素的ELISA试剂盒（UscnLifeScience,武汉，中国）进行分析；ADH的产生可在体 外使用用于抗利尿激素（ADH)的CLIA试剂盒（UscnLifeScience,武汉，中国）进行评价； 所述类器官产生的催乳素可在体外使用催乳素ELISA(Immuno-BiologicalLaboratories America)进行评价，催产素的产生可在体外使用催产素OTELISA试剂盒（MyBiosource， SanDiego,CA)进行评价。在前述各分析方法中，在某些实施方式中，对培养类器官的培养 基进行分析用于检测由所述类器官产生的特定激素。
[0175] 在【具体实施方式】中，所述垂体类器官包含一种或多种的垂体生长激素细胞 (somatotroph)、垂体催乳激素细胞、垂体促肾上腺皮质激素细胞、垂体促甲状腺激素细胞、 垂体促性腺细胞、和/或垂体神经分泌细胞。在某些其他【具体实施方式】中，该垂体类器官可 包含（例如，还可包含）被基因工程改造以产生一种或多种垂体特异性激素的细胞。在某 些【具体实施方式】中，该类器官进一步包含血管内皮细胞，其中所述血管内皮细胞被安排在 所述类器官中，例如，沿着所述胎盘血管支架中的一条或多条血管。在其他更具体的实施方 式中，构建所述类器官从而所述一种或多种的垂体生长激素细胞（somatotroph)、垂体催乳 激素细胞、垂体促肾上腺皮质激素细胞、垂体促甲状腺激素细胞、垂体促性腺细胞、和/或 垂体神经分泌细胞置于一条或多条的所述血管附近。
[0176] 在某些其他实施方式中，所述一种或多种的垂体生长激素细胞（somatotroph)、垂 体催乳激素细胞、垂体促肾上腺皮质激素细胞、垂体促甲状腺激素细胞、垂体促性腺细胞、 和/或垂体神经分泌细胞置于所述类器官外表面或附近，从而细胞能通过扩散从类器官外 部摄入营养，所述一种或多种垂体特异性激素可从所述类器官扩散进入周围环境，例如进 入培养基或进入移植有所述类器官的个体。
[0177]4. 6. 2.甲状腺
[0178] 甲状腺包含甲状腺滤泡细胞，其分泌胶体；甲状腺上皮细胞，其产生T3和T4;以及 甲状腺滤泡旁细胞，其产生降钙素。在某些实施方式中，因此，本文提供了执行至少一种甲 状腺生理功能的类器官，例如，本文提供了甲状腺类器官。在【具体实施方式】中，所述至少一 种甲状腺生理功能是可检测量的一种或多种甲状腺特异性激素，或所述甲状腺类器官产生 可检测量的一种或多种甲状腺特异性激素，例如，三碘甲状腺原氨酸（T3)、甲状腺素（T4) 和/或降钙素中的一种或多种。所述类器官产生的所述一种或多种甲状腺特异性激素可以 例如通过可商购的试剂盒和分析方法进行分析。例如，T3的产生可在体外使用总T3ELISA试剂盒（MyBiosource，SanDiego,CA)进行分析；Τ4的产生可在体外使用总T4ELISA试剂盒 (MyBiosource，SanDiego，CA)进行分析；降|丐素的产生可在体外使用降|丐素ELISA试剂盒 (MyBiosource，SanDiego，CA)进行分析。在某些实施方式中，所述类器官包含（例如，另外 包含）被基因工程改造以产生可检测量的一种或多种甲状腺特异性激素的细胞，例如，T3、 T4和/或降I丐素的一种或多种。在前述各分析方法中，在某些实施方式中，对培养类器官的 培养基进行分析用于检测由所述类器官产生的特定激素。
[0179] 在【具体实施方式】中，所述甲状腺类器官包含一种或多种的甲状腺滤泡细胞、甲状 腺上皮细胞和/或甲状腺滤泡旁细胞。在某些【具体实施方式】中，甲状腺类器官进一步包含 血管内皮细胞，其中所述血管内皮细胞配置于例如所述胎盘血管支架中的一条或多条血管 中。
[0180]4. 6. 3.副甲状腺
[0181] 副甲状腺主要包含两类细胞：负责产生副甲状腺激素的副甲状腺主细胞和副甲 状腺嗜酸细胞。在某些实施方式中，因此，本文提供了执行至少一种副甲状腺生理功能的 类器官，例如，本文提供了副甲状腺类器官。在【具体实施方式】中，所述至少一种副甲状腺 生理功能是产生可检测量的副甲状腺激素（PTH)，或所述副甲状腺类器官产生可检测量的 副甲状腺激素（PTH)。PTH的产生可使用完整-PTHELISA试剂盒（Immuno-Biological Laboratories，Minneapolis,MN)在体外进行评价，例如通过检测培养所述类器官的培养基 中PTH的存在。在某些实施方式中，副甲状腺类器官包含副甲状腺主细胞。在更具体的实 施方式中，副甲状腺类器官包含副甲状腺主细胞和副甲状腺嗜酸细胞。在某些实施方式中， 所述类器官包含（例如，另外包含），经过基因工程改造以产生可检测量的PTH的细胞。在 前述各分析方法中，在某些实施方式中，对培养类器官的培养基进行分析用于检测由所述 类器官产生的特定激素或蛋白。
[0182] 在某些【具体实施方式】中，副甲状腺类器官进一步包含血管内皮细胞，其中所述血 管内皮细胞配置于所述胎盘血管支架中的一条或多条血管中。在其他更具体的实施方式 中，构建所述类器官从而所述副甲状腺主细胞和/或所述副甲状腺嗜酸细胞置于一条或多 条的所述血管附近。
[0183]4. 6. 4.肾h腺
[0184] 肾上腺包含肾上腺嗜铬细胞，其主要负责产生肾上腺素；肾上腺球状带细胞，其产 生盐皮质激素（主要是醛固酮）；肾上腺束状带细胞，其产生糖皮质激素（例如，11-脱氧 皮质酮、皮质脂酮和/或可的松）；和肾上腺网状带细胞，其产生雄激素（例如，脱氢表雄 酮（DHEA)和/或雄烯二酮）。在某些实施方式中，因此，本文提供了执行至少一种肾上腺 生理功能的类器官，例如，本文提供了肾上腺类器官。在【具体实施方式】中，所述至少一种肾 上腺生理功能是产生可检测量的一种或多种肾上腺特异性激素，或所述肾上腺类器官产生 可检测量的一种或多种肾上腺特异性激素，例如，醛固酮、氟氢可的松、脱氢表雄酮、18羟基 11脱氧皮质酮、皮质脂酮、可的松、DHEA和/或雄烯二酮中的一种或多种。在某些实施方式 中，所述类器官包含（例如，另外包含）经过基因工程改造以产生可检测量的例如醛固酮、 11-脱氧皮质酮、皮质脂酮、可的松、氟氢可的松、DHEA和/或雄烯二酮中的一种或多种的细 胞。
[0185] 所述一种或多种肾上腺特异性激素的产生可通过例如出版的和/或可商购的试 剂盒和分析方法进行分析。例如，所述肾上腺类器官产生的氟氢可的松可使用液相色谱分 析进行评价；参见Ast等人，T.Pharm.Sci. 68 (4) :421-423 (1979)。肾上腺类器官产生的醛 固酮可使用人醒固酮ELISA试剂盒（BioVendorLaboratoryMedicine,Inc. ,Candler,NC) 进行分析。肾上腺类器官产生的可的松可通过皮质醇ELISA试剂盒（EnzoLifeSciences, Inc.，Farmingdale，NY)进行分析。所述肾上腺类器官产生的18羟基11脱氧皮质酮可使 用放射免疫分析进行分析；参见Chandler等人，Steroids27 (2) :235-246 (1976)。所述肾上 腺类器官产生的肾上腺素可通过肾上腺素RIA(AlpcoDiagnostics,Salem,NH)进行分析。 所述肾上腺类器官产生的雄烯二酮可通过质谱进行分析；参见Booker等人，DruRTestinR andAnalvsisl(11-12) :587-595 (2009)。肾上腺类器官产生的DHEA可通过DHEAELISA试 剂盒（AbnovaCorporation,台北市，台湾）进行分析。在前述各分析方法中，在某些实施方 式中，对培养类器官的培养基进行分析用于检测由所述类器官产生的特定激素或蛋白。
[0186] 在某些【具体实施方式】中，肾上腺类器官包含肾上腺嗜铬细胞、肾上腺束状带细胞、 肾上腺球状带细胞和/或肾上腺网状带细胞。在一种具体的实施方式中，所述肾上腺类器 官包含两种或更多种的肾上腺束状带细胞、肾上腺球状带细胞和/或肾上腺网状带细胞。 在某些【具体实施方式】中，所述肾上腺嗜铬细胞、肾上腺束状带细胞、肾上腺球状带细胞和/ 或肾上腺网状带细胞随机安排或规则分布于所述肾上腺类器官中。在某些其他具体实施方 式中，所述肾上腺嗜铬细胞在所述类器官中集合在一起，所述肾上腺束状带细胞在所述类 器官中集合在一起，所述肾上腺球状带细胞在所述类器官中集合在一起，和/或肾上腺网 状带细胞在所述肾上腺类器官中集合在一起。在另一【具体实施方式】中，所述肾上腺类器官 包含球状带细胞和束状带细胞，其中所述球状带细胞和束状带细胞在所述肾上腺类器官中 彼此分离。在另一【具体实施方式】中，所述肾上腺类器官包含球状带细胞和网状带细胞，其中 所述球状带细胞和网状带细胞在所述肾上腺类器官中彼此分离。在另一【具体实施方式】中， 所述肾上腺类器官包含网状带细胞和束状带细胞，其中所述网状带细胞和束状带细胞在所 述肾上腺类器官中彼此分离。在另一【具体实施方式】中，肾上腺类器官包含球状带细胞、束状 带细胞和网状带细胞、其中在所述肾上腺类器官中每种所述球状带细胞、束状带细胞和网 状带细胞与其他细胞种类分离。
[0187] 在某些【具体实施方式】中，肾上腺类器官进一步包含血管内皮细胞，其中所述血管 内皮细胞沿着所述胎盘血管支架的一条或多条血管配置。
[0188]4. 6. 5.胰腺
[0189] 胰腺包含胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺PP细胞和胰腺ε细胞。 在某些实施方式中，因此，本文提供了执行至少一种胰腺生理功能的类器官，例如，本文提 供了胰腺类器官。在【具体实施方式】中，所述至少一种胰腺生理功能是例如，在体外产生可 检测量的胰腺特异性激素或蛋白，或所述胰类器官产生可检测量的胰腺特异性激素或蛋 白，例如，胰淀素（也称为胰岛淀粉样多肽，或IAPP)、胰岛素、生长抑素、生长激素释放肽、 胰多肽、和/或胰高血糖素。在更具体的实施方式中，所述类器官在体外产生胰岛素和胰 淀素，其比例为约 10:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、110 ;1、120:1、130:1、140:1、150:1、 160:1、170:1、180:1、190:1或200:1。在某些实施方式中，所述类器官包含（例如，另外包 含）被基因工程改造以产生可检测量的胰淀素、胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、生长激素 释放肽、和/或胰多肽中的一种或多种的细胞。
[0190] 所述胰腺类器官产生的所述一种或多种胰腺特异性激素可通过可商购的分析方 法和试剂盒进行分析。例如，所述胰腺类器官在体外产生的胰岛素可通过任何常规胰岛素 检测试剂盒进行分析；所述胰腺类器官在体外产生的胰高血糖素可通过用于胰高血糖素的 ELISA试剂盒（UscnLifeScience,Inc.，武汉，中国）进行分析；胰类器官在体外产生的生 长抑素可通过人生长抑素（SST)ELISA(KamiyaBiomedicalCompany，Seattle，WA)进行分 析；胰类器官在体外产生的生长激素释放肽可通过生长激素释放肽（人，小鼠，大鼠）ELISA 试剂盒（Abnova，台北市，台湾）进行分析；胰类器官在体外产生的胰多肽可通过人胰多肽 (PP)ELISA试剂盒（EMDMillipore，Billerica，ME)进行分析；所述胰类器官产生的胰淀素 可通过IAPP(人）ELISA试剂盒（Abnova，台北市，台湾）进行分析。在前述各分析方法中， 在某些实施方式中，对培养类器官的培养基进行分析用于检测由所述类器官产生的特定激 素或蛋白。
[0191] 在某些【具体实施方式】中，肾上腺类器官进一步包含血管内皮细胞，其中所述血管 内皮细胞例如沿着所述胎盘血管支架中的一条或多条血管进行配置。
[0192]4. 6. 6.肝肿
[0193] 肝脏主要包含薄壁组织肝细胞，其与血管内皮细胞和Kupffer细胞一起占肝脏质 量的70% -80%。因此，在某些实施方式中，本文提供了执行至少一种肝脏生理功能的类器 官，例如，本文提供了肝类器官。
[0194] 在某些【具体实施方式】中，所述类器官产生可检测量的凝血因子I(纤维蛋白原）； 凝血因子II(凝血酶原）；凝血因子V(第5因子）；凝血因子VII(前转变素）；凝血因子 IX(Christmas因子）；凝血因子X(Stuart-Prower因子；凝血酶原酶）；凝血因子XI(血楽 促凝血酶原激酶前体）；蛋白C(自凝血酶原IIA;血凝血因子XIV)，蛋白S和/或抗凝血酶 中的一种或多种。在本文提供的任一类器官的多种其他实施方式中，所述类器官从氨基酸、 乳酸盐、甘油或糖原产生可检测量的葡萄糖。在其他实施方式中，所述类器官产生可检测量 的胰岛素样生长因子（IGF-I)或促血小板生成素。在其他实施方式中，所述类器官产生胆 汁。在本文提供的任一类器官的某些实施方式中，所述类器官包含产生凝血因子1(纤维 蛋白原）；凝血因子II(凝血酶原）；凝血因子V(第5因子）；凝血因子VII(前转变素）； 凝血因子IX(Christmas因子）；凝血因子X(Stuart-Prower因子；凝血酶原酶）；凝血因子 XI(血浆促凝血酶原激酶前体）；蛋白C(自凝血酶原IIA;血凝血因子XIV)、蛋白S、抗凝血 酶、IGF-I或促血小板生成素中的一种或多种的细胞。在本文提供的任一类器官的某些实 施方式中，所述类器官包含肝血管内皮细胞，例如，在所述胎盘血管支架中沿着血管进行配 置。在更具体的实施方式中，所述肝细胞沿着并基本平行于所述血管进行配置。
[0195] 所述肝类器官产生的所述一种或多种胰腺特异性激素可通过使用公开的可商购 的试剂盒和分析方法进行分析。例如，所述肝类器官产生的纤维蛋白原可通过人纤维蛋白 原ELISA试剂盒（AbFrontierCo.，Ltd. ,Seoul,KR)进行分析；所述肝类器官产生的凝血 酶原可通过凝血酶原（人）ELISA试剂盒（Abnova,台北市，台湾）进行分析；所述肝特异 性类器官产生的第5因子可通过Zymutest因子VELISA(Aniara，Mason, 0H)进行分析； 所述肝类器官产生的前转变素可通过因子VII(前转变素）活性分析（GentaurMolecular Products,Whetstone,London,UK)进行分析；所述肝类器官产生的凝血因子XI可通过全 人凝血因子XI抗原分析（MolecularInnovations,Novi,MI)进行分析；所述肝类器官产 生的凝血酶原酶可通过用于凝血因子X的ELISA试剂盒（UscnLifeScience,武汉，中国） 进行分析；所述肝类器官产生的凝血因子XI可通过因子XI人ELISA试剂盒（abl08834) (Abeam,Cambridge,MA)进行分析；所述肝类器官产生的蛋白C可通过用于血楽蛋白C的 显色分析试剂盒（AmericanDiagnostica，Pfungstadt，Germany)进行分析；所述肝类器官 产生的蛋白S可通过人游离蛋白SDLISA试剂盒（AmericanDiagnostica，Pfungstadt, Germany)进行分析；所述肝类器官产生的抗凝血酶可通过ACTICHROME?抗凝血酶 III显色活性试剂盒（AmericanDiagnostica，Pfungstadt，Germany)进行分析；所述肝类 器官产生的IGF-I可通过人IGF-1ELISA试剂盒（AbFrontier，Co.，Ltd.，Seoul，KR)进行 分析；所述肝类器官产生的促血小板生成素可使用人TPO/促血小板生成素ELISA试剂盒 (CellSciences,Canton,MA)进行评价。在前述各分析方法中，在某些实施方式中，对培养 类器官的培养基进行分析用于检测由所述类器官产生的特定激素或蛋白。
[0196]4. 7. #用类器官的方法
[0197] 本文提供的类器官可用于治疗患有特定疾病或病症调的个体，所述疾病或病症能 通过替换或增强生理功能进行治疗，例如产生生物分子，例如，蛋白或多肽、激素、细胞因 子、白介素、干扰素、前述任一项的受体，等等，例如，通过施用产生该生物分子的类器官，例 如，其在施用时，能替换或增强个体中天然存在的生物分子。如本领域普通技术人员判断为 合适的，本文其他部分提供的任何类器官可被用于治疗目的。
[0198] 在其他实施方式中，类器官产生的生物分子可从例如培养或维持该类器官的培养 基或缓冲液中分离。在其他实施方式中，类器官，或各自产生至少一种生物分子的多种类器 官，被包含在需要所述至少一种生物分子的人外部的容器中，其中该生物分子对于所述个 体是可获得的，例如通过在个体和容器之间的物理连接获得，例如，通过管道将维持类器官 的培养基或缓冲液引导至个体。
[0199] 垂体类器官，如上所述，其中类器官在施用其的个体中产生一种或多种垂体激素， 当个体在经历由于垂体激素产生缺乏或减少导致的病症时其可以是治疗性的。在各实施方 式中，该紊乱可以涉及非正常下降的生长、血压紊乱、母乳产生、性器官功能、甲状腺功能、 水调节和/或温度调节。
[0200] 在一种实施方式中，本文提供了治疗需要人生长激素（hGH)的个体的方法，包括 向所述个体施用产生hGH的类器官，或包含产生hGH的细胞的类器官，或由该类器官产生的 hGH，例如，治疗有效量的hGH，例如，上述4.6. 1节中描述的类器官。所述个体中产生的hGH 可使用例如人GHELISA试剂盒（AbFrontierCo.，Ltd. ;Seoul，KR)对给药后的个体血清样 本进行评价。
[0201] 在另一种实施方式中，本文提供了治疗需要催乳素（PRL)的个体的方法，包括向 所述个体施用产生PRL的类器官，或包含产生PRL的细胞的类器官，或由该类器官产生的 PRL，例如，治疗有效量的PRL，例如，上述4.6. 1节中描述的类器官。所述个体中产生的PRL 可使用例如催乳素ELISA(Immuno-BiologicalLaboratoriesAmerica)对给药后的个体血 清样本进行评价。在【具体实施方式】中，所述个体患有代谢综合征、动脉性勃起功能障碍、早 泄、少精症、弱精子症、精囊机能减退、或雄激素缺乏中的一种或多种。
[0202] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要促肾上腺皮质激素（ACTH)的个 体的方法，包括向所述个体施用产生ACTH的类器官，或包含产生ACTH的细胞的类器官，或 由该类器官产生的ACTH，例如，治疗有效量的ACTH，例如，上述4. 6. 1节中描述的类器官。所 述个体中产生的ACTH可使用例如ACTH(1-39)EIA试剂盒（Bachem，Torrance，CA)对给药后 的个体血清样本进行评价。在一种具体的实施方式中，所述个体患有阿狄森氏病。
[0203] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要黑素细胞-刺激激素（MSH)的个 体的方法，包括向所述个体施用产生MSH的类器官，或包含产生MSH的细胞的类器官，或由 该类器官产生的MSH，例如，治疗有效量的MSH，例如，上述4.6. 1节中描述的类器官。所述个 体中产生的MSH可使用例如人/小鼠/大鼠MSHEIA试剂盒（Raybiotech，Inc.;Norcross GA)对给药后的个体血清样本进行评价。在一种具体的实施方式中，所述个体患有阿尔茨海 默病。
[0204] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要甲状腺-刺激激素（TSH)的个体 的方法，包括向所述个体施用产生TSH的类器官，或包含产生TSH的细胞的类器官，或由该 类器官产生的TSH，例如，治疗有效量的TSH，例如，上述4.6. 1节中描述的类器官。所述个 体中产生的TSH可使用例如人TSHELISA试剂盒（Calbiotech，Inc. ,SpringValley,CA) 对给药后的个体血清样本进行评价。在一种具体的实施方式中，所述个体患有或表现为呆 小症。
[0205] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要卵泡-刺激激素（FSH)的个体的 方法，包括向所述个体施用产生FSH的类器官，或包含产生FSH的细胞的类器官，或由该类 器官产生的FSH，例如，治疗有效量的FSH，例如，上述4. 6. 1节中描述的类器官。所述个体 中产生的FSH可使用例如人FSHELISA试剂盒（Anogen，Mississauga,Ontario,加拿大） 对给药后的个体血清样本进行评价。在一种具体的实施方式中，所述个体患有或表现为不 孕或无精症。
[0206] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要黄体生成素（LH)的个体的方法， 包括向所述个体施用产生LH的类器官，或包含产生LH的细胞的类器官，或由该类器官产生 的LH，例如，治疗有效量的LH，例如，上述4. 6. 1节中描述的类器官。所述个体中产生的LH 可使用例如用于黄体生成激素的ELISA试剂盒（UscnLife Science,武汉，中国）对给药后 的个体血清样本进行评价。在一种具体的实施方式中，所述个体患有或表现为低睾酮、低精 子数或不孕。
[0207] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要抗利尿激素（ADH)的个体的方 法，包括向所述个体施用产生ADH的类器官，或包含产生ADH的细胞的类器官，或由该类器 官产生的ADH，例如，治疗有效量的ADH，例如，上述4.6. 1节中描述的类器官。所述个体中产 生的ADH可使用用于抗利尿激素（ADH)的CLIA试剂盒（UscnLifeScience,武汉，中国） 对给药后的个体血清样本进行评价。在一种具体的实施方式中，所述个体患有下丘脑性尿 崩症。
[0208] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要催产素的个体的方法，包括向所 述个体施用产生催产素的类器官，或包含产生催产素的细胞的类器官，或由该类器官产生 的催产素，例如，治疗有效量的催产素，例如，上述4. 6. 1节中描述的类器官。所述个体中产 生的催产素可使用例如OxytocinOTELISA试剂盒（MyBiosource，SanDiego,CA)对给药 后的个体血清样本进行评价。
[0209] 甲状腺类器官，如上所述，其中类器官在施用其的个体中产生一种或多种甲状腺 激素，当个体在经历由于甲状腺激素产生缺乏或减少导致的紊乱时其可以是治疗性的。在 各实施方式中，该紊乱可以涉及减少的代谢、甲状腺功能减退、Graves病、桥本甲状腺炎，等 等。
[0210] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要甲状腺素（T4)的个体的方法，包 括向所述个体施用产生T4的类器官，或包含产生T4的细胞的类器官，或由该类器官产生的 T4,例如，治疗有效量的T4,例如，上述4. 6. 2节中描述的类器官。所述个体中产生的T4可 使用例如总T4ELISA试剂盒（MyBiosource，SanDiego，CA)对给药后的个体血清样本进行 评价。在【具体实施方式】中，所述个体患有或表现为与T4缺陷有关的智障、侏儒症、虚弱、昏 睡、不耐寒、或满月脸。
[0211] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要三碘甲状腺原氨酸（T3)的个体 的方法，包括向所述个体施用产生T3的类器官，或包含产生T3的细胞的类器官，或由该类 器官产生的T3,例如，治疗有效量的T3,例如，上述4. 6. 2节中描述的类器官。所述个体中 产生的T3可使用例如总T3ELISA试剂盒（MyBiosource，SanDiego，CA)对给药后的个体血 清样本进行评价。在一种具体的实施方式中，所述个体患有心脏病。在更具体的实施方式 中，所述个体具有低于3.lpmol/L的T3血清浓度。
[0212] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要降钙素的个体的方法，包括向所 述个体施用产生降钙素的类器官，或包含产生降钙素的细胞的类器官，或由该类器官产生 的降钙素，例如，治疗有效量的降钙素，例如，上述4. 6. 2节中描述的类器官。所述个体中产 生的降I丐素可使用例如降I丐素ELISA试剂盒（MyBiosource，SanDiego,CA)对给药后的个 体血清样本进行评价。在【具体实施方式】中，所述个体患有骨质疏松或慢性自身免疫性甲状 腺机能减退。
[0213] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要副甲状腺激素（PTH)的个体的方 法，包括向所述个体施用产生PTH的类器官，或包含产生PTH的细胞的类器官，或由该类器 官产生的PTH，例如，治疗有效量的PTH，例如，上述4. 6. 3节中描述的类器官。所述个体 中产生的PTH可使用例如完整-PTHELISA试剂盒（Immuno-BiologicalLaboratories， Minneapolis,MN)对给药后的个体血清样本进行评价。
[0214] 肾上腺类器官，如上所述，其中类器官在施用其的个体中产生一种或多种肾上腺 激素，当个体在经历由于肾上腺激素产生缺乏或减少导致的紊乱时其可以是治疗性的。在 各实施方式中，该紊乱可以涉及代谢活性、脂肪或碳水化合物利用、炎症、库欣综合征和/ 或盐和水平衡调节异常。
[0215] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要醛固酮的个体的方法，包括向所 述个体施用产生醛固酮的类器官，或包含产生醛固酮的细胞的类器官，或由该类器官产生 的醛固酮，例如，治疗有效量的醛固酮，例如，上述4. 6. 4节中描述的类器官。所述个体中产 生的醒固酮可使用例如人醒固酮ELISA试剂盒（BioVendorLaboratoryMedicine，Inc.， Candler，NC)对给药后的个体血清样本进行评价。在【具体实施方式】中，所述个体患有自发 性醛留酮过少症、血肾素过高的醛留酮过少症或血肾素减少的醛留酮过少症。在另一种实 施方式中，所述个体患有慢性肾功能不全。
[0216] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要18羟基11脱氧皮质酮的个体的 方法，包括向所述个体施用产生18羟基11脱氧皮质酮的类器官，或包含产生18羟基11 脱氧皮质酮的细胞的类器官，或由该类器官产生的18羟基11脱氧皮质酮，例如，治疗有 效量的18羟基11脱氧皮质酮，例如，上述4. 4. 4节中描述的类器官。所述个体中产生的 18羟基11脱氧皮质酮可使用例如放射免疫分析对给药后的个体血清样本进行评价，参见 Chandler等人，Steroids27 (2) :235-246(1976)。
[0217] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要氟氢可的松的个体的方法，包括 向所述个体施用产生氟氢可的松的类器官，或包含产生氟氢可的松的细胞的类器官，或由 该类器官产生的氟氢可的松，例如，治疗有效量的氟氢可的松，例如，上述4. 6. 4节中描述 的类器官。所述个体中产生的氟氢可的松可使用例如液相色谱分析对给药后的个体血清样 本进行评价，参见Ast等人，J. Pharm. Sci. 68 (4) :421-423 (1979)。
[0218] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要可的松的个体的方法，包括向所 述个体施用产生可的松的类器官，或包含产生可的松的细胞的类器官，或由该类器官产生 的可的松，例如，治疗有效量的可的松，例如，上述4. 6. 4节中描述的类器官。所述个体中 产生的可的松可使用例如皮质醇ELISA试剂盒（EnzoLifeSciences,Inc. ,Farmingdale, NY)对个体的血清样本进行评价。在【具体实施方式】中，所述个体患有急性肾上腺不足、阿狄 森氏病或低血糖。
[0219] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要肾上腺素的个体的方法，包括向 所述个体施用产生肾上腺素的类器官，或包含产生肾上腺素的细胞的类器官，或由该类器 官产生的肾上腺素，例如，治疗有效量的肾上腺素，例如，上述4. 6. 4节中描述的类器官。所 述个体中肾上腺素的产生可使用例如肾上腺素RIA (Alpco Diagnostics, Salem, NH)对给药 后的个体血清样本进行评价。
[0220] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要雄烯二酮的个体的方法，包括向 所述个体施用产生雄烯二酮的类器官，或包含产生雄烯二酮的细胞的类器官，或由该类器 官产生的雄烯二酮，例如，治疗有效量的雄烯二酮，例如，上述4. 6. 4节中描述的类器官。个 体中产生的雄烯二酮可使用例如质谱对给药后的个体血清样本进行评价，参见Booker等 人，DrugTestingandAnalysisl(11-12) :587-595 (2009)，。
[0221] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要脱氢表雄酮（DHEA)的个体的方 法，包括向所述个体施用产生DHEA的类器官，或包含产生DHEA的细胞的类器官，或由该类 器官产生的DHEA，例如，治疗有效量的DHEA，例如，上述4. 6. 4节中描述的类器官。所述个 体中产生的DHEA可使用例如DHEAELISA试剂盒（AbnovaCorporation,台北市，台湾）对 给药后的个体血清样本进行评价。
[0222] 本文进一步提供了一种治疗需要化合物的个体的方法，包括施用产生所述化合 物的类器官，或包含产生所述化合物的细胞的类器官，或由该类器官产生的所述化合物， 例如，治疗有效量的所述化合物，例如，上述4. 6. 6节中描述的类器官，其中所述化合物为 凝血因子I(纤维蛋白原）；凝血因子II(凝血酶原）；凝血因子V(第5因子）；凝血因子 VII(前转变素）；凝血因子IX(Christmas因子）；凝血因子X(Stuart-Prower因子；凝血 酶原酶）；凝血因子XI(血浆促凝血酶原激酶前体）；蛋白C(自凝血酶原IIA;血凝血因子 XIV)，蛋白S和/或抗凝血酶。所述个体中这些化合物的存在可使用本领域已知的分析方 法对给药后的个体血清样本进行评价。
[0223] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要IGF-I的个体的方法，包括向所 述个体施用产生IGF-I的类器官，或包含产生IGF-I的细胞的类器官，或由该类器官产生的 IGF-I，例如，治疗有效量的IGF-I，例如，上述4. 6. 6节中描述的类器官。所述个体中产生 的IGF-I可使用例如人IGF-1ELISA试剂盒（AbFrontier，Co.，Ltd.，Seoul，KR)对来自所 述个体的血清样本进行评价。
[0224] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要促血小板生成素（Tpo)的个体的 方法，包括向所述个体施用产生Tpo的类器官，或包含产生Tpo的细胞的类器官，或由该类 器官产生的Τρο,例如，治疗有效量的Τρο,例如，上述4. 6. 6节中描述的类器官。所述个体 中产生的Tpo可使用例如人TPO/促血小板生成素ELISA试剂盒（CellSciences,Canton, MA)对来自所述个体的血清样本进行评价。
[0225] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要胰高血糖素的个体的方法，包括 向所述个体施用产生胰高血糖素的类器官，或包含产生胰高血糖素的细胞的类器官，或由 该类器官产生的胰高血糖素，例如，治疗有效量的胰高血糖素，例如，上述4. 6. 5节中描述 的类器官。所述个体中产生的胰高血糖素可使用本领域已知的分析方法对来自所述个体的 血清样本进行评价。
[0226] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要胰岛素的个体的方法，包括向所 述个体施用产生胰岛素的类器官，或包含产生胰岛素的细胞的类器官，或由该类器官产生 的胰岛素，例如，治疗有效量的胰岛素，例如，上述4. 6. 5节中描述的类器官。所述个体中产 生的胰岛素可使用本领域已知的血糖测试方法对来自所述个体的血样进行评价。在一种具 体的实施方式中，所述个体患有糖尿病。
[0227] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要胰淀素的个体的方法，包括向所 述个体施用产生胰淀素的类器官，或包含产生胰淀素的细胞的类器官，或由该类器官产生 的胰淀素，例如，治疗有效量的胰淀素，例如，上述4. 6. 5节中描述的类器官。所述个体中产 生的胰淀素可使用例如IAPP(人）ELISA试剂盒（Abnova，台北市，台湾）对来自所述个体的 血清样本进行评价。
[0228] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要生长激素释放肽的个体的方法， 包括向所述个体施用产生生长激素释放肽的类器官，或包含产生生长激素释放肽的细胞的 类器官，或由该类器官产生的生长激素释放肽，例如，治疗有效量的生长激素释放肽，例如， 上述4. 6. 5节中描述的类器官。所述个体中产生的生长激素释放肽可使用例如生长激素释 放肽（人，小鼠，大鼠）ELISA试剂盒（Abnova，台北市，台湾）对来自所述个体的血清样本进 行评价。
[0229] 在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要胰多肽（PP)的个体的方法，包括 向所述个体施用产生PP的类器官，或包含产生PP的细胞的类器官，或由该类器官产生的 PP，例如，治疗有效量的PP，例如，上述4. 6. 5节中描述的类器官。所述个体中产生的胰多肽 可使用例如人胰多肽（PP)ELISA试剂盒（EMDMillipore，Billerica，ME)对来自所述个体 的血清样本进行评价。
[0230] 在某些实施方式中，脱细胞胎盘可用于培养本文公开的任何细胞类型的一种或多 种。该一种或多种细胞可例如被接种至胎盘基质上，注射到胎盘基质内，和/或流过基本上 完整的胎盘血管支架一段时间，其足以使得至少多种该细胞附着于胎盘基质。细胞培养可 在例如细胞培养基中进行，例如在标准细胞培养条件下，如温度约37°C的空气+5%CO2下。 5.实施例
[0231] 5. 1.实施例1:脱细朐胎盘脒管的传导件
[0232] 本实施例演示了有效和轻柔地对胎盘进行脱细胞，以这样的方式基本上完整地保 留胎盘的血管基质，和成功地用非胎盘细胞再群体化血管基质的方法。
[0233] 材料和方法
[0234] 胎盘：使用的所有胎盘都进行预灌注以去除胎盘和脐带血。保留两个脐带动脉中 的灌注管并用于灌注脱细胞。胎盘或者立即用于灌注脱细胞，或者在_80°C冰箱中冷冻在密 封塑料袋中。
[0235] 灌注脱细胞：包含磷酸盐缓冲盐水（PBS)和分别包含1%TritonX-100、0. 5%SDS 和PBS的脱细胞溶液相继通过脐带动脉输入胎盘。脱细胞后残余的洗涤剂用PBS溶液清洗。 脱细胞的过程通过目测胎盘的形态改变、通过DNA含量分析和通过脱细胞组织H&E染色进 行监控。
[0236] 使用控制流速为8_16mL/min的蠕动泵（VWR)建立灌注脱细胞，并用第二个连接的 蠕动泵抽出流穿溶液至废水桶。灌注的每一步在8-24小时的过程中使用约10-20L培养基。 在完成最后的PBS灌注后，将脱细胞胎盘血管支架在4C下保存在添加抗生素（1 %青霉素 +链霉素）的PBS中，置于例如不锈钢盘或干燥器（VWR)中。在一个修改的流程中，在如上 所述的脱细胞前，将胎盘冷冻在-80°C下超过24小时，并在室温下解冻24小时。
[0237] DNA含量分析：胎盘组织中的DNA含量通过在处理中提取并检测组织DNA的量 来进行评价（表示为μgDNA/mg湿组织重量），其中使用组织DNA分离试剂盒（OMEGA Bio-Tek，Cat#D3396-01)。对于每个处理步骤，使用4-6个不同的个体样品提取DNA。
[0238]灌注溶液：10%TritonX-100、20%SDS和IOXPBS的母液购自AMRESCO、VWR或 Sigma，并用蒸馏水稀释至期望的浓度。
[0239] 流体传导性：建立了表面血管流体传导性（SVFC)分析以评价脱细胞胎盘血管支 架的流体传导性。简而言之，将0.4%台盼蓝（100mL-200mL)溶液灌注进脐带的两个动脉。 检测了胎盘片的定位上染料的距离和胎盘片的半径。通过在同一位置处染料经过的距离 (D)和胎盘片的半径（R)确定传导性，按照如下公式计算：(D/R)X100%。对于每个胎盘， 收集8个不同的数据点并取平均值。
[0240] 细胞传导性：通过在注入荧光素酶标记细胞后的荧光素酶表达细胞的分布考察了 脱细胞胎盘血管支架的细胞传导性。使用Xenogen IVIS Spectrum对细胞分布显像，使用 Living Image3.0软件分析数字生物发光数据。
[0241] 结果
[0242] 灌注脱细胞：方法开发
[0243] 对于如上所示的灌注脱细胞，脱细胞血管树显示出半透明或透明的外观，表明基 本上完全脱细胞。该半透明或透明的外观在几个不同胎盘中是可重现的，且不会因为脱细 胞前冷冻胎盘而发生改变。
[0244] 使用两步洗涤剂灌注（1% Triton X-100然后0. 5 % SDS)而不是如上所述的多步 和多种洗涤剂简化了脱细胞的方法。在形态观察中，脱细胞人胎盘从顶部至胎盘片底部表 现为白色和不透明的组织。DNA含量分析确认了简化的两步法能够用于有效和充分地获得 显著的DNA减少和脱细胞。
[0245] 脱细胞胎盘血管支架的表征：DNA含量分析
[0246] 组织的DNA含量被用于考察5个实验胎盘脱细胞的程度。结果显示与不用Triton X-100处理的胎盘组织相比，先用TritonX-100灌注会显著增加组织中的DNA含量（P= 0.02)，可能是因为TritonX-100改进了从组织中回收DNA。随后的0.5%SDS灌注减少了 69%的平均总DNA含量（N= 5,范围从81 %到50%)，与TritonX-100处理步骤相比显著 不同（P= 0.01)。第二个循环的TritonX-100和SDS灌注表现出增加DNA含量，可能是通 过进一步从组织中释放更多DNA。最后的PBS洗涤也减少了胎盘组织中DNA的量。DAPI和 H&E染色确认了在两轮灌注脱细胞后，脱细胞胎盘基质中几乎没有剩余完整的细胞核。残余 DNA最有可能是在脱细胞中释放的基因组DNA，其可使用例如DNAseI处理进行去除。值得 注意的是，残余DNA在脱细胞基质中存在，而不在血管系统中存在，因为来自脱细胞胎盘基 质的分离的血管具有很少的DNA含量。
[0247] 脱细胞胎盘血管支架表征：流体传导性
[0248] 为了表明脱细胞后胎盘血管系统的完整性，在脱细胞后将台盼蓝染料注入血管系 统中。台盼蓝染料从静脉中心分散至胎盘片边缘，表明脱细胞后主血管和小血管系统都保 留传导性。为了定量表征流体传导性，建立了一种称为"表面血管流体传导性"(SVFC)的方 法，如上述"方法"所述。注入台盼蓝染料后每个胎盘的SVFC在胎盘周围8个位置进行了 检测，其将胎盘放射状地分为大致相等的部分。3个胎盘的平均表面血管流体传导性测定为 93%。
[0249] 脱细胞胎盘血管支架表征：细胞传导性和分布
[0250] 为了考察脱细胞人胎盘血管支架的细胞传导性，荧光素酶标记细胞被灌注进脱细 胞胎盘脉管中，细胞在脱细胞基质中的分布通过荧光造影和数字分析进行测定。进行了 4 个个体实验（研究1至研究4)。
[0251] 研究1是关于方法建立的可行性研究，其使用3亿4T1-1UC小鼠乳腺癌细胞作为 注入的细胞群体。将胎盘在_80°C冷冻过夜，并解冻。使用0. IX PBS对胎盘进行脱细胞。 细胞注入前，通过灌注500mL的5% FCS-PBS对胎盘进行预条件化。首先注入重悬于300mL 细胞培养基中的细胞，然后注入I. 2mg/mL的荧光素。以3种不同设置在细胞注入后0小时 和2小时成像。进行定量图像分析（圆形图区和饼状图区）检测细胞分布。结果显示本新 型研究方法中，在胎盘支架中注入荧光素酶标记细胞可被成像并可视化。发现细胞在遍布 大部分胎盘脉管中的主血管和小血管中均有分布。
[0252] 研究2通过使用洗涤剂脱细胞来源的人胎盘血管支架验证了研究1的结果。具体 的，使用3亿4T1-1UC小鼠乳腺癌细胞作为注入的细胞群体对任何残余洗涤剂对荧光素酶 活性和细胞分布信号的影响进行了评价。通过冷冻和解冻进行脱细胞，如上所述，然后进行 两轮连续脱细胞，其中使用l%Triton X-100和0.5% SDS，然后进行PBS洗涤。在细胞注 入前还用5% FCS的PBS溶液预条件化胎盘基质。在本研究中，细胞和荧光素提前混合并注 入。确认了研究1的结果，细胞荧光素酶活性在注入后2小时仍然保留，表明基于洗涤剂的 胎盘支架脱细胞对于细胞没有毒性。
[0253] 研究3被设计为显示人细胞在脱细胞胎盘血管支架中的分布。不同于研究1和研 究2,重悬于300mL的生长培养基的3亿人乳腺癌MDA-231-Luc细胞被注入脱细胞胎盘中， 如研究1和研究2所述制备。人细胞在遍布整个胎盘脉管中有效分布，如小鼠细胞。
[0254] 研究4被设计为表明脱细胞人胎盘血管支架可通过细胞再群体化用于组织工程 培养细胞。通过在无菌不锈钢盘（9X2英寸）中培养完整的胎盘脉管基质建立了初型生物 反应器系统。通过在两个索动脉基质中插入输入管，和在胎盘静脉基质中插入输出管以收 集流穿的培养基/细胞建立了穿过基质的循环。细胞灌注过程中在37°C保温箱中培养胎 盘。用蠕动泵以约6-12mL/min的控制流速维持循环。将2亿人乳腺癌MDA-231-Luc细胞 重悬于500mL生长培养基中，并使用上述系统连续注入/再注入脱细胞人胎盘脉管中。循 环维持过夜，之后不再继续培养，并如研究1-3所述将荧光素注入胎盘脉管。
[0255] 在本系统中孵育过夜后，在培养物中不存在污染。盘中流动穿过培养基的分析未 发现细胞，表明基本上所有注入细胞都保留在胎盘血管支架中，其可能是因为重复的循环 所致。成像分析表明血管系统中的细胞分布与之前的研究相似。在均匀分布方面较之饼状 图-分析存在改进。在胎盘的母体面（maternalface)也发现了强信号，表明细胞分布在 整个胎盘厚度，从胎盘的胎儿面（即具有脐带的一侧）到母体面（即相对侧）。
[0256] 结论
[0257] 这一系列实验显示了对整个人胎盘进行脱细胞，而保留基本上完整的血管支架的 方法，并且该血管支架能够以最小的损失有效引导流体。这些结果支持了胎盘支架可用作 组织和器官工程的平台的构思。脱细胞人胎盘血管支架的潜在应用之一即是利用其工程化 构建体外类器官系统。
[0258]5. 2.实施例2 :#用脱细朐胎盘血管支架培养细朐
[0259] 本实施例表明另外的人细胞类型可被注入脱细胞胎盘血管支架并在其中培养。
[0260] 材料和方法
[0261] 按照如上实施例1的描述制备的人脱细胞胎盘支架被用于本研究。
[0262] 胎盘支架灭菌：室温下，在0. 1 %过乙酸（PAA)的PBS溶液中将脱细胞胎盘支架灭 菌3小时，每1小时更换溶液。用相同量的PBS搅拌洗涤6次，每次1小时。
[0263] 微支架组织制备：在无菌条件下用手术刀将脱细胞胎盘组织切成?2-3立方毫米 的小块。然后用细胞培养基冲洗小块。
[0264] 用于培养中再细胞化的细胞：GFP-PDAC?、HUVEC、293/GFP细胞（Cell Biolabs，Inc.)和H印aRG细胞被用于再细胞化研究。293/GFP细胞是从转化人腺病毒5型 DNA的原代胚胎人肾建立的永久细胞系，其被工程化以稳定表达绿色荧光蛋白。
[0265] 胎盘来源的贴壁细胞（PDAC? )的量子点标记：量子点（QDs)是荧光半导体纳 米颗粒，最近被用于体外和体内生物成像。在本研究中，根据供应商的说明使用Q605量子 点（Invitrogen)标记PDAC?。
[0266] 细胞生长分析：使用基于PromegaMTS流程的分析测定细胞生长，其中使用 CellTiter96?Aqueous分析试剂盒。简而言之，在每孔含100μ1培养基中的细胞的96 孔分析板的每个孔中加入20μ1的MTS溶液。在37°C下，5%CO2的潮湿空气中将板孵育1 小时，然后使用ELISA酶标仪记录490nm处的吸光度。
[0267]GFP定量分析：293/GFP细胞以2x104每96孔被接种至脱细胞胎盘血管支架（? 2X2X2mm3)上。在使用GFPELISA试剂盒（AKR-121)(CellBiolabs，Inc.)的定量GFP ELISA分析中根据供应商的说明检测细胞附着。
[0268] 活细胞/死细胞测定：使用CytoSelect96孔Anoikis分析染色试剂盒（CBA-081) (CellBiolabs，Inc.)测定活细胞和死细胞。
[0269] 组织学评价：使用H&E染色和Masson三色染色（Histoserv)进行脱细胞和再细胞 化的组织学评价。分析组织切片并在显微镜下记录。
[0270] 肝细胞功能分析：通过检测白蛋白产生（白蛋白蓝色荧光分析试剂盒;Active Motif，Carlsbad,CA);尿素分析（Quantichrom尿素分析NC9283832生物分析系统 No.DIUR-500,FisherScientificCo.);和P450 分析（P450-Glo?CYP3A4 分析（荧光 素-PFBE)基于细胞的/生物化学分析，Promega)测定肝细胞功能。
[0271]结果：
[0272] 脱细胞人胎盘血管支架（DHPVS)维持结构和ECM元件
[0273] 脱细胞胎盘基质代表了一种天然支架，在该支架上进行再群体化细胞和研究干细 胞再生组织或类器官的潜力。脱细胞胎盘表现为带有微血管树延伸的透明组织，其具有丰 富的棉花样基质。
[0274] 为了测定脱细胞过程对胎盘形态和结构的影响，将脱细胞血管支架固定于4%的 多聚甲醛并在用苏木精和曙红染色切片（H&E)后进行组织学分析。脱细胞基本上去除了所 有细胞，其证据是缺少细胞核的苏木精染色。H&E染色后在显微镜下容易观察到的胎盘结构 包括由绒毛组织包围的大血管和胎盘的特征性海绵基质，绒毛膜绒毛的最小分支。与脱细 胞后拍摄的图像不同，非脱细胞对照胎盘组织显示了丰富的细胞分布，其苏木精染色为阳 性（细胞核被染成蓝色）。
[0275] 为了评价脱细胞过程是否对胞外基质（ECM)元件及其排列具有不利影响，对相同 的脱细胞胎盘组织块进行固定并用H&E或Masson三色进行染色。在显微镜下肉眼观察显 示脱细胞胎盘组织确实是非细胞的，且胎盘基质是完整的。基质结构和胶原（ECM)(Masson 染色为绿色）被保留。
[0276] 脱细胞人胎盘血管支架（DHPVS)可用培养的细胞进行再细胞化
[0277]为了测定脱细胞胎盘支架是否能支持培养的细胞生长，将PDAC?和人脐带静脉 内皮细胞（HUVECs)接种在DHPVS块上，注射入该块，并在37°C下的潮湿、5%CO2的空气中 培养14天。得到的DHPVS组织块进行切片并用H&E染色进行再细胞化分析。在显微镜下 肉眼观察显示PDAC?能够沿着脱细胞支架表面生长并维持表明支架空间内的活细胞的 形态，且HUVEC再群体化了至少一部分血管支架。
[0278] 脱细胞人胎盘血管支架（DHPVS)上的细胞附着和生长的定量评价
[0279] 为了评价培养的细胞在DHPVS上的附着，使用了绿色荧光蛋白（GFP)量化分析。目 前的基于ELISA的分析能检测培养中低至30pg/ml的GFP。通过ELISA，接种至DHPVS上的 293/GFP细胞在24小时后表现了比相同细胞在96孔板中?1. 4倍（p= 0. 004)的更好的 生长。
[0280] 图1描述了接种于DHPVS上的293/GFP细胞相对于培养相同细胞的生长增加的代 表性实验结果。
[0281] PDAC?能够在脱细胞人胎盘血管支架（DHPVS)上附着和增殖
[0282] 为了测定DHPVS是否能够支持细胞生长，将PDAC?-GFP细胞接种至DHPVS块 上并培养。如荧光成像所示，细胞在培养中增殖，并被良好地整合入DHPVS中进行生长。还 通过MTS分析证实了PDAC?-GFP细胞在DHPVS中的增殖。PDAC?-GFP以2XIO4每 96孔在生长培养基中被接种至DHPVS块（?2X2X2mm3)上。在第1天和第3天将支架移 至新的96孔板进行MTS分析以评价细胞增殖。结果表明DHPVS对于PDAC?附着和增殖 是合适的支架。
[0283] 随后使用与上述相似的方法进行的实验表明在2周的培养周期中，DHPVS上培养 的PDAC?-GFP细胞与单独培养中的相同细胞生长相比增加了约2. 5倍（图2)。
[0284] 脱细胞的大、小和微胎盘血管上的PDAC?-GFP附着和生长
[0285] 脱细胞血管上的细胞附着和生长对于类器官再生是一个必需步骤。为了评价 PDAC?在分离的胎盘脱细胞血管上的附着和生长，脱细胞脐带（?2mm厚）被接种于 PDAC?-GFP(0.5X106于2ml培养基中）并培养3天，按照上述"方法"部分的描述进 行观察。得到的荧光图像显示PDAC?-GFP细胞在脱细胞血管附近优先附着和生长。
[0286] 作为评价细胞在脱细胞胎盘小血管中附着和生长的其他方法，将PDAC?-GFP 细胞和Q605标记的PDAC?等量混合至共IXIOfVmL并注射入DHPVM的小血管中，在37°C 下的生长培养基中培养3天。在相同血管区域中使用荧光显微镜对两个细胞群体拍照。 GFP-表达细胞和Qdot-标记细胞二者的代表性荧光图像表明PDAC?能够在脱细胞胎盘 小血管中附着和生长。
[0287] 还在脱细胞胎盘微血管中表明了组织特异性细胞的细胞附着和生长。为实现这一 目标，将浓度为IXIOfVmL的300μ1的293/GFP细胞注入DHPVM块（?3X3X5mm3)并在 24孔板中培养。7天后，观察细胞并拍照。结果显示在7天的过程中293/GFP细胞能够很 容易地在DHPVS中生长并良好分布。
[0288] 在脱细胞人胎盘血管支架中肝细胞能够维持功能性生长
[0289] 为了建立肝细胞在DHPVS中的生长，将H印aRG细胞以2X104/96孔接种于DHPVS， 或注射进DHPVS，并在620培养基中培养。在第4天和第7天用相差显微镜观察细胞并拍 照。结果显示在DHPVS的存在下H印aRG细胞表现出聚集的生长模式和肝细胞生长形态。图 3中显示了评价肝细胞在DHPVS上的生长的代表性实验结果。
[0290] 在培养第3天、第6天和第8天使用白蛋白分泌分析进行肝细胞功能性分析。收 集培养基样品并使用白蛋白蓝色荧光分析试剂盒（ActiveMotif)进行检测。使用纯化的 人白蛋白产生标准曲线。单独培养的肝细胞被用作对照。发现培养在DHPVS上的肝细胞比 缺少DHPVS生长的细胞产生显著更多的白蛋白（P〈0. 02)，表明在DHPVS中培养时肝细胞维 持重要功能。图4中显示了评价肝细胞在DHPVS上生长产生白蛋白的代表性实验结果。
[0291]5. 3.实施例3 :牛物打印的令·架支持胎盘干细朐的贴壁和牛长
[0292] 本实施例表明合成材料可被生物打印产生受控纤维直径和孔径的支架，且该支架 为胞外基质（ECM)的应用提供了合适的基质。本实施例进一步表明包含生物打印的合成材 料和ECM的支架（混合支架）代表了用于细胞附着和生长的合适基质，包括胎盘细胞，例如 胎盘干细胞。
[0293] 方法
[0294] 为了制造包含合成材料和ECM的混合支架，首先使用生物打印机（EnvisionTEC， Gladbeck，Germany)将聚己酸内醋（PCL) (Mn45, 000,Sigma)打印入支架（54X54X0· 64mm) 中。打印条件如下：温度90°C，打印压力3?5. 5巴，打印速度2?6mm/s，采用合适大小的 针。ECM如前所述从人胎盘分离（参见，例如，BhatiaMB，Wounds20,29,2008)。分离的ECM 被用于生物打印的PCL支架的两个面，并允许进行干燥（脱水），从而产生包含PCL和ECM 的混合支架。合成的混合PCL-ECM支架被压制成IOmm直径的盘，用培养基预湿过夜，并用 按照本文描述的方法（参见，例如，第4. 4节）制备的胎盘干细胞以12, 500细胞/cm2接种。 在8天的时间周期中培养细胞。在不同时间点（η= 3)按照标准流程进行钙黄绿素染色和 MTS增殖分析测定细胞活性和增殖。
[0295] 结果
[0296] 通过优化打印条件，产生了不同纤维大小、孔径和孔结构的PCL支架（图5)。打印 的纤维形成了用于产生包含PCL和ECM的混合支架的稳定的网络。此外，不同纤维大小和 孔结构的打印使得制造包含各种性质的混合支架成为可能。
[0297] 在生物打印的PCL支架两侧的ECM脱水导致产生混合支架。观察到PCL和ECM之 间良好的整合；在操作混合支架（即，通过处理或培养包括再水化的支架）时没有看到PCL 和ECM之间存在分离（图6)。
[0298] 胎盘干细胞随着时间遍布于混合支架的表面，且在培养第6天覆盖了混合支架大 部分表面。MTS细胞增殖分析表明细胞数量随时间显著增加（图7)。此外，接种在混合支 架上的胎盘干细胞在8天的培养周期中显示了良好的活性，如钙黄绿素染色所示（图8)。 这些数据一起表明PCL-ECM混合支架支持细胞附着、存活和生长。
[0299] 结论
[0300] 本实施例表明包含ECM和合成材料（PCL)的混合支架可通过包括生物打印的方法 产生，并且细胞不仅附着于该支架，而且当在该支架上培养时还能存活和增殖。
[0301]5. 4.实施例4:牛物打印的令·架支持胎盘干细朐的附着和牛长
[0302] 本实施例表明包含细胞，例如胎盘细胞，例如胎盘干细胞的合成材料和ECM可被 同时生物打印以产生混合支架。如本实施例所示，生物打印的细胞不仅在生物打印过程存 活，而且在与混合支架培养中随时间增殖。
[0303] 方法
[0304] 按照实施例3的描述制备ECM，并与含1百万/ml胎盘干细胞的0. 5%藻酸盐水 凝胶进行混合。接下来，PCL和含细胞的ECM被生物打印成层，以产生包含PCL和ECM的混 合支架。在每层支架中，首先打印PCL，然后打印ECM/细胞元件以填充PCL线之间的缝隙。 打印2或5个所述层，用CaCl2溶液交联产生混合支架。生物打印的含细胞的支架（细胞/ ECM/PCL)被培养7天，在多个时间点通过钙黄绿素染色和MTS细胞增殖分析评价细胞增殖 和存活。
[0305] 结果
[0306] 在整个细胞培养周期中，生物打印的支架维持了完整的结构（图9)。PCL为ECM 水凝胶提供了一个良好的结构支撑，其允许产生三维结构。生物打印后和整个培养中，细胞 在整个三维结构中良好分布；在培养中支架的整个深度均发现细胞（图10)。
[0307] 胎盘干细胞在生物打印过程中存活并在培养自始至终在三维生物打印的混合支 架中继续增殖，如钙黄绿素染色所示（图11)。如图12所示，发现大部分细胞遍布混合支架 的整个ECM，表明ECM增强了细胞附着和在ECM水凝胶中的扩散。这通过比较细胞在单独的 藻酸盐中的位置和在支架中的细胞的位置得到了确认。此外，如图13所示，MTS细胞增殖 分析显示了在2层和5层支架均出现细胞数量增长，表明这些混合支架支持细胞生长。
[0308] 结论
[0309] 本实施例表明包含ECM和合成材料（PCL)的混合支架可通过包括ECM和PCL同时 生物打印的方法产生。本实施例还表明一个事实，即细胞可以与混合支架（ECM和PCL)的 元件一起生物打印，且细胞在生物打印过程中存活，其表明细胞，例如，胎盘干细胞，可以被 生物打印至表面，例如脱细胞胎盘血管支架。此外，与混合支架的元件一起生物打印的细胞 当培养于该支架上时发生增殖，且比培养在单独的细胞基质（藻酸盐）中更好地遍布于支 架。本实施例进一步显示细胞能够在生物打印中存活。
[0310]5. 5.实施例5 :#用脱细朐胎盘血管支架产牛的功能类器官
[0311] 本实施例表明功能类器官可使用脱细胞胎盘血管支架（DPVS)工程化。
[0312] 方法
[0313] 人甲状腺组织来源的细胞系CRL1803_TT( "TT";可获自美国典型培养物保藏中心 ("ATCC")），且人脐带静脉内皮细胞（HUVEC)被单独培养或在如上所述制备的DPVS上共培 养。作为比较点，在没有DPVS作为基质下共培养HUVEC和TT，在没有DPVS作为基质下单独 培养。
[0314] 将每种细胞接种于DPVS块上。使用MTT分析（Promega)检测活细胞定量分析， 通过检测由TT细胞向培养基上清中分泌的降钙素评价TT细胞的功能（降钙素水平通过 ELISA检测）。
[0315] 结果
[0316]MTT分析显示，当HUVEC和TT在DPVS上共培养时，活性细胞总数与在组织培养摇 瓶（无DPVS)中常规培养条件下观察到的相似，表明当共培养TT细胞和HUVEC时，在DPVS 上的培养对细胞活性不具有负面影响（图14)。DPVS上单独培养的TT细胞显示了比在组 织培养摇瓶中培养的TT细胞略低的活细胞数量，而DPVS上单独培养HUVEC得到了与在组 织培养摇瓶中培养的HUVEC相当数量的活细胞（图14)。
[0317] 当在DPVS上培养TT细胞时检测了由TT细胞产生的降钙素，但其水平较之在组织 培养摇瓶中单独培养TT细胞产生的降钙素略有下降；无论细胞是否用DPVS培养，与HUVEC 共培养的TT细胞产生的降钙素都是相当的，表明当培养于DPVS上时TT细胞的功能维持不 变（图15)。
[0318] 结论
[0319] 多种类型的细胞被培养于DPVS上仍保持活性并维持其功能，因而表明了DPVS是 产生类器官的合适基质。
[0320]5. 6.实施例6:#用脱细朐胎盘血管支架产牛的功能类器官
[0321] 本实施例进一步表明功能类器官可使用脱细胞胎盘血管支架（DPVS)工程化。
[0322] 方法
[0323] 人甲状腺组织来源的细胞系CRL1803_TT( "TT"）和人胎盘来源的贴壁细胞 (PDAC? )被单独培养或在如上所述制备的DPVS上共培养。作为比较点，在没有DPVS作 为基质下共培养PDAC?和TT，在没有DPVS作为基质下单独培养。
[0324] 将每种细胞接种于DPVS块上。使用MTT分析（Promega)检测活细胞定量，通过 检测由TT细胞向培养基上清中分泌的降钙素评价TT细胞的功能（降钙素水平通过ELISA 检测）。通过检测由PDAC?细胞向培养基上清中分泌的HGF(肝细胞生长因子）评价 PDAC?细胞的功能（HGF水平通过ELISA检测）。
[0325] 结果
[0326]MTT分析显示当PDAC?和TT在DPVS上共培养时，活性细胞总数与在组织培养 摇瓶（无DPVS)中常规培养条件下观察到的相似，表明当共培养TT细胞和PDAC?时，在 DPVS上的培养对细胞活性不具有负面影响（图16)。DPVS上单独培养的TT细胞和DPVS上 单独培养的PDAC?得到了与在组织培养摇瓶中单独培养的TT细胞和PDAC?相当数 量的活细胞（图16)。
[0327] 如实施例5所示，当在DPVS上培养TT细胞时检测了由TT细胞产生的降钙素（图 17)。无论细胞是否用DPVS培养，与PDAC?共培养的TT细胞产生的降钙素都是可检测的， 但是其水平随着培养周期发生变化（图17)。如TT细胞一样，在DPVS上培养时，PDAC? 维持了其功能，如通过其分泌HGF的能力所证实的那样（图18)。
[0328] 结论
[0329] 本实施例表明多种类型的细胞，包括胎盘干细胞，可被培养于DPVS上，且在培养 周期内细胞的活性和功能仍然得到维持，进一步验证了DPVS是产生类器官的合适基质。
[0330] 5. 7.实施例7 :DPVS h培养的细朐维持代谢活跃
[0331] 本实施例证明了DPVS上培养的细胞维持活力和代谢活跃。
[0332] 培养基中的HCTl16细胞（可获自ATCC)经由脐带动脉被注入脱细胞胎盘（DPVS) 中并置于培养箱中。使用泵维持细胞在DPVS中的循环。在培养箱中持续培养48小时，从培 养的DPVS的不同解剖学位置切下部分组织以检测细胞活性。从培养的胎盘的每个解剖学 位置（DPVS的顶部、中部和底部）分析了 20个不同的组织切片。使用MTS分析（Promega) 检测细胞活性。
[0333] 培养48小时后，细胞被相对均匀地定位于胎盘的全部3个部分，其中每个0.5cm3 的组织切片估计含有约40, 000-60, 000个细胞（图19)。
[0334] 通过收集不同时间点的培养基并分析同一时间进程中培养基的营养条件与对照 培养基（相同培养基，不含HCTl16细胞）中的营养条件对比，来评价DPVS中的HCTl16细 胞活性。使用自动培养基分析仪评价营养条件。如下表1所示，在DPVS中培养HCT116细 胞5小时至24小时消耗cGlu(葡萄糖），表明细胞除了维持活力之外还是代谢活跃的。
[0335]表1
[0336]

【权利要求】
1. 一种类器官，包含一种或多种类型的细胞，并且包含脱细胞胎盘血管支架，其中，所 述类器官执行器官或来自器官的组织的至少一种功能，其中所述器官或来自器官的组织的 至少一种功能是产生来自所述器官或组织的至少一种细胞类型所特有的蛋白、生长因子、 细胞因子、白介素或小分子；并且其中所述脱细胞胎盘血管支架包含基本上完整的胎盘脉 管基质。
2. 权利要求1的类器官，包含约1012个细胞。
3. 权利要求1的类器官，包含约1011个细胞。
4. 权利要求1的类器官，包含约101CI个细胞。
5. 权利要求1的类器官，包含约109个细胞。
6. 权利要求1-5中任一项的类器官，另外还包含合成基质。
7. 权利要求6的类器官，其中，所述合成基质稳定了所述胎盘血管支架的三维结构。
8. 权利要求6或权利要求7的类器官，其中，所述合成基质包含聚合物或热塑性材料。
9. 权利要求6或权利要求7的类器官，其中，所述合成基质是聚合物或热塑性材料。
10. 权利要求8或权利要求9的类器官，其中，所述热塑性材料是聚己酸内酯、聚乳酸、 聚对苯二甲酸丁二酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚酯、聚醋酸乙烯酯或聚氯乙烯。
11. 权利要求8或权利要求9的类器官，其中，所述聚合物是聚偏二氯乙烯、聚（邻羧基 苯氧基）-对二甲苯）（聚（o-CPX))、聚（交酯-酸酐）（PLAA)、n-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰 胺、戊赤藓糖醇二丙烯酸酯、聚丙烯酸甲酯、羧甲基纤维素、或聚（乳酸-羟基乙酸共聚物） (PLGA)。
12. 权利要求8或权利要求9的类器官，其中，所述聚合物是聚丙烯酰胺。
13. 权利要求1-12中任一项的类器官，其中，所述一种或多种类型的细胞包含自然杀 伤（NK)细胞。
14. 权利要求13的类器官，其中，所述NK细胞包含⑶56+⑶16^胎盘中间自然杀伤 (PiNK)细胞。
15. 权利要求1-14中任一项的类器官，其中，所述类器官包含树突状细胞。
16. 权利要求1-15中任一项的类器官，其中，所述类器官包含胸腺细胞。
17. 权利要求16任一项的类器官，其中，所述类器官包含胸腺细胞、淋巴细胞、上皮网 状细胞和胸腺基质细胞。
18. 权利要求1-17中任一项的类器官，其中，所述类器官包含滤泡细胞。
19. 权利要求18的类器官，其中，所述类器官包含表达甲状腺球蛋白的细胞。
20. 权利要求18或权利要求19的类器官，其中，所述类器官另外还包含甲状腺上皮细 胞和滤泡旁细胞。
21. 权利要求1-20中任一项的类器官，其中，所述类器官包含干细胞或祖细胞。
22. 权利要求21的类器官，其中，所述干细胞或祖细胞为胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、 诱导的多潜能干细胞、间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质基质细 胞、组织塑料贴壁胎盘干细胞（PDAC?)、脐带干细胞、羊水干细胞、羊膜来源的贴壁细胞 (AMDACs)、成骨胎盘贴壁细胞（OPACs)、脂肪干细胞、角膜缘干细胞、牙髓干细胞、成肌细胞、 内皮祖细胞、神经元干细胞、脱落牙齿来源的干细胞、毛囊干细胞、皮肤干细胞、孤雌生殖来 源的干细胞、重编程干细胞、羊膜来源的贴壁细胞或侧群干细胞。
23. 权利要求1-22中任一项的类器官，其中，所述类器官包含造血干细胞或造血祖细 胞。
24. 权利要求1-23中任一项的类器官，其中，所述类器官包含组织培养塑料贴壁 CD34 'CD10+、CD105+ 和CD200+ 胎盘干细胞。
25. 权利要求24的类器官，其中，所述胎盘干细胞另外还是⑶45_、⑶80_、⑶86-或 ⑶90+的一种或多种。
26. 权利要求25的类器官，其中，所述胎盘干细胞另外还是⑶45_、⑶80_、⑶86-和 CD90+。
27. 权利要求24-26中任一项的类器官，其中，当所述类器官被移植到受体中时，所述 胎盘干细胞抑制所述受体中的免疫应答。
28. 权利要求27的类器官，其中，所述胎盘干细胞局部抑制所述受体中的免疫应答。
29. 权利要求1-28中任一项的类器官，其中，所述类器官包含分化的细胞。
30. 权利要求29的类器官，其中，所述分化的细胞包含内皮细胞、上皮细胞、真皮细胞、 内胚层细胞、中胚层细胞、成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、肝细 胞、胰腺细胞或间质细胞。
31. 权利要求29的类器官，其中，所述分化的细胞包含唾液腺粘液细胞、唾液腺浆液细 胞、vonEbner腺细胞、乳腺细胞、泪腺细胞、聍腺细胞、外分泌汗腺暗细胞、外分泌汗腺清除 细胞、顶泌汗腺细胞、Moll腺细胞、皮脂腺细胞、鲍曼腺细胞、Brunner腺细胞、精囊细胞、前 列腺细胞、尿道球腺细胞、Bartholin腺细胞、Littre腺细胞、子宫内膜细胞、分离的杯状细 胞、胃粘膜粘液细胞、胃底腺胃酶细胞、胃底腺泌酸细胞、胰腺腺泡细胞、潘氏细胞、II型肺 泡细胞、克拉拉细胞， 促生长激素细胞（somatotrope)、乳促素细胞、促甲状腺细胞、促性腺细胞、促皮质激素 细胞、中间垂体细胞、大细胞神经分泌细胞、肠细胞、呼吸道细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁 细胞、副甲状腺细胞、副甲状腺主细胞、嗜酸细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸间质细胞、鞘 内细胞、黄体细胞、颗粒黄体细胞、鞘黄体细胞、近血管球细胞、致密斑细胞、极周细胞、系膜 细胞， 血管和淋巴管内皮穿孔细胞、血管和淋巴管内皮连续细胞、血管和淋巴管内皮脾脏细 胞、滑膜细胞、浆膜细胞（腹膜、胸膜和心包腔）、鳞状细胞、柱状细胞、暗细胞、前庭膜细 胞（耳朵的衬内淋巴空间）、血管纹基底细胞、血管纹边缘细胞（耳朵的衬内淋巴空间）、 Claudius细胞、Boettcher细胞、脉络丛细胞、软膜蛛网膜鳞片状细胞、色素睫状上皮细胞、 非色素睫状上皮细胞、角膜内皮细胞、钉形细胞， 呼吸道纤毛细胞、输卵管纤毛细胞、子宫内膜纤毛细胞、睾丸网纤毛细胞、输精小管纤 毛细胞、纤毛室管膜细胞， 表皮角质细胞、表皮基底细胞、手指甲和脚趾甲角质细胞、甲床基底细胞、脊髓毛干细 胞、外皮毛干细胞、表皮毛干细胞、表皮毛根鞘细胞、Huxley层毛根鞘细胞、Henle层毛根鞘 细胞、外毛根鞘细胞、毛基质细胞， 复层扁平上皮的表面上皮细胞、上皮基底细胞、泌尿上皮细胞， 柯蒂氏器官听觉内毛细胞、柯蒂氏器官听觉外毛细胞、嗅上皮基底细胞、冷敏感的初级 感觉神经元、热敏感初级感觉神经元、Merkel表皮细胞、嗅觉受体神经元、痛觉初级感觉神 经元、光受体视杆细胞、光受体蓝色敏感圆锥细胞、光受体绿色敏感圆锥细胞、光受体红色 敏感圆锥细胞、本体感受初级感觉神经元、触摸感应初级感觉神经元、I型颈动脉体细胞、II 型颈动脉体细胞（血液pH传感器）、耳前庭器官I型毛细胞（加速度和重力）、耳前庭器官 II型毛细胞、I型味蕾细胞， 胆碱能神经细胞、肾上腺素能神经细胞、肽能神经细胞， 柯蒂氏器官的内柱细胞、柯蒂氏器官的外柱细胞、柯蒂氏器官的内指细胞、柯蒂氏器官 的外指细胞、柯蒂氏器官的边缘细胞、柯蒂氏器官的Hensen细胞、前庭器官支持细胞、味蕾 支持细胞、嗅上皮支持细胞、Schwann细胞、卫星细胞、肠胶质细胞， 星形细胞、神经原、寡树突细胞、纺锤体神经元， 前晶状体上皮细胞、含晶体蛋白的晶状体纤维细胞， 肝细胞、脂肪细胞、白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞、肝脂肪细胞， 肾小球壁细胞、肾小球足细胞、肾近端小管刷状缘细胞、亨利氏套薄段细胞、肾远端小 管细胞、肾集合管细胞、I型肺泡壁细胞、胰管细胞、无横纹管细胞、管细胞、肠刷状缘细胞、 外分泌腺纹状管细胞、胆囊上皮细胞、输精小管非纤毛细胞、附睾主细胞、附睾基底细胞， 造釉上皮细胞、半月面上皮细胞、柯蒂氏器官的牙间上皮细胞、疏松结缔组织成纤维 细胞、角膜基质细胞、肌腱成纤维细胞、骨髓网状组织成纤维细胞、非上皮成纤维细胞、周细 胞、髓核细胞、成牙骨质细胞/牙骨质细胞、成牙质细胞、牙质细胞、透明软骨软骨细胞、纤 维软骨软骨细胞、弹性软骨软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、骨祖细胞、玻璃体细胞、 星状细胞（耳）、肝星状细胞（Ito细胞）、胰星状细胞， 红色骨骼肌细胞、白色骨骼肌细胞、中间骨骼肌细胞、肌梭核袋细胞、肌梭核链细胞、卫 星细胞、普通心肌细胞、节点心肌细胞、浦肯野纤维细胞、平滑肌细胞、虹膜肌上皮细胞、夕卜 分泌腺肌上皮细胞， 网织红细胞、巨核细胞、单核细胞、结缔组织巨噬细胞、表皮Langerhans细胞、树突状 细胞、小胶质细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制 T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞， 黑素细胞、视网膜色素上皮细胞， 卵原细胞/卵母细胞、精子细胞、精母细胞、精原细胞、精细胞、卵巢卵泡细胞、Sertoli细胞、胸腺上皮细胞和/或间质肾细胞。
32. 权利要求1-31中任一项的类器官，其中，所述细胞组合物中的细胞是原代培养细 胞。
33. 权利要求1-31中任一项的类器官，其中，所述细胞组合物中的细胞是已在体外培 养的细胞。
34. 权利要求1-33中任一项的类器官，其中，所述细胞被基因工程改造以产生该细胞 不能天然产生的蛋白或多肽，或被基因工程改造以产生比该细胞天然产生的蛋白或多肽的 量更多的蛋白或多肽，其中所述细胞组合物包含分化的细胞。
35. 权利要求34的类器官，其中，所述蛋白或多肽是细胞因子或包含其活性部分的肽。
36. 权利要求35的类器官，其中，所述细胞因子是肾上腺髓质素（AM)、血管生成素 (Ang)、骨形态发生蛋白（BMP)、脑源性神经营养因子（BDNF)、表皮生长因子（EGF)、促红细 胞生成素（Epo)、成纤维细胞生长因子（FGF)、胶质细胞系来源的神经营养因子（GNDF)、 粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、生长分化因子 (⑶F-9)、肝细胞生长因子（HGF)、肝癌衍生生长因子（HDGF)、胰岛素样生长因子（IGF)、迁 移-刺激因子、肌生成抑制蛋白（⑶F-8)、髓单核细胞生长因子（MGF)、神经生长因子（NGF)、 胎盘生长因子（P1GF)、血小板来源的生长因子（PDGF)、促血小板生成素（Tpo)、转化生长因 子〇〇^-〇)、了6卩-@、肿瘤坏死因子〇〇^-〇)、血管内皮生长因子（￥￡6卩）、或1拉蛋白。
37. 权利要求35或权利要求36的类器官，其中，所述类器官包含1X108个细胞，并且 在生长培养基中体外培养24小时后产生至少1. 0-10iiM的所述细胞因子。
38. 权利要求35的类器官，其中，所述蛋白或多肽是AM、Ang、BMP、BDNF、EGF、Epo、FGF、 GNDF、G-CSF、GM-CSF、⑶F-9、HGF、HDGF、IGF、迁移-刺激因子、⑶F-8、MGF、NGF、P1GF、PDGF、 Tpo、TGF-a、TGF- 0、TNF-a、VEGF、或Wnt蛋白的可溶性受体。
39. 权利要求38的类器官，其中，所述类器官包含1X108个细胞，并且在生长培养基中 体外培养24小时后产生至少1. 0-10iiM的所述可溶性受体。
40. 权利要求35的类器官，其中，所述蛋白是白介素。
41. 权利要求40的类器官，其中，所述白介素是白介素-la(IL-la)、IL-10、IL_lFl、 IL-1F2、IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-1235kDaa亚单位、IL-1240kDaP亚单 位、IL-12a和 0 亚单位、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、 IL-17E、IL-17F同种型 1、IL-17F同种型 2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23pl9 亚单位、IL-23p40 亚单位、IL-23pl9 亚单位和IL-23p40 亚单位一起、IL-24、IL-25、IL-26、 IL-27B、IL-27-p28、IL-27B和IL-27-p28 -起、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、 IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36a、IL-36 卩、IL-36y。
42. 权利要求40或权利要求41的类器官，其中，所述类器官包含1X108个细胞，并且 在生长培养基中体外培养24小时后产生至少1. 0-10yM的所述白介素。
43. 权利要求35的类器官，其中，所述蛋白或多肽是IL-la、IL-1P、IL-1F1、IL-1F2、 IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-1235kDaa亚单位、IL-1240kDaP亚单位、IL-13、 IL-14、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F同种型 1、IL-17F 同种型 2、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23pl9 亚单位、IL-23p40 亚单位、IL-24、 IL-25、IL-26、IL-27B、IL-27-p28、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、 IL-34、IL-35、IL-36a、IL-36P、IL-36y的可溶性受体。
44. 权利要求43的类器官，其中，所述类器官包含1X108个细胞，并且在生长培养基中 体外培养24小时后产生至少1. 0-10iiM的所述可溶性受体。
45. 权利要求35的类器官，其中，所述蛋白是干扰素（IFN)。
46. 权利要求45的类器官，其中，所述干扰素是IFN-a、IFN-运、IFN-y、IFN-入1、 IFN-X2、IFN-X3、IFN-K、IFN-e、IFN-k、IFN-t、IFN-S、IFN- 4、IFN-w或IFN-v。
47. 权利要求45或权利要求46的类器官，其中，所述类器官包含1X108个细胞，并且 在生长培养基中体外培养24小时后产生至少1. 0-10yM的所述干扰素。
48. 权利要求35的类器官，其中，所述蛋白或多肽是IFN-a、IFN-@、IFN-y、IFN-入1、 IFN-X2、IFN-X3、IFN-K、IFN-e、IFN-k、IFN-t、IFN-S、IFN- 4、IFN-w或IFN-v的可 溶性受体。
49. 权利要求48的类器官，其中，所述类器官包含1X108个细胞，并且在生长培养基中 体外培养24小时后产生至少1. 0-10iiM的所述可溶性受体。
50. 权利要求35的类器官，其中，所述蛋白是胰岛素或前胰岛素。
51. 权利要求50的类器官，其中，所述类器官包含1X108个细胞，并且在生长培养基中 体外培养24小时后产生至少1. 0-10iiM的所述胰岛素。
52. 权利要求35的类器官，其中，所述蛋白是胰岛素的受体。
53. 权利要求50或权利要求51的类器官，其中，所述细胞被另外基因工程改造以产生 前激素转化酶1、前激素转化酶2、或羧肽酶E中的一种或多种。
54. 权利要求35的类器官，其中，所述蛋白是瘦蛋白（LEP)。
55. 权利要求54的类器官，其中，所述类器官包含1X108个细胞，并且在生长培养基中 体外培养24小时后产生至少1. 0-10iiM的所述瘦蛋白。
56. 权利要求35的类器官，其中，所述蛋白是促红细胞生成素。
57. 权利要求56的类器官，其中，所述类器官包含1X108个细胞，并且在生长培养基中 体外培养24小时后产生至少1. 0-10iiM的所述可溶性受体。
58. 权利要求35的类器官，其中，所述蛋白是促血小板生成素。
59. 权利要求58的类器官，其中，所述类器官包含1X108个细胞，并且在生长培养基中 体外培养24小时后产生至少1. 0-10iiM的所述可溶性受体。
60. 权利要求35的类器官，其中，所述蛋白是酪氨酸3-单氧酶。
61. 权利要求60的类器官，其中，所述类器官包含1X108个细胞，并且在生长培养基中 体外培养24小时产生至少1. 0-10iiM的L-DOPA。
62. 权利要求60或权利要求61的类器官，其中，所述细胞被进一步工程化以表达芳香 L-氨基酸脱羧酶。
63. 权利要求62的类器官，其中，所述类器官包含1X108个细胞，并且在生长培养基中 体外培养24小时后产生至少1. 0-10iiM的多巴胺。
64. 权利要求63的类器官，其中，所述蛋白是激素或前激素。
65. 权利要求64的类器官，其中，所述激素是缪氏管抑制激素（AMH)、脂联素（Acrp30)、 促肾上腺皮质激素（ACTH)、血管紧张素（AGT)、血管紧张素原（AGT)、抗利尿激素（ADH)、血 管加压素、心房-利尿钠肽（ANP)、降钙素（CT)、胆囊收缩素（CCK)、促肾上腺皮质素-释放 激素（CRH)、促红细胞生成素（Epo)、卵泡-刺激激素（FSH)、睾酮、雌激素、胃泌素（GRP)、 饥饿素、胰高血糖素（GCG)、促性腺素-释放激素（GnRH)、生长激素（GH)、生长激素释放激 素（GHRH)、人绒膜促性腺激素（hCG)、人胎盘催乳素（HPL)、抑制素、黄体生成素（LH)、黑素 细胞刺激激素（MSH)、食欲素、催产素（0XT)、副甲状腺激素（PTH)、催乳素（PRL)、松弛素 (RLN)、分泌素（SCT)、生长抑素（SRIF)、促血小板生成素（Tpo)、甲状腺-刺激激素（Tsh)、 和/或促甲状腺素-释放激素（TRH)。
66. 权利要求35的类器官，其中，所述蛋白是细胞色素P450侧链裂解酶（P450SCC)。
67. 权利要求35的类器官，其中，所述蛋白是患有遗传缺陷或疾病的个体中缺失或失 能的蛋白。
68. 权利要求67的类器官，其中： 所述遗传缺陷或疾病是家族性高胆留醇血症，并且所述蛋白是低密度脂蛋白受体 (LDLR)； 所述遗传缺陷或疾病是多囊性肾病，并且所述蛋白是多囊蛋白-l(PKDl)、PKD-2或PKD3 ;或者 所述遗传缺陷或疾病是苯丙酮尿症，并且所述蛋白是苯丙氨酸羟化酶。
69. 权利要求1-68中任一项的类器官，其中，所述类器官包含免疫抑制性化合物或抗 炎性化合物。
70. 权利要求69的类器官，其中，所述化合物是非留体抗炎药（NSAID)、对乙酰氨基酚、 萘普生、布洛芬、阿司匹林、类固醇、抗-T细胞受体抗体、抗-IL-2受体抗体、巴利昔单抗、达 利珠单抗(ZENAPAX?)、抗T细胞受体抗体（例如，莫罗莫那-⑶3)、咪唑硫嘌呤、皮质 类固醇、环孢霉素、他克莫司、霉酚酸酯、西罗莫司、钙调神经磷酸酶抑制剂，等等。在一种具 体的实施方式中，所述免疫抑制剂是抗巨噬细胞炎性蛋白（MlP)-la或MIP-1P中和抗体。
71. 权利要求1-70中任一项的类器官，其中，所述类器官执行肝、肾、胰、甲状腺或肺的 至少一种功能。
72. 权利要求1-71中任一项的类器官，包含垂体腺嗜酸细胞。
73. 权利要求1-72中任一项的类器官，包含垂体嗜碱细胞。
74. 权利要求72或权利要求73的类器官，同时包含垂体腺嗜酸细胞和嗜碱细胞。
75. 权利要求72-74中任一项的类器官，包含垂体促生长激素细胞。
76. 权利要求72-74中任一项的类器官，包含垂体催乳激素细胞。
77. 权利要求72-74中任一项的类器官，包含垂体促肾上腺皮质激素细胞。
78. 权利要求72-74中任一项的类器官，包含垂体促甲状腺激素细胞。
79. 权利要求72-74中任一项的类器官，包含垂体促性腺细胞。
80. 权利要求72-79中任一项的类器官，其中，所述类器官包含垂体生长激素细胞、垂 体催乳激素细胞、垂体促肾上腺皮质激素细胞、垂体促甲状腺激素细胞、和/或垂体促性腺 细胞中的两种或更多种。
81. 权利要求72-79中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检测量 的生长激素（GH)。
82. 权利要求72-79中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检测量 的促生长激素（STH)。
83. 权利要求72-79中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检测量 的催乳素（PRL)。
84. 权利要求72-79中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检测量 的促肾上腺皮质激素（ACTH)。
85. 权利要求72-79中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检测量 的黑素细胞-刺激激素（MSH)。
86. 权利要求72-79中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检测量 的甲状腺-刺激激素（TSH)。
87. 权利要求72-79中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检测量 的卵泡-刺激激素（FSH)。
88. 权利要求72-79中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检测量 的黄体生成素（LH)。
89. 权利要求1-88中任一项的类器官，其中，所述类器官包含产生GH、STH、PRL、ACTH、 MSH、TSH、FSH、ADH和/或LH中的一种或多种的细胞。
90. 权利要求1-88中任一项的类器官，其中，所述细胞被基因工程改造以产生GH、STH、 PRL、ACTH、MSH、TSH、FSH、ADH和 / 或LH中的一种或多种。
91. 权利要求1-90中任一项的类器官，包含下丘脑神经元。
92. 权利要求1-90中任一项的类器官，包含垂体细胞。
93. 权利要求91或权利要求92的类器官，包含下丘脑神经元和垂体细胞。
94. 权利要求91-93中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检测量 的抗利尿激素（ADH)。
95. 权利要求91-93中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检测量 的催产素。
96. 权利要求1-95中任一项的类器官，其中，所述类器官包含产生ADH和/或催产素中 的一种或两种的细胞。
97. 权利要求96的类器官，其中，所述类器官包含被基因工程改造以产生ADH和/或催 产素中的一种或两种的细胞。
98. 权利要求1-97中任一项的类器官，包含内皮血管形成细胞。
99. 权利要求1-98中任一项的类器官，其中，所述类器官包含甲状腺上皮细胞。
100. 权利要求1-99中任一项的类器官，其中，所述类器官包含甲状腺滤泡旁细胞。
101. 权利要求1-100中任一项的类器官，其中，所述类器官包含产甲状腺球蛋白细胞。
102. 权利要求99-101中任一项的类器官，其中，所述类器官包含甲状腺上皮细胞、甲 状腺滤泡旁细胞和产甲状腺球蛋白细胞中的两种或更多种。
103. 权利要求1-102中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检测 量的甲状腺素（T4)。
104. 权利要求1-102中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检测 量的三碘甲状腺原氨酸（T3)。
105. 权利要求99-104中任一项的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的降钙素。
106. 权利要求99-105中任一项的类器官，其中，所述类器官包含产生T3、T4和/或降 钙素中的一种或多种的细胞。
107. 权利要求99-106中任一项的类器官，其中，所述类器官包含经过基因工程改造以 产生T3、T4和/或降钙素中的一种或多种的细胞。
108. 权利要求1-107中任一项的类器官，其中，所述类器官包含副甲状腺主细胞。
109. 权利要求1-108任一项的类器官，其中，所述类器官包含副甲状腺嗜酸细胞。
110. 权利要求108或权利要求109的类器官，其中，所述类器官包含副甲状腺主细胞和 副甲状腺嗜酸细胞。
111. 权利要求108-111中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检 测量的副甲状腺激素（PTH)。
112. 权利要求108-111中任一项的类器官，其中，所述类器官包含产生PTH的细胞。
113. 权利要求111或权利要求112的类器官，其中，所述类器官包含经过基因工程改造 以产生所述PTH的细胞。
114. 权利要求1-113中任一项的类器官，其中，所述类器官包含肾上腺球状带细胞。
115. 权利要求1-114中任一项的类器官，其中，所述类器官包含肾上腺束状细胞。
116. 权利要求1-115中任一项的类器官，其中，所述类器官包含肾上腺网状带细胞。
117. 权利要求1-116中任一项的类器官，其中，所述类器官包含肾上腺嗜铬细胞。
118. 权利要求114-117中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检 测量的醛固酮。
119. 权利要求114-117中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检 测量的18羟基11脱氧皮质酮。
120. 权利要求114-117中任一项的类器官，其中，所述类器官在体外培养中产生可检 测量的氟氢可的松。
121. 权利要求114-117中任一项的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的可的松。
122. 权利要求114-117中任一项的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的非可的 松糖皮质激素。
123. 权利要求114-117中任一项的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的肾上腺 素。
124. 权利要求114-117中任一项的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的肾上腺 甾酮。
125. 权利要求114-117任一项的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的脱氢表雄 酮。
126. 权利要求114-125中任一项的类器官，其中，所述类器官包含产生醛固酮、18羟基 11脱氧皮质酮、可的松、氟氢可的松、非可的松糖皮质激素、肾上腺素、肾上腺留酮、和/或 脱氢表雄酮中的一种或多种的细胞。
127. 权利要求126的类器官，其中，所述类器官包含经过基因工程改造以产生醛固酮、 18羟基11脱氧皮质酮、可的松、氟氢可的松、非可的松糖皮质激素、肾上腺素、肾上腺甾酮、 和/或脱氢表雄酮中的一种或多种的细胞。
128. 权利要求1-127中任一项的类器官，其中，所述类器官包含肝细胞。
129. 权利要求128的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的凝血因子I(纤维蛋白 原）；凝血因子11(凝血酶原）；凝血因子V(第5因子）；凝血因子VII(前转变素）；凝血因 子1乂(〇11^81：11^8因子）；凝血因子乂(31：皿1'1：-?1'0￥61'因子 ；凝血酶原酶）；凝血因子乂1(血 浆促凝血酶原激酶前体）；蛋白C(自凝血酶原IIA;血凝血因子XIV)，蛋白S和/或抗凝血 酶中的一种或多种。
130. 权利要求128的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的来自氨基酸、乳酸盐、 甘油或糖原的葡萄糖。
131. 权利要求128的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的胰岛素样生长因子 (IGF-1)或促血小板生成素。
132. 权利要求128的类器官，其中，所述类器官产生胆汁。
133. 权利要求1-132中任一项的类器官，其中，所述类器官包含产生凝血因子I(纤维 蛋白原）；凝血因子II(凝血酶原）；凝血因子V(第5因子）；凝血因子VII(前转变素）； 凝血因子IX(Christmas因子）；凝血因子X(Stuart_Prower因子；凝血酶原酶）；凝血因子 XI(血浆促凝血酶原激酶前体）；蛋白C(自凝血酶原IIA;血凝血因子XIV)、蛋白S、抗凝血 酶、IGF-1或促血小板生成素中的一种或多种的细胞。
134. 权利要求1-133中任一项的类器官，其中，所述类器官包含肝血管内皮细胞。
135. 权利要求1-134中任一项的类器官，其中，所述类器官包含胰腺a细胞。
136. 权利要求1-135中任一项的类器官，其中，所述类器官包含胰腺0细胞。
137. 权利要求1-136中任一项的类器官，其中，所述类器官包含胰腺S细胞。
138. 权利要求1-137中任一项的类器官，其中，所述类器官包含胰腺PP细胞。
139. 权利要求1-138中任一项的类器官，其中，所述类器官包含胰腺e细胞。
140. 权利要求1-139中任一项的类器官，其中，所述类器官包含胰腺a细胞、胰腺3 细胞、胰腺S细胞、胰腺PP细胞和/或胰腺e细胞中的两种或更多种。
141. 权利要求135-140中任一项的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的胰高血 糖素。
142. 权利要求135-140中任一项的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的胰岛素。
143. 权利要求135-140中任一项的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的胰淀素。
144. 权利要求135-140中任一项的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的胰岛素 和可检测量的胰淀素。
145. 权利要求144的类器官，其中，所述类器官以约50:1至约200:1的比例产生所述 胰岛素和所述胰淀素。
146. 权利要求128-140中任一项的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的生长抑 素。
147. 权利要求128-140中任一项的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的生长激 素释放肽。
148. 权利要求128-140中任一项的类器官，其中，所述类器官产生可检测量的胰多肽。
149. 权利要求128-140中任一项的类器官，其中，所述类器官包含产生可检测量的胰 岛素、胰高血糖素、胰淀素、生长抑素、胰多肽、和/或生长激素释放肽中的一种或多种的细 胞。
150. -种对需要人生长激素（hGH)的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利 要求72-81中任一项的类器官。
151. -种对需要促生长激素（STH)的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利 要求72-80或82中任一项的类器官。
152. -种对需要催乳素（PRL)的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求 72-80或83任一项的类器官。
153. 权利要求152的方法，其中，所述个体患有代谢综合征、动脉性勃起功能障碍、早 泄、少精症、弱精子症、精囊机能减退、或雄激素缺乏中的一种或多种。
154. -种对需要促肾上腺皮质激素（ACTH)的个体进行治疗的方法，包括向所述个体 施用权利要求72-80或84中任一项的类器官。
155. 权利要求154的方法，其中，所述个体患有阿狄森氏病。
156. -种对需要黑素细胞-刺激激素（MSH)的个体进行治疗的方法，包括向所述个体 施用权利要求72-80或85任一项的类器官。
157. 权利要求156的方法，其中，所述个体患有阿尔茨海默症。
158. -种对需要甲状腺-刺激激素（TSH)的个体进行治疗的方法，包向对所述个体施 用权利要求72-80或86中任一项的类器官。
159. 权利要求158的方法，其中，所述个体患有或表现为呆小症。
160. -种对需要卵泡-刺激激素（FSH)的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用 权利要求72-80或87中任一项的类器官。
161. 权利要求160的方法，其中，所述个体患有或表现为不孕或无精症。
162. -种对需要黄体生成素（LH)的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利 要求72-80或88中任一项的类器官。
163. 权利要求162的方法，其中所述个体患有或表现为低睾酮、低精子数或不孕。
164. -种对需要抗利尿激素（ADH)的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利 要求91-94中任一项的类器官。
165. 权利要求164的方法，其中，所述个体患有下丘脑性尿崩症。
166. -种对需要催产素的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求91-93 或95-97中任一项的类器官。
167. -种对需要甲状腺素（T4)的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要 求99-103、106或107中任一项的类器官。
168. 权利要求167的方法，其中，所述个体患有或表现为智障、侏儒症、虚弱、昏睡、不 耐寒、或满月脸。
169. -种对需要三碘甲状腺原氨酸（T3)的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施 用权利要求99-102、104、106或107中任一项的类器官。
170. 权利要求169的方法，其中，所述个体患有心脏病。
171. 权利要求170的方法，其中，所述个体具有低于3.lpmol/L的T3血清浓度。
172. -种对需要降钙素的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求 99-102或105-107中任一项的类器官。
173. 权利要求172的方法，其中，所述个体患有骨质疏松或慢性自身免疫性甲状腺机 能减退。
174. -种对需要副甲状腺激素（PTH)的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权 利要求108-113中任一项的类器官。
175. -种对需要醛固酮的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求 114-118、126或127中任一项的类器官。
176. 权利要求175的方法，其中，所述个体患有自发性醛留酮过少症、血肾素过高的醛 甾酮过少症、或血肾素减少的醛留酮过少症。
177. 权利要求175的方法，其中，所述个体患有慢性肾功能不全。
178. -种对需要18羟基11脱氧皮质酮的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用 权利要求114_117、119、126或127中任一项的类器官。
179. -种对需要氟氢可的松的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求 114-117、120、126或127中任一项的类器官。
180. -种对需要可的松的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求 114-117、121、126或127中任一项的类器官。
181. 权利要求180的方法，其中，所述个体患有急性肾上腺不足、阿狄森氏病、或低血 糖。
182. -种对需要非可的松糖皮质激素的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权 利要求114-117、122、126或127中任一项的类器官。
183. -种对需要肾上腺素的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求 114-117、123、126或127中任一项的类器官。
184. -种对需要肾上腺留酮的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求 114-117、124、126或127中任一项的类器官。
185. -种对需要脱氢表雄酮的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求 114-117或125-127中任一项的类器官。
186. -种对需要化合物的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求139或 权利要求143的类器官，其中所述化合物是凝血因子I(纤维蛋白原）；凝血因子II(凝血酶 原）；凝血因子V(第5因子）；凝血因子VII(前转变素）；凝血因子IX(ChristmaS因子）； 凝血因子X(Stuart-Prower因子；凝血酶原酶）；凝血因子XI(血浆促凝血酶原激酶前体）； 蛋白C(自凝血酶原IIA ;血凝血因子XIV)，蛋白S和/或抗凝血酶。
187. -种对需要IGF-1的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求128或 权利要求131的类器官。
188. -种对需要促血小板生成素的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要 求128或权利要求131的类器官。
189. -种对需要胰高血糖素的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求 135-141中任一项的类器官。
190. -种对需要胰岛素的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求 135-140、142、144或145中任一项的类器官。
191. 权利要求190的方法，其中，所述个体患有糖尿病。
192. -种对需要胰淀素的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求 135-140或143-145中任一项的类器官。
193. -种对需要生长激素释放肽的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要 求135-140或147的类器官。
194. 一种对需要胰多肽的个体进行治疗的方法，包括向所述个体施用权利要求 135-140或148的类器官。
【文档编号】A61K35/12GK104411318SQ201280070203
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2011年12月23日
【发明者】莫希特·B·巴迪亚, 罗伯特·J·哈黎里, 沃尔夫冈·霍弗伽纳尔, 王家伦, 叶谦 申请人:人类起源公司