用于治疗糖尿病的基于ctp的胰岛素类似物的制作方法

用于治疗糖尿病的基于ctp的胰岛素类似物的制作方法
【专利摘要】提供对胰岛素受体具有高效能和特异性的包含非天然糖基化位点序列的胰岛素类似物。在一个实施方案中，大于18个氨基酸的肽序列用作连接人胰岛素A链和B链或其类似物或衍生物的连接部分以提供高效能单链胰岛素类似物。在一个实施方案中，连接部分包含一个或多个糖基化位点。还公开了胰岛素类似物的前药和缀合物衍生物。
【专利说明】用于治疗糖尿病的基于CTP的胰岛素类似物
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请要求2011年12月20日提交的美国临时专利申请号61/578, 052的优先权，其 公开内容通过引用以其整体明确结合到本文中。
[0002] 发明背景 胰岛素是一种经过验证的疗法，用于治疗幼年型糖尿病和较晚阶段的成人型糖尿病。 该肽经生物合成为低效能（约天然胰岛素的2%-9%)的较大线性前体，称为胰岛素原。胰岛 素原通过选择性脱去35个残基连接肽（C肽）而被蛋白水解转化为胰岛素。通过胰岛素 "A 链"（SEQ ID N0:1)和"B链"（SEQ ID N0:2)链之间的二硫键形成所得的共有51个氨基 酸的异源双链，对胰岛素受体具有高效能（nM范围）。天然胰岛素对胰岛素受体具有相对于 相关胰岛素样生长因子1受体约100倍的选择性亲和力，但是对于两种不同的胰岛素受体 同种型（名为A和B)几乎无选择性。
[0003] 胰岛素样生长因子1和2是单链线性肽激素，在其A和B链序列中是高度同源 的，与天然胰岛素具有约50%同源性。IGF A和B链由"C肽"连接，其中两种IGF的C肽在 大小和氨基酸序列上不同，第一个长为12个氨基酸，第二个长为8个氨基酸。人IGF-1为 70个aa的碱性肽，具有SEQ ID N0: 3所示的蛋白质序列，并与胰岛素原具有43%同源性 (Rinderknecht 等（1978) J. Biol. Chem. 253:2769-2776)。人 IGF-2 为 67 个氨基酸的 碱性肽，具有SEQ ID N0: 4所示的蛋白质序列。与对A受体同种型的活性相比，IGF对胰 岛素 B受体同种型的活性显著更小。
[0004] 申请人:之前已经鉴定出基于IGF-1的胰岛素肽类似物（其中B链的天然Gln-Phe 二肽被Tyr-Leu置换），其对胰岛素受体显示高活性（参见PCT/US2009/068713,其公开内 容结合到本文中）。这类类似物（本文称为IGFYL类似物肽（analog p印tide))比胰岛素 更容易合成，并且使得能够开发用于胰岛素和IGF-1受体的共同激动剂（co-agonist)类似 物和选择性胰岛素受体特异性类似物。此外，可按照本公开内容，将这些胰岛素类似物配制 成单链胰岛素激动剂。
[0005] 胰岛素是一种经过验证的疗法，用于治疗幼年型糖尿病和较晚阶段的成人型糖尿 病，但是胰岛素是一种治疗指数相对狭窄的疗法。理想的胰岛素疗法是一种能够提供一天 一次定时作用（qd)的胰岛素制剂。自然界利用糖基化抑制多种天然蛋白质的肾清除，如本 文所公开的，提供可在生物合成期间被糖基化的胰岛素类似物。更具体地讲，本公开内容的 一个方面描述了胰岛素类似物，其经过修饰以包括当蛋白质在真核细胞表达系统中表达时 易于〇 _联1?糖基化的肤序列。
[0006] 另外，这些胰岛素激动剂类似物可被进一步修饰以产生这样的类似物：治疗指数 改进（例如通过应用前药化学）；作用持续时间延长（例如通过连接血浆蛋白例如白蛋白 或其它修饰，包括聚乙二醇化和酰化）；和优选的组织靶向（例如通过利用用胆固醇或维生 素样取代基进行化学修饰）。使用肽接头序列（包括例如包含糖基化位点的肽接头序列） 制备单链胰岛素类似物，还提供新的结构位置，其中可成功地配置许多的这些化学修饰。这 种优化胰岛素激动剂的主要用途可以是用于胰岛素依赖型糖尿病的治疗。
[0007] 发明概述 如本文公开的，提供经过修饰以包含通过真核细胞表达系统而被糖基化的肽序列的 胰岛素类似物。在一个实施方案中，胰岛素类似物经过修饰以包含命名为C端肽的肽序列 (CTP:SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR;SEQ ID N0: 64)，当蛋白质在真核细胞表达系统 中表达时其易被0-联高糖基化。CTP肽可与两链胰岛素类似物的B链N端和/或羧基端共 价连接而又不削弱胰岛素类似物的固有体外活性。甚至更出乎意料的是CTP肽还可用于连 接胰岛素的B链和A链以形成单链胰岛素类似物同时以天然胰岛素原C肽所不能的方式依 然保持高的体外效能的事实。
[0008] 按照一个实施方案中，提供包含A链和B链和CTP肽的胰岛素类似物。在一 个实施方案中，A链包含序列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)，B链包含序列 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 96)。更具体地讲，A链和B链通过二硫键彼此 连接，且所述CTP肽与B链的氨基端和/或羧基端共价连接。在一个实施方案中，CTP肽包 含序列 SSSSX5(IAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51 (SEQ ID N0: 66)，其中 X5(l 和 X51 独立选自精 氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，制备单链胰岛素类似物，其中B链的羧基端通过CTP肽 与A链的氨基端连接，而在又一个实施方案中，单链胰岛素类似物任选包含与B链的氨基端 连接的CTP肽。在另一个实施方案中，提供作为两链构建体的胰岛素类似物，其中CTP肽共 价连接于B链的C端（任选第二CTP连接于B链的氨基端）。当包含CTP肽的两个或更多 个序列与本文公开的胰岛素类似物连接时，包含CTP肽的序列可相同或不同。体外和体内 表征揭示CTP修饰的胰岛素类似物在缺乏糖基化时具有高效能。因此，胰岛素类似物通过 连接CTP肽的修饰提供以糖基化（一种使蛋白质持续时间更久的天然方法）为基础的延长 胰岛素作用的机制。
[0009] 甚至更出乎意料的是， 申请人:发现在使用肽作为连接A链和B链的连接部分而制 备单链胰岛素类似物时，不必保持CTP肽的精确序列。因此，在一个实施方案中，提供包含 A链、B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中连接部分包含共价连接B链羧基端与A链 氨基端而形成连续氨基酸链的至少18个氨基酸的肽（包括例如18-158、29-87或29-58个 氨基酸的肽），前提条件是连接部分不含与直接连接B链羧基端的SEQ ID N0: 53的18个 氨基酸序列片段相同的18个氨基酸序列。在一个实施方案中，连接部分包含与B链的羧 基端氨基酸直接连接的29个连续氨基酸序列，其中构成所述29个连续氨基酸序列的氨基 酸的至少58%为丝氨酸或脯氨酸。在另一个实施方案中，连接部分包含与B链的羧基端氨 基酸直接连接的29个连续氨基酸序列，其中29个连续氨基酸序列与SEQ ID N0: 64有大 于55、60、65、75、80、85、90、92或95%序列同一性，前提条件是连接部分不含与SEQ ID NO: 53的18个氨基酸序列片段相同的18个氨基酸序列。在另一个实施方案中，连接部分包含 SEQ ID N0: 66的序列。在一个实施方案中，A链包含序列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)，B 链包含序列 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 96)。
[0010] 在又一个实施方案中，本发明还包括编码本文公开的胰岛素类似物的核酸序列以 及包含所述核酸序列的原核和真核细胞。按照一个实施方案，使用包含编码本文公开的修 饰的胰岛素类似物的核酸序列的真核宿主细胞来产生高糖基化胰岛素类似物。
[0011] 本文公开的胰岛素激动剂可包含天然胰岛素 B链和A链序列或或其当以异源双链 彼此连接时具有胰岛素激动剂活性的任何已知的类似物或衍生物。本文所公开的这类A链 和B链肽可通过CTP肽或其衍生物肽彼此连接形成单链胰岛素激动剂，或CTP肽可与两链 胰岛素异源双链的A链或B链的氨基端或羧基端连接。按照一个实施方案，B链包含序列 R22-X25LCGX29X3QLVX 33X34LX36LVCGX41X42GFX 45 (SEQ IDNO: 16)，而 A 链包含序列 GIVX4X5CCX8X9X10CX 12LX14X15LX17X18X 19CX21-R13 (SEQ ID NO: 18)，其中 X4为谷氨酸或天冬氨酸； X5为谷氨酰胺或谷氨酸； X8为组氨酸或苯丙氨酸； X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； Χ1(ι为异亮氨酸或丝氨酸； Χ12为丝氨酸或天冬氨酸； Χ14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； Χ15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸； χ17为谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺； χ18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸； Χ19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸； X25为组氨酸或苏氨酸； X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸； Χ3〇选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； Χ33选自天冬氨酸和谷氨酸； &4选自丙氨酸和苏氨酸； Χ36为酪氨酸； X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺； X42选自丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸； χ45为酪氨酸； R22 选自 AYRPSE (SEQ ID NO: 11)、FVNQ (SEQ ID NO: 10)、PGPE (SEQ ID NO: 9)、三 肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二 肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端胺；和 R13为C00H或C0NH2。在一个实施方案中，X8、X25和X 3(l各自为组氨酸。
[0012] 本公开内容包括胰岛素激动剂的其它衍生物，包括改进基础胰岛素激动剂的溶解 性的修饰。在一个实施方案中，通过亲水部分与肽的共价连接提高胰岛素激动剂肽的溶解 性。在一个实施方案中，亲水部分与B链的N端氨基酸或位于B链末端的氨基酸（例如存在 于B26-30任一位置的赖氨酸）的侧链或包含在单链胰岛素类似物中结合B链与A链的连接 部分的任何氨基酸的侧链连接。在一个实施方案中，亲水部分为白蛋白，包括例如白蛋白， 例如人血清白蛋白（HSA)和重组人白蛋白（rHA)。在一个实施方案中，亲水部分为聚乙二醇 (PEG)链，分子量选自约500-约40, 000道尔顿。在一个实施方案中，聚乙二醇链的分子量 选自约500-约5, 000道尔顿。在另一个实施方案中，聚乙二醇链的分子量为约10, 000-约 20, 000道尔顿。
[0013] 酰化或烷基化可延长胰岛素类似物肽及其前药衍生物在循环中的半衰期。酰化或 烷基化可有利地延迟对胰岛素受体的作用起始和/或延长作用持续时间。本文公开的胰岛 素类似物可在亲水部分连接的相同的氨基酸位置处或在不同的氨基酸位置处通过酰化或 烷基化被进一步修饰。
[0014] 本公开内容还包括包含胰岛素类似物和药学上可接受的载体的药物组合物。按照 一个实施方案，提供包含本文公开的任何胰岛素类似物或其衍生物（优选纯度水平为至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂 的药物组合物。所述组合物可含有如本文所公开的胰岛素激动剂肽，浓度为至少0.5 mg/ ml、l mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、6 mg/ml、7 mg/ml、8 mg/ml、9 mg/ml、10 mg/ml、ll mg/ml、12 mg/ml、13 mg/ml、14 mg/ml、15 mg/ml、16 mg/ml、17 mg/ml、18 mg/ml、 19 mg/ml、20 mg/ml、21 mg/ml、22 mg/ml、23 mg/ml、24 mg/ml、25 mg/ml 或更高。在一个实 施方案中，药物组合物包含经灭菌和任选保存在各种包装容器内的水溶液。在其它实施方 案中，药物组合物包含冻干粉。药物组合物可作为药盒的部分被进一步包装，所述药盒包括 将组合物给予患者的一次性装置。可对容器或药盒进行标记以保存在环境室温下或冰冻温 度下。
[0015] 按照一个实施方案，提供产生高糖基化胰岛素类似物的方法。在一个实施方案 中，所述方法包括提供包含编码含CTP肽的胰岛素类似物的基因的真核宿主细胞（例如 酵母、小鼠或人），并在允许胰岛素类似物基因表达的条件下培养细胞。在一个实施方案 中，宿主细胞表达人糖基化酶，使得宿主细胞中广生的糖基化蛋白质（糖蛋白）显不与人 细胞的蛋白质糖基化相同的蛋白质糖基化（参见美国专利申请公布号2004/0018590和 2002/0137134,其公开内容通过引用结合到本文中）。
[0016] 按照一个实施方案中，提供调节胰岛素依赖型患者的血糖水平的改进方法。该方 法包括以治疗上有效控制糖尿病的量将本文公开的胰岛素激动剂肽或其药用盐或其它衍 生物给予患者的步骤。
[0017] 附图简述 图1是用于制备人胰岛素的两步合成策略的示意图。实施例1提供了该方法的详情。
[0018] 图2是比较合成人胰岛素相对于纯化的天然胰岛素的胰岛素受体特异性结合的 图。通过图1详述的方法产生合成胰岛素，其中A 7-B7键是形成的第一个二硫键。如图中提 供的数据表明，两种分子具有相似的结合活性。
[0019] 图3是比较天然胰岛素和A19胰岛素类似物（胰岛素（p-NH2-F)19)的相对胰岛素 受体结合的图。如图中提供的数据表明，两种分子具有相似的结合活性。
[0020] 图4是比较天然胰岛素和IGF1(YB16LB17)类似物的相对胰岛素受体结合的图。如图 中提供的数据表明，两种分子具有相似的结合活性。
[0021] 图 5 是人胰岛素原（A 链，SEQ ID NO: 1 ;B 链 SEQ ID N0: 2 和 C 链，SEQ ID N0: 53)和胰岛素样生长因子I和II (IGF I ;SEQ ID NO: 3和IGF II ;SEQ ID NO: 4)氨基酸 序列的比对。该比对表明，这3种肽具有高水平的序列同一性（*表示没有对应的氨基酸的 空区，短线（_)表示与存在于胰岛素中相同的氨基酸）。
[0022] 图6是用于制备IGF1 (YB16LB17) (p-NH2-F)A19前药衍生物的合成流程的示意图。具 体衍生物是P-NH 2-F，其中芳族胺用二肽Aib-Ala酰化，其用作阴性对照，因为这种二肽在生 理条件下不切割。
[0023] 图 7 是比较 IGF1 (YB16LB17) (p-NH2-F)A19和 IGF1 (YB16LB17) (p-NH2-F)A19-AibAla 的 二肽延伸形式的相对胰岛素受体结合的图。该前药的合成见图6,其中二肽AibAla在A19 位处结合（即IGF1 (YB16LB17) (AibAla)。二肽在生理条件下不易切割，因此活性极低，这表明 了在该位点被二肽酰化使生物活性沉默的能力。这构成了前药（前药形式的活性低）的两 种主要成分之一。
[0024] 图8A-8C提供按照本公开内容制备的二聚体的活性。图8A表示IGF-1单链二聚 体的结构，其包含通过B链氨基端侧链之间的二硫键连接在一起的2个单链IGF B16B17类似物 肽（IGF-1B 链[C°H5Y16L17022]-A 链[09'14'15N18,21] ;SEQ ID N0: 54)。未显示天然胰岛素二硫 键仏641147-8 7、，-819)，但在二聚体形式中存在。可通过选择性蛋白水解消化用箭头标示 的2个Arg-Gly (B29 A1)键，将二硫化物二聚体的单链形式转化成两链形式。图8B是表 明胰岛素、单链IGFB16B17类似物肽二聚体和两链IGF B16B17类似物肽二聚体的相对胰岛素受体 结合的曲线图。图8C是表明胰岛素和两链IGFB16B17类似物肽二聚体诱导胰岛素受体磷酸化 的相对活性的曲线图。
[0025] 图9八_9(：显示16?八链肽的前药形式：（16?认仏1&) 6'7'11'2°酰胺的（?順24) 19上的 Aib-Pro的降解。使二肽在PBS (pH 7. 4)中于37°C孵育预定长度的时间。在开始孵育后 20分钟（图9A)、81分钟（图9B)和120分钟（图9C)取出等分试样，用0· 1% TFA猝灭，通 过分析型 HPLC 测试。a 峰 aGFlAMlapAn'^pM^-F)1 酰胺）和b 峰（IGFlA(Ala)6'7'n'2°(A ib-Pro-pNH-F) 19酰胺）用LC-MS鉴定，并通过峰面积的积分量化。数据表明IGFlA(Ala)6'7' n'20 (Aib-Pro-pNH-F)19酰胺随时间的推移自发非酶促地转化成IGF1A (Ala)6'7'n'20 (pNH2-F)1 酰胺。
[0026] 图10A和10B是描述前药Aib，dPro-IGFlYL (通过A19 4-氨基Phe连接的二肽） 的体外活性的曲线图。图10A是比较在PBS中孵育的天然胰岛素（在4°C下在1小时时测 量）和A19 IGF前药衍生物（Aib, dPro-IGFlYL)随时间推移（0小时、2. 5小时和10. 6小 时）的相对胰岛素受体结合的曲线图。图10B是比较在20%血浆/PBS中于37°C下孵育的天 然胰岛素和A19 IGF前药衍生物（Aib，dPro-IGFlYL)随时间推移（0小时、1. 5小时和24. 8 小时）的相对胰岛素受体结合的曲线图。如图中提供的数据表明，随着前药形式转化成活 性IGF1YL肽，从A19 IGF前药衍生物样品恢复的活性提高。
[0027] 图11A和11B是描述前药dK，（N-异丁基G) -IGF1YL (通过A19 4-氨基Phe连接 的二肽）的体外活性的曲线图。图11A是比较在PBS中孵育的天然胰岛素和A19 IGF前药 衍生物（IGF1YL :dK，（N-异丁基G)随时间推移（0小时、5小时和52小时）的相对胰岛素受 体结合的曲线图。图11B是比较在20%血浆/PBS中于37°C孵育的天然胰岛素和A19 IGF 前药衍生物（IGF1YL :dK，（N-异丁基G)随时间推移（0小时、3. 6小时和24. 8小时）的相对 胰岛素受体结合的曲线图。如图中提供的数据表明，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽， 从A19 IGF前药衍生物样品恢复的活性提高。
[0028] 图12A和12B是描述前药dK (e-乙酰基），Sar) -IGF1YL (通过A19 4-氨基Phe 连接的二肽）的体外活性的曲线图。图12A是比较在PBS中孵育的天然胰岛素（在4°C下 在1小时时测量）和A19 IGF前药衍生物（IGF1YL :dK(e-乙酰基），Sar)随时间推移（0小 时、7. 2小时和91. 6小时）的相对胰岛素受体结合的曲线图。图12B是比较在20%血浆/ PBS中于37°C孵育的天然胰岛素和A19 IGF前药衍生物（IGF1YL :dK(e-乙酰基），Sar)随 时间推移（〇小时、9小时和95小时）的相对胰岛素受体结合的曲线图。如图中提供的数据 表明，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽，从A19 IGF前药衍生物样品恢复的活性提高。
[0029] 图13是比较天然胰岛素异源双链和IGF-1 A和B链异源双链和其中B链的羧基 端与IGF-1 A链的N端直接连接的单链IGF-1类似物的相对胰岛素受体结合的曲线图。
[0030] 图14是比较天然胰岛素异源双链、IGF-UIGF-1 δ异源双链和单链IGF-1 δ单链 类似物（其中Β链的羧基端通过由序列GYGSSSOR (SEQ ID Ν0: 35)组成的肽接头与IGF-1 A链的N端连接）的相对胰岛素受体结合的曲线图，其中IGF-1 δ类似物包含具有下列氨基 酸取代的天然 IGF-1 序列：HA8、0A9、0A14、0A15、QA17、NA21、YB16、LB17、0B22。
[0031] 图15是描述单链胰岛素类似物对IGF-1受体或者A或B亚型胰岛素受体的相对 体外结合活性的柱状图，在单链胰岛素类似物中，天然胰岛素 B链的羧基端通过IGF-1 C肽 或IGF-1 C肽的各种衍生物与天然胰岛素 A链的氨基端连接。在BW胰岛素类似物命名 中，B°和A°命名是指A和B链的胰岛素序列，而C1指IGF-1 C肽。如数据所示，通过IGF-1 C肽连接B链与A链的单链胰岛素类似物是强力的胰岛素激动剂。此外，2位的修饰（例如 用丙氨酸取代天然酪氨酸），或备选地缺失IGF-1 C连接肽的最后4个氨基酸，产生高效能 的胰岛素选择性单链胰岛素类似物。
[0032] 图16是描述式的单链胰岛素类似物对IGF-1受体或者A或B亚型胰岛素 受体的相对体外结合活性的柱状图，在单链胰岛素类似物中，连接IGF-1 C肽的天然序列通 过1、2、3、4或8位的所示氨基酸取代而被修饰。在BW胰岛素类似物命名中，B°和A°标 识是指A和B链的胰岛素序列，而C 1表示IGF-1 C肽。
[0033] 图17是大肠杆菌佐cWi)中单链胰岛素类似物的生物合成和在变性条件下纯 化的示意图。在实施例15中提供了该程序的详情。
[0034] 图 18A-18C 是单链胰岛素类似物 DP20 (GEEEEEKGPEHLCGAHLVDALYLVCGDRGFYSSSS RAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVDECCHRSCDLRRLENYCN;SEQ IDN0: 68)和DP19 (MGSSSSKA PPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQGEEEEEKGPEHLCGAHLVDALYLVCGDRGFYGYGSSSRRAPQTGIVDECCHRSCD LRRLENYCN;SEQ ID N0: 67)对胰岛素亚型A和B受体和IGF受体的活性的曲线图。图18A 和18B是显示单链胰岛素类似物对胰岛素亚型A受体（图18A)和胰岛素亚型B受体（图 18B)的体外磷酸化活性的曲线图。相对于两链天然胰岛素（)，所测试的单链胰岛素类 似物包含CTP肽作为连接肽（DP20 ;·) ;CTP肽（SEQ ID N0: 64)用作连接肽，其中单链类 似物在CTP的赖氨酸处切割产生两链胰岛素（DP20 Lys (：;▲) ;CTP肽（SEQ ID N0: 64) 位于N端并用作连接肽（DP22 ;▽)，其中单链类似物在CTP的赖氨酸处切割产生两链胰岛 素（DP20 Lys C;0)。DP19 (CTP-GE5K-B 链-C1 肽-A 链）和 DP20 (GE5K-B 链-CTP(K)-A 链 的全长序列分别以SEQ ID N0: 67和SEQ ID N0: 68提供。图18C显示单链类似物对IGF 受体的体外磷酸化活性出乎意料的低（低于天然胰岛素），其中单链类似物切割成两链类 似物显著提高其对IGF受体的活性。因此与DP20的两链形式相比，单链类似物（DP20)对 胰岛素受体比对IGF受体具有更高的选择性。
[0035] 图19A-19C是显示正常小鼠中DP19 (图19B)和DP20 (图19C)相对于天然胰岛 素（图19A)的比较胰岛素剂量滴定的曲线图。以27或90 nmol/kg给予胰岛素和胰岛素 类似物。
[0036] 图20A和20B是显示包含以下肽的单链胰岛素类似物相对于两链天然胰岛素 ()肽和天然IGF (〇）的体外磷酸化活性的曲线图：CTP肽作为连接肽（DP20 ;·); CTP肽作为连接肽，其中丝氨酸被丙氨酸置换（DP20 S2A (SEQ ID N0: 80) ;▽) ;CTP肽 作为连接肽，其中氨基酸含量保持相同但序列随机排列（DP20R CTP;?，其中连接肽为 PPRPPQSASPPDLSPLSGTPSRPSLS;SEQ ID N0: 69);以及天然胰岛素原 C肽作为连接肽（DP20 C° (SEQ ID N0: 76) ;▲)〇测试了各肽对胰岛素 A亚型受体和胰岛素 B亚型受体两者的活 性。如数据所示，相对于天然胰岛素原或IGF肽，使用CTP肽或该序列的修饰衍生物的单链 胰岛素类似物产生对两种胰岛素受体亚型的强效胰岛素激动剂。
[0037] 图21是显示单链胰岛素类似物对胰岛素亚型A受体的体外磷酸化活性的曲线图。 包含以下肽的单链类似物相对于两链天然胰岛素（)和天然IGF (▽)的活性：CTP肽作 为连接肽，其中脯氨酸被丙氨酸置换（DP20 P至A (SEQ ID N0: 70) ;·);天然胰岛素原C 肽用作连接肽（〇?20(：°彼0 1〇勵：71);赢）；天然16?-1(：肽用作连接肽（即010 :彼0 ID N0: 72) ;?) ;CTP肽（SEQ ID N0: 64)用作连接肽，其中单链类似物在CTP的赖氨酸处切 割产生两链胰岛素（DP20 Lys C;〇）。如数据所示，使用其中脯氨酸残基被丙氨酸置换的 CTP肽的单链胰岛素类似物作为胰岛素激动剂相对于天然胰岛素原肽保持对胰岛素受体的 活性。DP20单链类似物因 Lys C的切割产生在B链羧基端带有CTP肽的两链胰岛素，其具 有类似于天然胰岛素的效能。
[0038] 图22A和22B是显示包含CTP肽作为连接肽的单链胰岛素类似物的体外磷酸化活 性的曲线图。图22A是比较包含以下肽的单链类似物相对于两链天然胰岛素（)肽和天 然IGF (〇）的活性的曲线图：与天然胰岛素原C肽连接的CTP肽作为连接肽（DP20 CTPC° (SEQ ID NO: 73) ;·);与CTP肽连接的天然胰岛素原C肽作为连接肽（DP20 C°CTP (SEQ ID NO: 74) ;V)。图22B是比较包含以下肽的单链类似物相对于两链天然胰岛素（) 肽和天然IGF (〇）的曲线图：与CTP肽连接的天然胰岛素原C肽作为连接肽（DP20 C°CTP (SEQ ID NO: 74) ;·) ;2个we-尾连接的CTP肽作为连接肽（DP2〇 2CTP (SEQ ID NO: 75); ▽)。
[0039] 图23是显示包含截短天然胰岛素原C肽作为连接肽的单链胰岛素类似物对胰岛 素亚型A受体的体外磷酸化活性的曲线图。显示了包含以下修饰的单链胰岛素类似物相对 于两链天然胰岛素（)肽和具有CTP作为连接肽的胰岛素类似物（?) (DP20)的活性：脱 去头6个氨基酸的天然胰岛素原C肽（DP20 C° (desCl-6) (SEQ ID N0: 76) ;·)，脱去氨 基酸 15-21 (DP20 C。（desC15-21) (SEQ ID NO: 77) ;▲)，或脱去氨基酸 27-33 (DP20 C〇 (desC27-33) (SEQ ID NO: 78) ；V)D
[0040] 图24是显示对胰岛素亚型A和B受体（IRA和IRB)的体外磷酸化活性的曲线图， 比较了 DP20的衍生物（DP25M ;修饰成更为胰岛素样）与胰岛素和DP20的活性。
[0041] 图25A-2?是显示小鼠中进行的比较胰岛素耐量试验的结果的曲线图，其比较人 胰岛素相对于3种不同的酰化胰岛素类似物降低和保持低血糖浓度的能力。测试了 2种不 同浓度的化合物（27 nmol/kg和90nmol/kg)。酰化胰岛素包括MIU-4UMIU-36和MIU-37。 MIU-41 [B1 (H5, H10, Y16, L17) 25a: A1 (H8, rEC16-K14, N18, N21)]是两链胰岛素类似物，具有 通过与位于A14位的赖氨酸残基连接的γ谷氨酸接头的C16酰化。MIU-36 [ΒΥαθ-ΚΟ,Η 5, Η10, Υ16, L17) 258^1 (Ν18, Ν21)]是两链胰岛素类似物，具有与Β链的Ν端连接的C16酰 化。MIU-37 [B1 (H5, H10, Y16, L17, C16rE-K22) 253^1 (N18, N21)]是两链胰岛素类似物，具 有通过与位于B22位的赖氨酸残基连接的γ谷氨酸接头的C16酰化。
[0042] 图26A-26D显示对小鼠进行的比较胰岛素耐量试验的结果，其比较市售酰化胰岛 素类似物（Detemir)相对于酰化两链胰岛素类似物MIU-55的活性。MIU-55 [ΒΥΗδ,ΙΟ,ΥΙ 6, L17, C16rE-K22) 258^1 (Ν18, Ν21)]的Β链C端5个氨基酸缺失且以Β链酰胺作为末端。 其在Lys B22的ε -氨基处通过YGlu接头被C16脂肪酸酰化。结果表明，MIU-55的效能 约为Detemir的1/3 (参见图26A和26B)。数据还表明，胰岛素的酰化形式比非酰化形式 较长时间地起作用，并且虽然MIU-55的效能比Detemir低，但是具有与Detemir类似的概 况（profile)。图26C和26D提供在给予所列举的类似物后有关血糖AUC值的数据。
[0043] 图27A-27D显示对小鼠进行的比较胰岛素耐量试验的结果，其比较市售酰化胰岛 素类似物（Detemir)相对于酰化两链胰岛素类似物MIU-49的活性。MIU-49政((：16-吐，!1 5, Aib9, Η10, Ε13-Κ17, Υ16) 25a: A1 (Ν18, Ν21)]是两链胰岛素激动剂，其Β链的C端5个氨基 酸缺失，且在Gly B2的α-氨基处通过YGlu接头被C16脂肪酸酰化。结果表明，MIU-49 的效能约为Detemir的1/3 (参见27A和27B)。数据还表明，胰岛素的酰化形式比非酰化 形式较长时间地起作用，并且虽然MIU-49的效能比Detemir低，但是具有与Detemir类似 的概况。图27C和27D提供在给予所列举的类似物后有关血糖AUC值的数据。
[0044] 图28A-28D表示使用C57/Blk小鼠从对Detemir和MIU-56的比较胰岛素耐量 试验中得到的结果。MIU-56是胰岛素单链类似物Β 1 (H5，Y16, L17) ZSa-PEGS-K-PEGfA1 ( N18,21)，其包含与连接A链和B链的连接部分（PEG8-K-PEG4)中的单一赖氨酸残基侧链连 接的20 kDa PEG。图28A和28B是显示胰岛素耐量试验结果的曲线图，其比较酰化胰岛素 类似物Detemir相对于聚乙二醇化单链胰岛素类似物MIU-56降低和保持低血糖水平的能 力。图28C和28D分别表示给予Detemir和MIU-56的小鼠中的血糖AUC 24小时。
[0045] 图29A-29F表示使用C57/Blk小鼠从对MIU-56和MIU-57的比较胰岛素耐量试验 中获得的结果。MIU-57是胰岛素单链类似物（Β1 (H5, Y16, L17) 25-(:1^1 (N18, 21)，其包含与 B链N端连接的20 kDa PEG。图29A和29B是表示比较MIU-56和MIU-57的胰岛素耐量试 验结果的曲线图。图29C和29D表示分别给予MIU-56和MIU-57的小鼠中的血糖AUC 24/> 时。MIU-56和MIU-57的比较胰岛素剂量滴定结果显示对于20 nmol/kg-80 nmol/kg的剂 量范围在小鼠中获得类似概况（参见图29E和29F)。制备二聚体（MIU 58)，其包含通过20 kDa PEG链而头-头连接的两个胰岛素单链类似物（ΒΥΗδ,ΥΙΘ,?Π ) 21)。图 29G-29J表示使用C57/Blk小鼠由MIU-57和MIU-58的比较胰岛素耐量试验获得的结果。 图29G和29H是比较MIU-57和MIU-58的胰岛素耐量试验结果的曲线图。图291和29J分 别表示给予MIU-57和MIU-58的小鼠中的血糖AUC 24小时。
[0046] 图30A和30B提供来自两种聚乙二醇化胰岛素衍生物的比较胰岛素剂量滴定的数 据。胰岛素衍生物根据20 kDa PEG的位置而不同，所述20 kDa PEG与MIU-59的N端（图 35A)或胰岛素类似物MIU-60的氨基酸B29的侧链连接，其中A1和B1氨基酸被氨基甲酰化 (图 30B)。
[0047] 图31A-31D提供来自3种单链胰岛素类似物MIU-67、MIU-68和MIU-69的比较胰 岛素剂量滴定的数据，每种单链胰岛素类似物相对于单一聚乙二醇化（20K PEG)天然胰岛 素衍生物（MIU-59)各包含10 kDa的2条PEG链。更具体地讲，对以下单链胰岛素类似物的 活性进行了 比较：MIU-67 (B1 (H5, Y16, L17) 25-C1 (K8) -A1 (N18, 21))，其具有 2 条 PEG 链（各 10K)，一条在N端连接，另一条在连接部分的氨基酸8 (C8位）连接；MIU-68 (B1 (H5, Y16， L17, K22) 25-C1 (K8) -A1 (N18, 21))，其具有 2 条 PEG 链（各 10K)，一条在 N 端连接，另一条在 氨基酸 B22 连接；和 MIU-69 (B1 (H5, Y16, L17) 25-C1 (K8) -A1 (K14, N18, 21))，其具有 2 条 PEG 链（各10K)，一条在N端连接，另一条在氨基酸A14连接。以两种剂量（20和80 nmol/kg) 给予每种化合物。
[0048] 图32A和32B.给予糖尿病小鼠（db/db小鼠）聚乙二醇化胰岛素类似物以比较其 相对于市售胰岛素类似物的相对活性。X轴表示所给予的化合物的浓度（即溶媒对照，优泌 林（Humulin)为 30 或 90 nmol/kg 或 60 nmol/kg，Levemir 为 30、90 和 240)。具体地讲， 对胰岛素类似物Levemir和优泌林与聚乙二醇化胰岛素类似物MIU-59 (具有与其N端连 接的单个20 kDa PEG的天然胰岛素类似物）和MIU-66 (具有与其N端连接的单个20 kDa PEG及氨基甲酰化的A和B链氨基端的天然胰岛素类似物）进行比较。与Levemir和优泌 林相比，MIU-59和MIU-66两者的活性改进（参见图32A在12小时，图32B在24小时）。
[0049] 图33是在正常小鼠中进行的针对在二肽前药元件被酰化的前药两链胰岛素类似 物（MIU-29 : [B1 (Y16, L17, Y25) 298^1 (aF19-dLys (Ac)，NLeu)]相对于其母体胰岛素类似物 (MIU-27 :^^16^17^25)298^^19-)]的比较胰岛素耐量试验结果的曲线图。前药衍 生物MIU-29包含A19位的4-氨基-苯丙氨酸取代，其中二肽dLys (Ac)，NLeu在A19残基 的4-氨基位处共价连接，且二肽元件的赖氨酸侧链被C14脂肪酸酰化。这种二肽可在生理 条件下自主切割，其半衰期为约5小时。在离体孵育MIU-29 24小时后，将所得化合物（称 为"MIU-29C"）给予小鼠，并对其降低血糖的能力与母体化合物相比较。如图33所示，两种 化合物的性能几乎相同。
[0050] 发明详述 定义 在描述和要求保护本发明时，可根据下文给出的定义使用下列术语。
[0051] 本文所用术语"约"意指大于或小于所述值或值范围达10%，但无意将任何值或值 范围仅指定在这个较宽泛的定义内。前面有术语"约"的各个值或值范围也欲包括所述绝 对值或值范围的实施方案。
[0052] 本文所用术语"前药"定义为在显示其药理作用之前经过化学修饰的任何化合物。
[0053] 本文所用术语"氨基酸"包括含有氨基和羧基官能团两者的任何分子，其中氨基和 羧酸基与同一碳（ α碳）连接。α碳任选可具有一个或两个其它的有机取代基。对于本 公开内容的目的，未指定其立体化学的氨基酸的命名欲包括氨基酸的L型或D型或外消旋 混合物。然而，在其中氨基酸用其三字母代码表示且包括上标数字的情况下，通过在三字母 代码和上标数字之前包括小写d来指定氨基酸的D型（例如dLys，，其中没有小写d的命 名（例如LyiT 1)意指氨基酸的天然L型。在该命名中，包括上标数字表示氨基酸在胰岛素 类似物序列中的位置，其中位于胰岛素类似物序列中的氨基酸通过自N端连续编号的正的 上标数字来表示。在N端或通过侧链与胰岛素类似物肽连接的其它氨基酸以0开始编号， 且当它们进一步远离胰岛素类似物序列时，以负的整数值递增。例如，与胰岛素类似物的N 端连接的二肽前药内的氨基酸位置称为af-a'-胰岛素类似物，其中aa°表示二肽的羧基 端氨基酸，aa_1表示二肽的氨基端氨基酸。
[0054] 本文所用术语"羟酸"是指经修饰用羟基置换α碳氨基的氨基酸。
[0055] 本文所用术语"非编码氨基酸"包括不是以下20种氨基酸任一个的L-异构体的任 何氨基酸：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、 Thr、Val、Trp、Tyr〇
[0056] "二肽"是α氨基酸或α羟酸通过肽键与另一氨基酸连接所形成的化合物。
[0057] 没有任何其它指定的本文所用术语"化学切割"包括导致共价化学键断裂的非酶 促反应。
[0058] "生物活性多肽"是指能够在体外和/或体内发挥生物作用的多肽。
[0059] 如本文所用，一般提及肽时意在包括具有经修饰的氨基端和羧基端的肽。例如，标 明标准氨基酸的氨基酸序列意在包括N端和C端的标准氨基酸以及N端的相应羟酸和/或 经修饰以包含酰胺基代替末端羧酸的相应C端氨基酸。
[0060] 本文所用"酰化"氨基酸是包含酰基的氨基酸，其对天然存在的氨基酸而言是非天 然的，而不论通过哪种方式产生。产生酰化氨基酸和酰化肽的示例性方法是本领域已知的， 包括在加入肽中之前使氨基酸酰化或肽合成之后进行肽的化学酰化。在一些实施方案中， 酰基使肽具有以下的一种或多种：α)循环中的半衰期延长，αυ作用起始延迟，aii)作 用持续时间延长，（iv)对蛋白酶的抗性改进，和（V)对IGF和/或胰岛素肽受体的效能提 商。
[0061] 本文所用"烷基化"氨基酸是包含烷基的氨基酸，其对天然存在的氨基酸而言是非 天然的，而不论通过哪种方式产生。产生烷基化氨基酸和烷基化肽的示例性方法是本领域 已知的，包括在加入肽中之前使氨基酸烷基化或肽合成之后进行肽的化学烷基化。虽不限 于任何特定理论，但认为肽的烷基化可实现与肽的酰化类似（如果不是相同的话）的作用， 例如循环中的半衰期延长，作用起始延迟，作用持续时间延长，对蛋白酶的抗性改进，以及 对IGF和/或膜岛素受:体的效能提商。
[0062] 本文所用术语"药学上可接受的载体"包括任何标准药用载体，例如磷酸缓冲盐溶 液、水、乳液例如水包油或油包水乳液和各种类型的润湿剂。该术语还包括美国联邦政府监 管机构批准的或列于美国药典的用于动物（包括人）的任何药剂。
[0063] 本文所用术语"药学上可接受的盐"是指保持母体化合物的生物活性并且不是生 物学或其它方面不合乎需要的化合物的盐。本文公开的许多化合物能够通过存在的氨基和 /或羧基或其类似基团形成酸式盐和/或碱式盐。
[0064] 药学上可接受的碱加成盐可由无机碱和有机碱制备。仅举例来说，衍生自无机碱 的盐包括钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐。 [0065] 药学上可接受的酸加成盐可由无机酸和有机酸制备。衍生自无机酸的盐包括盐 酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。衍生自有机酸的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、 苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、 乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
[0066] 本文所用术语"亲水部分"是指易溶于水或易吸收水且哺乳动物物种体内耐 受而又无毒性作用（即是生物相容的）的任何化合物。亲水部分的实例包括聚乙二醇 (PEG)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉 (polymethoxazoline)、聚乙基卩惡唑啉（polyethoxazoline)、聚甲基丙烯酸轻乙基酯、聚轻 丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺和衍生化纤维素例如羟甲基纤维 素或羟乙基纤维素及其共聚物以及天然聚合物，包括例如白蛋白、肝素和葡聚糖。
[0067] 本文所用术语"治疗"包括预防特定病症或病况，或减轻与特定病症或病况有关的 症状和/或防止或消除所述症状。例如，本文所用术语"治疗糖尿病" 一般可指保持血糖水 平接近正常水平，并且根据指定情形可包括提高或降低血糖水平。
[0068] 本文所用胰岛素类似物的"有效"量或"治疗有效量"是指无毒但足以提供所需作 用的胰岛素类似物的量。例如一种所需效果将会是预防或治疗高血糖症。"有效"的量在受 试者与受试者间可不同，这取决于个体的年龄和一般状况、给药方式等。因此，不可能总是 指定确切的"有效量"。然而，在任何个别情况下，适当的"有效"量可通过本领域普通技术 人员采用常规实验来确定。
[0069] 术语"胃肠外"意指不通过消化道而是通过某些其它途径，例如鼻内、吸入、皮下、 肌内、脊柱内或静脉内。
[0070] 在整个申请中，所有用字母和数字对具体氨基酸位置的提及（例如A5位）是指在 相应的天然人胰岛素 A链（SEQ ID NO: 1)或B链（SEQ ID N0: 2)的A链（例如A5位） 或B链（例如B5位）中该位置上的氨基酸，或者在其任何类似物的相应氨基酸位置上的氨 基酸。例如，本文在没有任何其它说明的情况下提及"B28位"可意指其中SEQ ID N0: 2的 第1个氨基酸缺失的胰岛素类似物B链的相应的B27位。同样，添加到天然B链N端的氨 基酸以B0开始编号，然后随着氨基酸添加到N端，为递增负值的数字（例如B-l，B-2…）。
[0071] 本文所用术语"天然胰岛素肽"旨在指明包含SEQ ID NO: 1的A链和SEQ ID N0: 2的B链的51个氨基酸异源双链以及包含SEQ ID NO: 1和2的单链胰岛素类似物。本文 所用的没有更多说明性语言的术语"胰岛素肽"欲包括包含SEQ ID NO: 1的A链和SEQ ID NO: 2的B链的51个氨基酸异源双链及其单链胰岛素类似物（包括例如已公布的国际申 请TO96/34882和美国专利号6, 630, 348中公开的类似物，其公开内容通过引用结合到本文 中），包括包含天然A链和/或B链的修饰类似物的异源双链和单链类似物及其衍生物。这 类修饰类似物包括:A19、B16或B25位的氨基酸变为4-氨基苯丙氨酸的修饰，或者选自以 下位置的一个或多个氨基酸取代：A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、 B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29 和 B30,或者 B1-4 和 Β26-30位的任一个或全部缺失。本文定义的胰岛素肽还可以是通过非肽部分（例如逆倒位 片段（retroinverso fragment))的插入或取代，或者掺入非肽键例如氮杂肽键（C0被ΝΗ取 代）或假肽键（例如NH被CH2取代）或酯键（例如缩肽，其中一个或多个酰胺（-C0NHR-) 键被酯（C00R)键置换）而衍生自天然存在的胰岛素的类似物。
[0072] "A19胰岛素类似物"是4-氨基苯丙氨酸或4-甲氧基苯丙氨酸取代天然胰岛素 A 链19位的天然酪氨酸残基的胰岛素肽。
[0073] 本文所用"IGFB16B17类似物肽"是包含A链和B链异源双链及其单链胰岛素类似物 的通用术语，其中A链包含SEQ ID N0: 15的肽序列，B链包含SEQ ID N0: 17的序列，以 及其中A链和/或B链的类似物包含1-3个其它氨基酸取代的序列的类似物，前提条件是 B链不含SEQ ID N0: 2的序列，并包含B16位的酪氨酸和B17位的亮氨酸。
[0074] "IGF YL 类似物"是包含 SEQ ID N0: 15 的 IGF A 链和 SEQ ID N0: 28 的 IGF B 链的肽。
[0075] 本文所用术语"单链胰岛素类似物"包括一组结构上相关的蛋白质，其中胰岛素或 IGFA和B链或其类似物或衍生物彼此共价连接形成线性多肽链。如本文所公开的，单链胰 岛素类似物包含B链的羧基端通过连接部分与A链的氨基端共价连接。
[0076] 本文所用的没有更多说明性语言的术语"胰岛素 A链"欲包括SEQ ID NO: 1的21 个氨基酸序列及其当与胰岛素 B链组合时对胰岛素受体具有活性的功能类似物和衍生物。 例如，功能类似物和衍生物包括A19胰岛素类似物的A链和本领域技术人员已知的其它类 似物，其包括通过在选自以下位置的一个或多个氨基酸插入、缺失或取代而产生的SEQ ID NO: 1 序列的修饰：A4、A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21。
[0077] 本文所用的没有更多说明性语言的术语"胰岛素 B链"欲包括SEQ ID NO: 2的30 个氨基酸序列以及当与胰岛素 A链组合时对胰岛素受体具有活性的天然B链的修饰功能类 似物。例如，功能类似物和衍生物，其包括B16或B25位的氨基酸变为4-氨基苯丙氨酸的 修饰，或者在选自以下位置的一个或多个氨基酸插入、缺失或取代：B1、B2、B3、B4、B5、B9、 B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B25、B26、B27、B28、B29 和 B30,或者 B1-4 和 B26-30 位的任一个或全部缺失。
[0078] "糖基化位点"表示多肽中进行糖基化（即糖结构连接）的任何氨基酸残基或区 域。所述位点通常为N-糖基化位点（即多肽中允许糖结构通过N键合连接的任何氨基酸 残基或区域）或〇-糖基化位点（即多肽中允许糖结构通过〇-键合连接的任何氨基酸残基 或区域）。
[0079] 本文所用"非天然糖基化位点"是不存在于天然肽中的糖基化位点。具体而言，肽 的天然序列经过修饰以将糖基化位点引入之前没有此位点的位置上，或将额外的氨基酸添 加到天然肽中，其中所添加的序列与天然序列一起引入糖基化位点或所添加的氨基酸包含 糖基化位点。
[0080] 本文所用术语"高糖基化肽"是指包含两个或更多个已被糖基化的非天然糖基化 位点的氨基酸序列。高糖基化肽的糖基化位点可包括N-联糖基化位点和/或0-联糖基化 位点。
[0081] 本文所用的 CTP 肽是包含序列 SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR (SEQ ID N0: 64)的氨基酸序列、包含SEQ ID NO: 64的18-28个氨基酸片段的序列或包含与（SEQ ID NO: 64)的18-29氨基酸序列有至少50%序列同一性的18-29氨基酸序列的序列，前提条件 是CTP肽不含与包含在天然胰岛素原C肽（SEQ ID N0: 53)内的18个氨基酸序列相同的 18个氨基酸序列。
[0082] 本文所用术语"衍生物"欲包括对化合物（例如氨基酸）的化学修饰，包括体外化 学修饰，例如通过在多肽的一个或多个位置的侧链上引入基团，例如酪氨酸残基中的硝基 或酪氨酸残基中的碘，或通过游离羧基转化为酯基或转化为酰胺基，或通过酰化使氨基转 化为酰胺，或通过使羟基酰化得到酯，或通过使伯胺烷基化得到仲胺或亲水部分与氨基酸 侧链连接。通过多肽中的氨基酸残基侧链的氧化或还原获得其它衍生物。
[0083] 本文所用的没有更多说明性语言的术语IGF A链欲包括天然IGF 1或IGF 2 (分 别为SEQ ID N0: 5和7)的21个氨基酸序列及其本领域技术人员已知的功能类似物，包括 SEQ ID N0: 5和7的序列通过在选自以下位置上的一个或多个氨基酸取代而产生的修饰： A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21。
[0084] 本文所用的没有更多说明性语言的术语"IGF YL B链"欲包括包含SEQ ID NO: 17 的氨基酸序列，包括例如SEQ ID NO: 6的序列以及IGF YL B链的类似物及其衍生物，包括 B16或B25位的氨基酸变为4-氨基苯丙氨酸的修饰，或者在选自以下位置的一个或多个氨 基酸取代：B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29 和B30,或者B1-4和B26-30位的任一个或全部缺失。
[0085] 本文所用术语"同一性"涉及两个或更多个序列间的相似性。将相同残基的数目 除以残基总数，将结果乘以1〇〇得到百分比而求出同一性。因此，两个完全相同的序列拷 贝具有100%同一性，而彼此相比较具有氨基酸缺失、添加或取代的两个序列具有较低程度 的同一性。本领域技术人员将认识到，可获得若干计算机程序用于确定序列同一性，例如 应用算法例如BLAST (基础局部比对搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool), Altschul 等（1993) J. Mol. Biol. 215:403-410)的计算机程序。
[0086] 本文所用术语分子对第一受体较之于对第二受体的"选择性"是指以下比率：分子 对第二受体的EC 5(I除以分子对第一受体的EC5(I。例如，对第一受体的EC5(I为1 nM而对第二 受体的EC5(I为100 nM的分子对第一受体的选择性是对第二受体的选择性的100倍。
[0087] 本文所用氨基酸"修饰"是指氨基酸的取代或者通过化学基团加至氨基酸和/或 从氨基酸中脱去化学基团而引起的氨基酸的衍生化，包括被通常存在于人蛋白质中的20 种氨基酸的任一个以及非典型或非天然存在的氨基酸取代。非典型氨基酸的市售来源包括 Sigma-Aldrich (Milwaukee,WI)、ChemPep Inc. (Miami,FL)和Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge，MA)。非典型氨基酸可购自商品供应商、从头合成或对天然存在的氨基酸进行 化学修饰或衍生化。
[0088] 本文所用氨基酸"取代"是指一个氨基酸残基被不同的氨基酸残基置换。
[0089] 本文所用术语"保守氨基酸取代"在本文定义为下列5组之一内的交换： I. 小的脂族无极性或略带极性的残基： Ala、Ser、Thr、Pro、Gly ; II. 极性带负电荷的残基及其酰胺： Asp、Asn、Glu、Gin、半胱磺酸和高半胱磺酸； III. 极性带正电荷的残基： His、Arg、Lys ;鸟氨酸（Orn) IV. 大的脂族无极性残基： Met、Leu、lie、Val、Cys、正亮氨酸（Nle)、高半胱氨酸 V. 大的芳族无极性残基： Phe、Tyr、Trp、乙酰基苯丙氨酸 本文所用通用术语"聚乙二醇链"或"PEG链"是指环氧乙烷和水的缩合聚合物的混合 物，呈支链或直链，用通式H(0CH2CH2)n0H表示，其中η至少为2。"聚乙二醇链"或"PEG链"与 数字后缀联用，表明其大致的平均分子量。例如PEG-5, 000是指总的分子量平均为约5, 000 道尔顿的聚乙二醇链。
[0090] 本文所用术语"聚乙二醇化"等术语是指通过将聚乙二醇链与化合物连接对其天 然状态进行修饰的化合物。"聚乙二醇化多肽"是具有与多肽共价连接的PEG链的多肽。
[0091] 本文所用"接头"是使两个分开的实体彼此结合的键、分子或分子的基团。接头可 为两个实体提供最佳间隔或可进一步提供允许两个实体彼此分开的不稳定连接。不稳定连 接包括光可切割基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分和酶可切割基团。
[0092] 本文所用"IGF二聚体"是包含两个通过接头彼此共价结合的IGF YL类似物肽（每 个自身包含A链和B链）的复合体。当在没有任何限定性语言的情况下使用时，术语IGF 二聚体包括IGF同二聚体和IGF异二聚体两者。IGF同二聚体包含两个相同的亚基，而IGF 异二聚体包含两个不同的亚基，但是两个亚基彼此基本上相似。
[0093] 本文所用术语"Q-C；烷基"，其中η可为1-6,表示具有1至规定数目的碳原子的支 链或直链烧基。典型的Ci-C 6烧基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、 仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。
[0094] 本文所用术语"C2_Cn烯基"，其中η可为2-6,表示具有2至规定数目的碳原子和至 少一个双键的烯属不饱和支链或直链基团。这类基团的实例包括但不限于1-丙烯基、2-丙 烯基（-ch 2-ch=ch2)、1，3- 丁二烯基（_CH=CHCH=CH2)、1- 丁烯基（_CH=CHCH2CH3)、己烯基、戊 稀基等。
[0095] 术语"c2-cn炔基"，其中η可为2-6,是指具有2-n个碳原子和至少一个三键的不饱 和支链或直链基团。这类基团的实例包括但不限于1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁 炔基、1-戊炔基等。
[0096] 本文所用术语"芳基"是指具有一个或两个芳族环的单环或二环碳环系统，包括但 不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。通过标明碳存在的数目来表示芳环的大小和 取代基或连接基团的存在情况。例如，术语"（Ci-Q烷基）（C 6-C1(l芳基）"是指通过1-3元 烷基链与母体部分连接的5-10元芳基。
[0097] 本文所用术语"杂芳基"是指含有一个或两个芳族环且在芳族环中含有至少一个 氮、氧或硫原子的单环或二环环系统。通过标明碳存在的数目来表示杂芳环的大小和取代 基或连接基团的存在情况。例如，术语"（C rCn烷基）（C5_C6杂芳基）"是指通过1- "η"元 烷基链与母体部分连接的5或6元杂芳基。
[0098] 本文所用术语"卤素"是指由氟、氯、溴和碘组成的组的一个或多个成员。
[0099] 本文所用的没有进一步指定的术语"患者"欲包括任何温血脊椎驯养动物（包括 例如但不限于家畜、马、猫、狗和其它宠物）和人。
[0100] 本文所用术语"分离的"意指已从其自然环境中取出。在一些实施方案中，所述类 似物通过重组方法制备，并将类似物从宿主细胞中分离。
[0101] 本文所用术语"纯化的"涉及呈基本上不含通常在天然或自然环境中与分子或化 合物有关的污染物的形式的分子或化合物的分离，并意指由于与原始组合物的其它组分分 离而提高了纯度。本文使用术语"纯化的多肽"用于描述已与其它化合物分离的多肽，其它 化合物包括但不限于核酸分子、脂质和糖。
[0102] "肽模拟物"是指具有不同于既有肽的一般结构的结构、但以类似于既有肽的方式 (例如通过模拟该肽的生物活性）起作用的化合物。肽模拟物通常包含天然存在的氨基酸 和/或非天然的氨基酸，但还可包含对肽骨架的修饰。例如肽模拟物可包括天然存在的氨 基酸的序列，其中具有非肽部分（例如逆倒位片段）插入或取代，或掺入非肽键例如氮杂肽 键（C0被ΝΗ取代）或假肽键（例如ΝΗ被CH 2取代）或酯键（例如缩肽，其中一个或多个 酰胺（-C0NHR-)键被酯（C00R)键置换。或者肽模拟物可不含任何天然存在的氨基酸。
[0103] 本文所用术语"带电荷的氨基酸"或"带电荷的残基"是指包含在生理pH下在水 溶液中带负电荷的（即脱质子化）或带正电荷的（即质子化）的侧链的氨基酸。例如，带 负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱磺酸、高半胱磺酸和高谷氨酸，而带正电荷的 氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电荷的氨基酸包括通常存在于人蛋白质的20种氨 基酸中的带电荷的氨基酸以及非典型或非天然存在的氨基酸。
[0104] 本文所用术语"酸性氨基酸"是指包含第二酸性部分（不是氨基酸的α羧酸）的 氨基酸，第二酸性部分包括例如侧链羧酸基或磺酸基。
[0105] 缩写词： 将如下对胰岛素类似物进行缩写： 可用大写Α表示Α链，用大写Β表示Β链来标明胰岛素 Α和Β链，其中上标0 (例如Α° 或Β°)可表示基础序列是胰岛素序列（Α链：SEQ ID NO: 1，Β链SEQ ID NO: 2)，上标1 (例 如A1或B1)将表明基础序列是IGF-1序列（A链：SEQ ID NO: 5，B链SEQ ID NO: 62)。偏 离天然胰岛素和IGF序列的修饰在A链或B链命名后用括号表示（例如[Β1 (H5, H10, Y16， L17) : A1 (H8, N18, N21)])，其中单字母氨基酸缩写表示取代，数字表示采用天然胰岛素编号 的相应A链或B链中取代的位置。A链或B链间的冒号表示两链胰岛素，而短线将表示共价 键，因此表示单链类似物。在单链类似物中，A链和B链间将包括连接部分，命名C 1是指天 然 IGF 1 C 肽，SEQ ID N0: 13。
[0106] 实施方案 按照一个实施方案，本文提供经过修饰以引入一个或多个糖基化位点的胰岛素类似 物。基于肽的药物的糖基化可赋予基础肽额外益处，包括血清半衰期延长；功能性体内半衰 期延长；降解减少。将糖基化位点引入胰岛素类似物提供了用于将糖部分连接在胰岛素激 动剂上的位置，使得当胰岛素激动剂在能够糖基化的真核细胞产生时，胰岛素激动剂被糖 基化。在一个实施方案中，提供其中肽序列被修饰的胰岛素类似物，所述修饰通过氨基酸的 添加和/或取代以添加天然胰岛素中不存在的新的糖基化位点。在一个实施方案中，糖基 化位点被引入B链的氨基端或羧基端，或在单链类似物的情况下，糖基化位点可被引入单 链类似物的连接肽中。在又一个实施方案中，提供单链类似物，其中至少一个糖基化位点被 引入B链的氨基端和单链类似物的连接部分两者中。
[0107] 申请人:发现，可制备其中连接B链羧基端与A链氨基端的连接部分可大于18个氨 基酸的高效能单链胰岛素类似物，条件是连接部分不具有与B链羧基端直接连接的天然胰 岛素原C肽。根据这个发现，提供包含胰岛素 A链、胰岛素 B链和连接部分的单链胰岛素类 似物，其中连接部分包含至少18个氨基酸，包括例如18-87、29-87或29-58个氨基酸的肽， 其中连接部分共价连接B链的羧基端与A链的氨基端形成连续氨基酸链。更具体地讲，连 接部分不包含天然胰岛素原C肽（SEQ ID N0: 53)的序列或与B链的羧基端直接连接的 SEQ ID N0: 53的连续18、20、25或30个氨基酸片段。在一个实施方案中，提供其中连接部 分包含至少18个氨基酸的序列的单链胰岛素类似物，其中连接部分包含天然胰岛素原C肽 (SEQ ID N0: 53)的连续4、8、16、18、20、25或30个氨基酸片段，前提条件是连接部分还包 含与B链的羧基端连接的至少8、16、18、24或29个氨基酸的非C°肽。本文所用的非C°肽 是与天然胰岛素原C肽（SEQ ID N0: 53)内所包含的序列有小于90%序列同一性和/或不 包含与SEQ ID N0 53内所包含的15个氨基酸序列相同的15个氨基酸序列的任何肽。在 一个实施方案中，非c°肽包含一个或多个N-联和/或0-联糖基化位点。
[0108] 在一个实施方案中，连接部分包含18-145、18-87、29-87或29-58个氨基酸的肽， 其中所述连接部分没有与SEQ ID NO: 53有大于80%序列同一性的至少18个氨基酸的连 续序列。在一些实施方案中，连接部分包括氨基酸残基以外或取代氨基酸残基的其它聚合 物材料，包括例如聚乙二醇。
[0109] 在一个实施方案中，连接部分包含与B链的羧基端氨基酸直接连接的29个连续氨 基酸序列，其中所述29个连续氨基酸序列与SEQ ID N0: 66具有大于60、80或90%序列 同一性，前提条件是该序列不包含与SEQ ID N0 53内所包含的15个氨基酸序列相同的15 个氨基酸序列。在另一个实施方案中，连接部分包含与B链的羧基端氨基酸直接连接的29 个连续氨基酸序列，其中构成29个连续氨基酸序列的氨基酸的至少58%选自丝氨酸和脯氨 酸。
[0110] 在另一个实施方案中，连接部分包含与B链的羧基端氨基酸直接连接的29个连续 氨基酸序列，其中所述29个连续氨基酸序列与SSSSX 5(IAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51 (SEQ ID NO: 66)有大于70%、80%、90%的序列同一性，其中X5Q和X51独立选自精氨酸和赖氨酸， 前提条件是该序列不包含与SEQ ID N0 53内所包含的15个氨基酸序列相同的15个氨基 酸序列。在另一个实施方案中，连接部分包含与B链的羧基端氨基酸直接连接的29个连续 氨基酸序列，其中所述29个连续氨基酸序列是SEQ ID N0: 64的类似物，其中所述类似物 仅以1、2、3、4、5或6个氨基酸修饰（其中所述修饰选自氨基酸取代、缺失或插入）而不同 于SEQ ID N0: 64,在又一个实施方案中，氨基酸修饰是保守氨基酸取代。在另一个实施方 案中，连接部分包含与B链的羧基端氨基酸直接连接的29个连续氨基酸序列，其中所述29 个连续氨基酸序列是（SEQ ID N0: 64)的类似物，其中所述类似物仅以1、2或3个氨基酸 取代而不同于（SEQ ID N0: 64)。
[0111] 糖基化 在新生体内蛋白质产生期间，包含糖基化位点的胰岛素类似物可进行称为翻译后修饰 的进一步加工，其中糖（糖基）残基可在称为糖基化的过程中经酶促添加。所得到的携带 共价连接的寡糖侧链的蛋白质称为糖基化蛋白或糖蛋白。因此，携带糖基化位点的蛋白质 不一定被糖基化。按照一个实施方案，提供已经修饰以包含当在真核表达系统中表达时易 于高糖基化的肽序列的胰岛素激动剂类似物。
[0112] 蛋白质糖基化取决于目标蛋白质的氣基酸序列以及蛋白质在其中表达的宿主细 胞。不同的生物可产生不同的糖基化酶（例如糖基转移酶和糖苷酶），并且具有可得到的不 同底物（核苷酸糖）。由于这些因素，蛋白质糖基化模式和糖基残基的组成，可随特定蛋白 质在其中表达的宿主系统而不同。可用于本发明的糖基残基可包括但不限于葡萄糖、半乳 糖、甘露糖、岩藻糖、η-乙酰氨基葡萄糖和唾液酸。在一个实施方案中，胰岛素类似物包含 糖基残基，使得糖基化模式是人的。
[0113] 本领域技术人员已知，不同的蛋白质糖基化可导致不同的蛋白质特性。例如，与在 哺乳动物细胞（例如CH0细胞系或ΗΕΚ293细胞）中表达的相同蛋白质相比，在微生物宿主 (例如酵母）中产生和利用酵母内源途径而糖基化的治疗性蛋白质的功效可能降低。这类 糖蛋白在人体中还可能是免疫原性的，并显示在给药后体内半衰期缩短。人和其它动物中 的特定受体可识别特定的糖基残基，并促进从血流中快速清除。因此，从业人员可能更喜欢 具有特定糖基化组成和模式的治疗性蛋白质，例如与人细胞或既定受试者动物的物种特异 性细胞中产生的相同或至少类似的糖基化组成和模式。
[0114] 可通过对宿主细胞进行遗传修饰以表达异源糖基化酶来实现不同于宿主细胞的 糖基化蛋白的表达。例如，对酵母株进行遗传修饰以表达非天然存在的糖基化酶，使得这些 酵母株中产生的糖基化蛋白（糖蛋白）显示与动物细胞尤其人细胞中产生的相同的蛋白质 糖基化（参见美国专利申请公布号2004/0018590和2002/0137134,其公开内容通过引用结 合到本文中）。
[0115] 非天然和天然糖基化序列是本领域技术人员已知的，包括N-联糖基化位点和 〇-联糖基化位点。N-联糖基化位点是用作用于酶促连接糖部分与天冬酰胺残基侧链的识 别位点的肽序列。三肽0-联糖基化序列包括天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸， 其中X为脯氨酸以外的任何氨基酸。因此，多肽中存在这些三肽序列的任一个便产生潜在 的糖基化位点。〇-联糖基化是用作用于酶促连接糖部分与羟基氨基酸侧链的识别位点的肽 序列，所述氨基酸最常见为丝氨酸或苏氨酸，但还可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。在一 个实施方案中，〇-联糖基化糖是N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖。多种0-联糖基化位点 是本领域已知的，并在文献中已有报告。参见例如Ten Hagen等（11029) J. Biol. Chem. 274(39):27867-74 ;Hanisch 等（2001) Glycobiology 11:731-740 ;以及 Ten Hagen 等 (2003) Glycobiology 13:lR-16R〇
[0116] 按照一个实施方案，提供产生高糖基化胰岛素类似物的方法。该方法包括：提供包 含编码胰岛素类似物（其已经修饰以包括非天然糖基化位点（例如CTP肽序列））的基因 的真核宿主细胞，并在允许胰岛素类似物基因表达的条件下培养细胞。在一个实施方案中， 宿主细胞表达人糖基化酶，使得宿主细胞中广生的糖基化蛋白（糖蛋白）显不与人细胞的 相同的蛋白质糖基化（参见美国专利申请公布号2004/0018590和2002/0137134，其公开内 容通过引用结合到本文中）。按照一个实施方案，真核宿主细胞选自酵母（例如巴斯德毕赤 酵母paWoris))或哺乳动物（CH0或HEK293)细胞。
[0117] 增加胰岛素类似物上的糖部分的数目的另一种方法是通过使糖苷与胰岛素类似 物进行化学或酶促偶联。这些方法是有优势的，因为它们不需要在具有N-或0-联糖基化 的糖基化能力的宿主细胞中产生胰岛素类似物。根据所用的偶联方式，可将糖与以下连接： (a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；（c)游离巯基，例如半胱氨酸的游离巯基；（d)游离羟 基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的游离羟基；(e)芳族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色 氨酸的芳族残基；或（f)谷氨酰胺的酰胺基。用于使糖苷与肽偶联的方法描述于1987年9 月 11 日公布的 W0 87/05330 和 Aplin 和 Wriston (1981) CRCCrit. Rev. Biochem·，第 259-306页，两者通过引用结合到本文中。
[0118] 按照一个实施方案，提供其中糖基化位点已引入到胰岛素肽中的胰岛素类似物。 可通过氨基酸取代、缺失或添加对天然胰岛素序列进行修饰来添加一个或多个糖基化位 点。在一个实施方案中，胰岛素类似物包含B25-B30氨基酸的一个或多个的修饰，或将肽序 列添加到A链或B链的N端或C端以将一个或多个非天然糖基化位点引入胰岛素类似物 中。在一个实施方案中，提供胰岛素类似物（两链或单链类似物），其中包含糖基化位点的 肽与胰岛素 B链的羧基端连接。在一个实施方案中，提供单链胰岛素类似物，其包含共价连 接胰岛素 B链羧基端与胰岛素 A链氨基端的连接部分，其中连接部分包含大于18个残基的 氨基酸序列并包含一个或多个糖基化位点。在又一个实施方案中，提供包含各含有至少一 个糖基化位点（相同或不同）的两个肽序列的胰岛素类似物。在一个实施方案中，含有糖 基化位点的第一肽序列与B链的N端连接，而含有糖基化位点的第二肽序列与A链或B链 的C端连接。在一个实施方案中，胰岛素类似物是单链类似物，其中连接B链和A链的连接 部分包含第二肽序列。
[0119] 寡糖单元 与高糖基化胰岛素类似物中的特定糖基化位点连接的寡糖单元的结构和数目可以是 可变的。这些可以是例如N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、 岩藻糖、木糖、葡糖醛酸、艾杜糖醛酸和/或唾液酸。在一个实施方案中，高糖基化胰岛素类 似物包含选自以下的非天然N-联和/或0-联糖链 ： a) 哺乳动物型糖链，优选CH0细胞表达的糖链类型； b) 包含复杂的N-糖链（例如三天线（triantenary)或二天线结构）的糖链，包括例 如含有高甘露糖和乙酰氨基葡萄糖分子和高末端唾液酸残基的糖； c) 包含任选具有末端唾液酸残基的0-糖链的糖链； d) 被α -2, 6-唾液酸转移酶或α -2, 3-唾液酸转移酶唾液酸化的糖链；和/或 e) 显示3-30或7-23个唾液酸基-Ν-乙酰半乳糖胺的唾液酸化糖链。在一个实施方案 中，高糖基化胰岛素类似物由稳定表达α 2, 6唾液酸转移酶且呈现CMP-Neu5Ac水解酶活性 缺乏的哺乳动物糖基化突变体产生，而在又一个实施方案中，哺乳动物糖基化突变体是CH0 糖基化突变体。这类糖基化通常包括N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、半乳 糖、葡萄糖、岩藻糖、木糖、葡糖醛酸、艾杜糖醛酸和/或唾液酸。
[0120] 本文公开的糖基化胰岛素类似物包含与非天然糖基化位点共价连接的至少一个 糖部分，并可包括与天然糖基化位点共价连接的一个或多个糖部分。在一些实施方案中，高 糖基化胰岛素类似物包含0-联糖基化。在其它实施方案中，高糖基化胰岛素类似物包含 N-联糖基化。在其它实施方案中，1?糖基化膜岛素类似物包含0-联和N-联糖基化两者。
[0121] CTP 肽 在一个实施方案中，通过将氨基酸序列添加至基础胰岛素类似物中引入糖基化位点。 更具体地讲， 申请人:发现，命名为C端肽的肽序列（CTP :SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR ; SEQ ID NO: 64)可与胰岛素类似物共价连接而又不削弱胰岛素类似物的固有体外活性，所 述肽序列当蛋白质在真核细胞表达系统中表达时其易于〇-联高糖基化。
[0122] 按照一个实施方案，提供其中胰岛素 B链和A链通过二硫键连接的两链胰岛素类 似物，其中胰岛素类似物具有以下通用结构 (CTP肽l)m-(胰岛素 B链）-(CTP肽2)n:(胰岛素 A链） 其中m为选自0-4的整数，η为选自0-4的整数，CTP肽1和CTP肽2表示包含CTP肽 的氨基酸序列，其中CTP肽1和CTP肽2可以是相同或不同的氨基酸序列。CTP肽可以是 本文公开的任何CTP肽，胰岛素 Β链和胰岛素 Α链可以是本文公开的任何序列或已知起胰 岛素受体激动剂作用的任何序列。因此，CTP肽可与两链胰岛素类似物的B链的氨基端和/ 或羧基端或B链的氨基端连接和/或作为单链类似物中的连接肽。CTP肽还可与两链胰岛 素类似物的A链的氨基端或羧基端或单链胰岛素类似物中A链的羧基端连接。
[0123] 按照一个实施方案，提供包含A链和B链和CTP肽的胰岛素类似物，其中CTP肽 是与（SEQ ID NO: 64)有至少60、70、80、85、90或95%序列同一性的肽。在一个实施方案 中，CTP肽是包含与（SEQ ID NO: 64)的18-29个氨基酸区域有至少80、82、84、86、88、90、 92、94、96或98%序列同一性的18-29个氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，CTP肽包含 (SEQ ID NO: 64)的类似物，其中所述类似物因1、1-2、3-4、4-6或至多8个氨基酸修饰不同 于（SEQ ID NO: 64)，其中修饰是氨基酸取代、缺失或插入。在一个实施方案中，类似物因1、 1-2、3-4、4-6或至多8个氨基酸取代不同于（SEQ ID NO: 64)，其中氨基酸取代在选自（SEQ ID NO: 64)的1-4、7-15、18、20、21、24和27的一个或多个位置上。在一个实施方案中，氨 基酸取代在选自（SEQ ID NO: 64)的1、2、3、4、10、13、15和21的一个或多个位置上。在一 个实施方案中，氨基酸取代在选自（SEQ ID NO: 64)的7、8、9、12、14、18、20、24和27的一 个或多个位置上。在一个实施方案中，CTP肽包含因1-2个氨基酸取代不同于SEQ ID NO: 66的29个氨基酸序列。在又一个实施方案中，CTP肽包含SEQ ID NO: 64的片段，其中该 片段表示与SEQ ID NO: 64内所包含的氨基酸序列相同的18-28个连续氨基酸序列。在一 个实施方案中，CTP 肽由 SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 64 或 SEQ ID NO: 79 组成。
[0124] 按照一个实施方案，CTP 肽包含序列 SSSSX5QAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51 (SEQ ID NO: 66)的肽，其中X5(l和X51独立地为精氨酸或赖氨酸，或以一个或两个氨基酸修饰 不同于 SSSSX5QAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51 (SEQ ID N0: 66)的肽。在一个实施方案 中，CTP肽是包含选自以下序列的29个氨基酸序列：SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK (SEQ ID NO: 79)、SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR (SEQ ID NO: 64)和 SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 65)。在一个实施方案中，CTP 肽包含序列（ SSSSX5CIAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51)n(SEQ ID NO: 66)，其中 η 为选自 1、2、3 和 4 的整数， 而在又一个实施方案中，η为1或2。在又一个实施方案中，第一 CTP肽与Β链的Ν端连接， 第二CTP肽与Β链的羧基端连接，其中第一和第二CTP肽包含独立选自以下的序列：SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66 和 SEQ ID NO: 65。
[0125] 出乎意料的是， 申请人:发现CTP肽可用于连接胰岛素的B链和A链形成单链胰岛 素类似物，同时以天然胰岛素原C肽所不能的方式仍保持高的体外效能。在一个实施方案 中，制备其中B链的羧基端通过CTP肽与A链的氨基端连接的单链胰岛素类似物。在另一 个实施方案中，提供作为其中CTP共价连接于B链的C端和/或B链的氨基端的两链构建 体的胰岛素类似物。体外和体内表征显示CTP修饰的胰岛素类似物在缺乏糖基化时具有高 效能，因此提供以糖基化（一种使蛋白质持续时间更久的天然方法）为基础的延长胰岛素 作用的机制。
[0126] 按照一个实施方案，提供其中A链和B链通过二硫键彼此连接并且CTP肽与B链 的氨基端和/或羧基端共价连接的两链胰岛素类似物。
[0127] 单链类似物 胰岛素原是一种低效能的前体多肽，通过选择性脱去35-残基连接肽（C肽；SEQ ID NO: 53)而经蛋白水解转化成胰岛素。制备其中胰岛素 B链的羧基端通过肽接头与A链的 氨基端连接的单链胰岛素类似物。常规知识是连接A链和B链的连接肽必须不大于11-12 个氨基酸以保持效能。出乎意料的是， 申请人:发现只要天然胰岛素原C肽不与B链羧基端直 接连接，远大于18个氨基酸长度的肽便可用作连接肽，其对胰岛素受体的效能丧失最小。
[0128] 在一个实施方案中，提供包含通用结构B-LM-A的单链胰岛素激动剂类似物，其中 B表示胰岛素 B链，A表示胰岛素 A链，LM表示连接B链羧基端与A链氨基端的连接部分。 胰岛素 A链和B链可以是任何已知的胰岛素序列，包括本文公开的那些，当作为异源双链连 接在一起时，形成功能性胰岛素（即能够结合和激活胰岛素受体）。
[0129] 在一个实施方案中，提供包含A链、B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中连 接部分包含共价连接B链羧基端与A链氨基端以形成连续氨基酸链的18个氨基酸的肽，前 提条件是连接部分不含与B链的羧基端直接连接的SEQ ID N0: 53的序列或其任何片段。 申请人:发现，当天然胰岛素原C肽与B链的羧基端连接时，所述肽似乎对胰岛素单链类似物 的效能有负面影响。将CTP肽插入B链和天然胰岛素原C肽间产生相对于胰岛素原本身更 有效的单链胰岛素类似物（参见图22)。
[0130] 因此，可以制备具有出乎意料的长的连接肽同时又保持基础胰岛素类似物的效能 的单链胰岛素类似物。更具体地讲，在一个实施方案中，连接部分包含至少18个氨基酸的 肽序列，其不含天然胰岛素原C肽（SEQ ID N0: 53)的序列或与B链的羧基端直接连接的 SEQ ID N0: 53的连续18、20、25或30个氨基酸片段。在一个实施方案中，提供包含天然胰 岛素原C肽（SEQ ID N0: 53)的序列或SEQ ID N0: 53的连续18、20、25或30个氨基酸片 段的单链胰岛素类似物，前提条件是连接部分还包含与B链的羧基端直接连接的至少4、8、 16、20、24或28个氨基酸的非C°肽。在提及包含是"直接连接"的非C°肽的胰岛素类似物 的情况下，意指B链的羧基端氨基酸与非C°肽的氨基端氨基酸共价连接。本文所用的非C° 肽是与天然胰岛素原C肽（SEQ ID NO: 53)内所包含的序列有小于90%序列同一性和/或 不含与SEQ ID N0 53内所包含的15个氨基酸序列相同的15个氨基酸序列的任何肽。在 一个实施方案中，非C°肽包含一个或多个N-联和/或0-联糖基化位点。在一个实施方案 中，非C°肽包含CTP肽，而在又一个实施方案中，非C°肽是CTP (SEQ ID N0: 64)。在一个 实施方案中，提供其中连接肽包含与B链的羧基端直接连接的第一 CTP肽（例如包含EQ ID NO: 66的序列）并且连接第一 CTP肽与A链的氨基端的第二肽的单链胰岛素类似物。第 二肽可以是范围为1-58个氨基酸的任何氨基酸序列。在一个实施方案中，第二肽的长度为 约1-29个氨基酸。在一个实施方案中，第二肽包含一个或多个N-联和/或0-联糖基化位 点。在另一个实施方案中，第二肽包含第二CTP肽或包含胰岛素原、IGF-1或IFG-2的天然 C肽。在这些实施方案的任一个中，包含CTP肽的其它序列可与B链的氨基端连接。
[0131] 在一个实施方案中，提供其中连接部分是18-174、18-145、18-116、18-97、29-145、 29-145、29-116、29-97、29-58个氨基酸残基的肽的单链胰岛素类似物。在又一个实施方案 中，连接部分包含总共29-58个氨基酸。在一个实施方案中，连接部分是18-174、18-145、 18-116、18-97、29-145、29-145、29-116、29-97、29-58 个氨基酸残基的肽，其中连接部分包 含序列（SSSSX5CIAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX 51)n (SEQ ID N0: 66)，其中 η 为 1、2 或3，X5。和 X51独立选自精氨酸和赖氨酸。在一些实施方案中，连接部分包括除连接部分的氨基酸残基 外的其它聚合物（例如聚乙二醇），或取代连接部分的氨基酸残基的其它聚合物（例如聚乙 二醇）。
[0132] 按照一个实施方案，提供具有以下通用结构的单链胰岛素类似物 (CTP肽1) m-(胰岛素 B链）-(CTP肽2) n-(胰岛素 A链） 其中m为选自0-4的整数，η为选自1-4的整数，CTP肽1和CTP肽2表示包含CTP肽 的氨基酸序列，其中CTP肽1和CTP肽2可以是相同或不同的氨基酸序列。CTP肽可以是 本文公开的任何CTP肽，胰岛素 B链和胰岛素 A链可以是本文公开的任何序列或已知起胰 岛素受体激动剂作用的任何序列。在一个实施方案中，连接部分包含与B链的羧基端氨 基酸直接连接的29个连续氨基酸序列，其中所述28个连续氨基酸序列与SEQ ID NO: 66 有大于95%序列同一性。在一个实施方案中，CTP肽包含序列SSSX5QAPPPSLPSPSRLPGPSD TPILPQX 52 (SEQ ID NO: 66)，其中X5Q和X51独立选自精氨酸和赖氨酸。在另一个实施方 案中，CTP 肽包含选自以下的序列：SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK (SEQ ID NO: 75)、 SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR (SEQ ID NO: 64)或 SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 65)，在又一个实施方案中，CTP 肽包含序列 SSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK (SEQ ID NO: 75)。
[0133] 或者， 申请人:发现CTP肽的一级序列看来不是关键的（参见图20提供的数据）。 因此，在一个实施方案中，连接部分包含具有至少18个氨基酸（其具有类似的氨基酸内含 物）长度的肽。例如，在一个实施方案中，连接部分包含与B链的羧基端氨基酸直接连接的 29个连续氨基酸序列，其中构成所述29个连续氨基酸序列的氨基酸的至少58%选自丝氨 酸和脯氨酸。在又一个实施方案中，连接部分包含至少一个糖基化位点。在一个实施方案 中，连接部分包含（SEQ ID N0: 66)的类似物，其中所述类似物以1、2、3、4、5或6个氨基酸 取代不同于（SEQ ID N0: 66)。在一个实施方案中，连接肽包含CTP肽，其中选自（SEQ ID NO: 66)的1、2、3、4、10、13、15和21位的一个或多个位置上进行氨基酸取代。
[0134] 申请人:还发现，多拷贝的CTP肽可用作在单链类似物中用作连接肽和/或与单链 或两链胰岛素类似物中的B链的氨基端连接。多拷贝的CTP肽在序列上可相同或不同，并 且可按头-尾或头-头方向排列。按照一个实施方案，提供包含具有序列（SSSSX 5CIAPPPSLPS PSRLPGPSDTPILPQX51)n (SEQ ID NO: 66)的CTP肽的胰岛素类似物，其中η为选自1、2、3和 4的整数，Χ5(ι和X51独立选自精氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，提供其中序列（SSSSX 5CI APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51)n (SEQ ID NO: 66)(其中 η 独立选自 1、2、3 和 4, X5(l 和 X51 独立选自精氨酸和赖氨酸）与B链的氨基端和羧基端两端连接作为两链或单链类似物的胰 岛素类似物，其中对位于B链的氨基端和羧基端的CTP肽，η是相同或不相同的。
[0135] 在一个实施方案中，提供包含通用结构B-LM-A的单链胰岛素激动剂类似物，其中 Β表示胰岛素 Β链，Α表示胰岛素 Α链，LM表示连接Β链羧基端与Α链氨基端的至少18个 氨基酸的肽连接部分。胰岛素 A链和B链可以是任何已知的胰岛素序列，包括本文公开的 那些，当作为异源双链连接在一起时，形成功能性胰岛素。在一个实施方案中，B链包含序 列 R22-X25LCGX29X3(ILVX 33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 17)，A 链包含序列 GIVXACCXJA 0CX12LX14X15LX17X 18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 18)，其中 X4为谷氨酸或天冬氨酸； X5为谷氨酰胺或谷氨酸； X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸； X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； Χ1(ι为异亮氨酸或丝氨酸； Χ12为丝氨酸或天冬氨酸； Χ14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； Χ15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸； χ17为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、鸟氨酸或赖氨酸； χ18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸； X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸； X25为组氨酸或苏氨酸； X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸； Χ3〇选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； Χ33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸； &4选自丙氨酸和苏氨酸； X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺； X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸； X45为酪氨酸或苯丙氨酸； R22 选自 AYRPSE (SEQ ID NO: 11)、FVNQ (SEQ ID NO: 10)、PGPE (SEQ ID NO: 9)、三 肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二 肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和键；和 R13为C00H或C0NH2。在一个实施方案中，B链还包含含有1-6个带电荷的氨基酸的氨 基端延伸。
[0136] 在一个实施方案中，提供包含通式B链-LM-A链的单链胰岛素类似物，其中B链包 含序列 R25-HLCGSX3(iLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 56)，LM 为包含 SSSSX5(iAPPPSLPSPSRLP GPSDTPILPQX51 (SEQ ID NO 66)序列的连接部分，A 链包含 GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 26)的序列，其中 X3(l选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； χ8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸； Χ19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； X22选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸； X5(l和X51独立选自精氨酸和赖氨酸；和 R25选自X22VNQ (SEQ ID N0: 50)、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽天冬酰 胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、AYRPSE (SEQ ID NO: 11)、PGPE (SEQ ID N0: 9)、三肽甘氨 酸-脯氨酸-谷氨酸、二肽脯氨酸-谷氨酸、谷氨酸。在一个实施方案中，X*^PX3(I各自为 组氨酸，X 21为天冬酰胺，R25选自X22VNQ (SEQ ID Ν0: 50)和三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨 酸。在又一个实施方案中，单链胰岛素类似物还包含与B链的N端连接的CTP肽。在一个 实施方案中，连接部分由肽（SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR) n组成，其中η为1或2。 在一个实施方案中，提供包含通式Β链-LM-A链的单链胰岛素激动剂，其中Β链包含序列 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID Ν0: 104)或以1-3个独立选自以下位置的氨基酸 而不同于 SEQ ID N0: 104 的氨基酸序列：B1、B2、B3、B4、B5、B9、BIO、B13、B14、B17、B20、 B21、B22 和 B23, A 链包含序列 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)或以 1-3 个独立 选自以下位置的氨基酸而不同于SEQ ID NO: 1的氨基酸序列：A5、A8、A9、A10、A12、A14、 A15、A17、A18、A21，连接部分（LM)包含序列（SSSSX5(lAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX 51)n(SEQ ID NO: 66)，其中 X5(l和X51独立选自精氨酸和赖氨酸；和 η为1或2,前提条件是B24与SEQ ID NO: 66的第一个丝氨酸直接连接而无任何间插 氨基酸。
[0137] 在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含序列GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGE RGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (DP30 ；SEQ ID NO: 83), GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVEQCCTSICS LYQLENYCN (DP31 ；SEQ ID NO: 84), GEEEEEKGPEHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVEQCCTSICSL YQLENYCN (DP33 ；SEQ ID NO: 85), FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSD TPILPQRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (DP30 ；SEQ ID NO: 88), FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENY CN (DP31;SEQ ID NO: 89)或 GPEHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILP QKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (DP33;SEQ ID NO: 90)。在一个实施方案中，提供单链胰岛素 类似物的二聚体，包括例如包含EQ ID N0: 88和SEQ ID N0: 90的同二聚体或异二聚体。
[0138] 胰岛素 A链和B链 本发明的单链胰岛素激动剂可包含人胰岛素的天然B链和A链序列（分别为SEQ ID NO: 1和2)或其当以异源双链彼此连接时具有胰岛素激动剂活性的任何已知的类似物或 衍生物。所述类似物包括例如具有因一个或多个氨基酸缺失、一个或多个氨基酸取代和/ 或一个或多个氨基酸插入而不同于人胰岛素的A链和B链的A链和B链但又不破坏胰岛素 类似物的胰岛素活性的蛋白质。
[0139] 胰岛素类似物的一种类型即"单体胰岛素类似物"是本领域众所周知的。它们是 人胰岛素的速效类似物，包括例如这样的胰岛素类似物，其中： (a) B28位的氨基酰基残基被Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代，B29位的氨基酰基残基 是 Lys 或 Pro ; (b) B27、B28、B29和B30中任一位置的氨基酰基残基缺失或被非天然氨基酸取代。 在一个实施方案中，提供包含B28位被Asp取代或28位被Lys取代和B29位被脯氨酸取 代的胰岛素类似物。其它单体胰岛素类似物公开于Chance等，美国专利号5, 514, 646 ; Chance 等，美国专利申请序列号 08/255, 297 ;Brems 等，Protein Engineering, 5:527-533 (I992)出range 等，ΕΡ0 公布号 214,826 (I987 年 3 月 I8 日公布）；以及 fcange 等，Current Opinion in Structural Biology, 1:934-940 (1991)。这些公开内容通过引用明确结合 到本文中用于描述单体胰岛素类似物。
[0140] 胰岛素类似物还可用酸性形式置换酰胺化氨基酸。例如，Asn可被Asp或Glu置 换。同样地，Gin可被Asp或Glu置换。具体地讲，Asn(A18)、Asn(A21)或Asp(B3)或这些 残基的任何组合可被Asp或Glu置换。同样地，Gin (A15)或Gin (B4)或两者可被Asp或Glu 置换。
[0141] 如本文所公开的，提供包含人胰岛素的B链和A链或其类似物或衍生物的 单链胰岛素激动剂，其中B链的羧基端通过连接部分与A链的氨基端连接。在一个 实施方案中，A链是选自以下的氨基酸序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)或 GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7) ;B 链包含序列 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)、 GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 6)或AYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFYFSRP A (SEQ ID NO: 8)或其相当于826、827、828、829和830的1-5个氨基酸缺失的羧基缩短序 列；和这类序列的类似物，其中每个序列经修饰以在相当于选自A5、A8、A9、A10、A14、A15、 A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B22、B23、B26、B27、B28、B29 和 B30 的天然胰岛素位置（参见图5所示的肽比对）的位置处包含1-5个氨基酸取代。在一个实 施方案中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。不会不利地影响胰岛素的所需活性的这些位置 的合适氨基酸取代对本领域技术人员而言是已知的，如例如Mayer等，Insulin Structure and Function, Biopolymers· 2007; 88 (5) :687-713 所证实的一样，其公开内容通过引用 结合到本文中。
[0142] 按照一个实施方案，单链胰岛素类似物肽可包含胰岛素 A链和胰岛素 B链或其 类似物，其中A链包含在天然肽的长度内与GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID N0: 1)、 GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)或 GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7) 的至少一个具有至少70%序列同一性（例如70%、75%、80%、85%、90%、95%)的氨基酸序列， B 链包含在天然肽的长度内与序列 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID N0: 2)、、 GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 6)或AYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFYFSRP A (SEQ ID NO: 8)或其相当于B27、B28、B29和B30的1-4个氨基酸缺失的羧基缩短序列 的至少一个具有至少60%序列同一性（例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%)的氨基 酸序列。
[0143] 可将其它氨基酸序列添加至本发明的单链胰岛素激动剂的B链的氨基端或A链的 羧基端上。例如，可将一系列带负电荷的氨基酸加至B链的氨基端，包括例如长度为1-12、 1-10、1-8或1-6个氨基酸并包含一个或多个带负电荷的氨基酸（包括例如谷氨酸和天冬氨 酸）的肽。在一个实施方案中，B链氨基端延伸包含1-6个带电荷的氨基酸。在一个实施 方案中，单链胰岛素类似物包含含有序列X 6〇X61X62X63X64X 65K (SEQ ID N0: 19)的B链氨基端 延伸，其中X6〇选自甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，并且χ61、χ 62、χ63、χ64和X65独立地为谷氨酸或 天冬氨酸。在一个实施方案中，B链氨基端延伸包含序列GX 61X62X63X64X65K (SEQ ID N0: 20) 或 X61X62X63X64X65RK (SEQ ID NO: 21)，其中 X61、X62、X63、X64 和 X65 独立地为谷氨酸或天冬氨 酸。在一个实施方案中，B 链包含序列 GEEEEEKGPEHLCGAHLVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 22)，其中X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。按照一个实施方案，所公开的单链胰岛 素类似物包含替代A链上的C端羧酸基的C端酰胺或酯。
[0144] 高效能单链胰岛素类似物还可根据描述于国际申请PCT/2009/068713的修饰的 IGF I和IGF II序列来制备，其公开内容通过引用明确结合到本文中。更具体地讲，在相当 于天然胰岛素的B16和B17的位置处包含天然IGF氨基酸被酪氨酸亮氨酸二肽取代的IGF I和IGF II类似物对胰岛素受体的效能提高10倍。因此，本文所公开的单链胰岛素类似物 可包括 IGF I (SEQ ID N0: 5)或 IGF II (SEQ ID N0: 7)的 A 链和 IGF I (SEQ ID N0: 6)或IGF II (SEQ ID NO: 8)的修饰的B链或天然胰岛素 （SEQ ID NO: 2)的B链。另外， 本文所公开的单链胰岛素类似物可包括天然胰岛素 A链或其类似物和IGF I (SEQ ID NO: 6)或IGF II (SEQ ID NO: 8)的修饰的B链以及所述B链的类似物。在一个实施方案中， 单链胰岛素类似物包含IGF I (SEQ ID NO: 5) A链或其类似物或衍生物和IGF I (SEQ ID NO: 6)、IGF II (SEQ ID NO: 8)或天然胰岛素 （SEQ ID NO: 2)的修饰的B链或其类似物 或衍生物。
[0145] 单链IGF或胰岛素 A链和B链的其它修饰包括例如A19、B16或B25位（对应于 天然胰岛素 A链和B链）的一个或多个位置处的氨基酸变为4-氨基苯丙氨酸的修饰或选 自 A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B21、 822、823、826、827、828、829和830(对应于胰岛素的天然八链和8链）的一个或多个氨基 酸取代或B1-4和B26-30位的任一个或全部缺失。在一个实施方案中，在选自A5、A8、A9、 A10、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B21、B22、B23、B26、 B27、B28、B29和B30位的取代是相对于天然胰岛素序列的保守氨基酸取代。
[0146] 按照一个实施方案，B链包含序列 R22-X25LCGX29X3〇LVX 33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID N0: 17)，而 A 链包含序列 GIVX4X5CCX8X9X10CX 12LX14X15LX17X18X 19CX21-R13 (SEQ ID NO: 18)，其中 X4为谷氨酸或天冬氨酸； X5为谷氨酰胺或谷氨酸； X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸； X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； Χ1(ι为异亮氨酸或丝氨酸； Χ12为丝氨酸或天冬氨酸； Χ14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； χ15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸； χ17为谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺； χ 18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸； Χ19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸； X25为组氨酸或苏氨酸； X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸； Χ3〇选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； Χ33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸； &4选自丙氨酸和苏氨酸； X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺； X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸； χ45为酪氨酸或苯丙氨酸； R22 选自 AYRPSE (SEQ ID NO: 11)、FVNQ (SEQ ID NO: 10)、PGPE (SEQ ID N0: 9)、三 肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二 肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端胺；和 R13为C00H或C0NH2。在一个实施方案中，各自为组氨酸。在又一个实施 方案中，单链胰岛素类似物肽包含SEQ ID NO: 15的A链肽序列和/或SEQ ID NO: 16的 B链肽序列的类似物，其中A链和B链的类似物各包含1-3个另外的氨基酸取代。
[0147] 在一个实施方案中，提供包含结构IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序 列 R22-X25LCGX29X3QLVX 33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 17)，LM 为本文公开的并且具有共 价连接IB与IA的至少18个氨基酸的连接部分，IA包含序列GIVX4X 5CCX8X9X1(iCX12LX 14X15LX 17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 18)，其中 X4为谷氨酸或天冬氨酸； X5为谷氨酰胺或谷氨酸； X8为组氨酸或苯丙氨酸； 乂9和114独立选自精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； Χ1(ι为异亮氨酸或丝氨酸； Χ12为丝氨酸或天冬氨酸； Χ14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； Χ15为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸； Χ17为谷氨酸或谷氨酰胺； Χ18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸； Χ19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； 乂25选自组氨酸和苏氨酸； X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸； Χ3〇选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； Χ33选自天冬氨酸和谷氨酸； &4选自丙氨酸和苏氨酸； X41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺； χ42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸； R22 选自 AYRPSE (SEQ ID NO: 11)、FVNQ (SEQ ID NO: 10)、PGPE (SEQ ID N0: 9)、三 肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二 肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和N端胺；和 R13为C00H或C0NH2，而且其中标识X45处的氨基酸与连接部分LM直接结合（即本文所 用标识IB-LM-IA意在表示B链羧基端和A链的氨基端与连接部分LM直接连接而无任何其 它间插氨基酸）。连接部分可以是本文描述的任何结构。
[0148] 按照一个实施方案，提供其中胰岛素肽的A链包含序列 GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 23)，B链包含序列X24LCGX29X3(iLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 24)的胰岛素类似物，其中 乂8选自苏氨酸和组氨酸； X17为谷氨酸或谷氨酰胺； X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X23为天冬酰胺或甘氨酸； 乂24选自组氨酸和苏氨酸； χ29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸； x3(l选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸。在又一个实施方案中，B链 包含序列 XmVNQXMLCGXwXwLVEALYLVCGERGFFYT-ZfBi (SEQ ID NO: 25)，其中 X22选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸； 乂25选自组氨酸和苏氨酸； X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸； Χ3〇选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； Zi是选自天冬氨酸-赖氨酸、赖氨酸-脯氨酸和脯氨酸-赖氨酸的二肽；和 选自苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽。
[0149] 按照一个实施方案，提供包含结构IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序 列 X25LCGX29X3QLVEALYLVCG ERGFF (SEQ ID NO: 24)，LM 为本文公开的共价连接 IB 与 IA 的 连接部分，IA包含序列GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX 2i (SEQ IDN0: 26)。按照一个实施方案， A 链包含序列 GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID N0: 23)或 GIVDECCXsXgSCDLX^XMLXi 7X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 27)，而 B 链包含序列 X25LCGX29X3(ILVX33X 34LYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 28)，其中 X8为组氨酸或苯丙氨酸； 乂9和114独立选自精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； χ15为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸； χ17为谷氨酸或谷氨酰胺； χ18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸； x19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； X23为天冬酰胺或甘氨酸； 乂25选自组氨酸和苏氨酸； X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸； Χ3〇选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； Χ33选自天冬氨酸和谷氨酸； &4选自丙氨酸和苏氨酸； χ42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸； χ45为酪氨酸；和 R13为C00H或C0NH2。在一个实施方案中，η和k的至少一个为1。
[0150] 在又一个实施方案中，A 链包含序列 GIVDECCHX9SCDLX14X15LX17X 18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 27)，而 B 链包含序列 X25LCGX29X3(ILVX33X 34LYLVC⑶X42GFX45 (SEQ ID NO: 28)，其中 乂9和114独立选自精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； X15为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸； X17为谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺； X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸； X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； x23为天冬酰胺或甘氨酸； 乂25选自组氨酸和苏氨酸； χ29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸； Χ3〇选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； χ33选自天冬氨酸和谷氨酸； &4选自丙氨酸和苏氨酸； χ42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸； χ45为酪氨酸或苯丙氨酸和 R13为COOH或conh2。在又一个实施方案中，Α链包含序列givdecchx9scdlx 14x15lx17mx 19CX21-R13 (SEQ ID NO: 29)，而 B 链包含序列 X25LCGAX3〇LVDALYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 30)，其中 x9、x14和x15独立地为鸟氨酸、赖氨酸或精氨酸； χ17为谷氨酸或谷氨酰胺； X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； 乂25选自组氨酸和苏氨酸； X3〇选自组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸； X42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸； X45为酪氨酸或苯丙氨酸和 R13为C00H或C0NH2。 在一个实施方案中，B链选自 HLCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 31)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 32)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNPKT (SEQ ID NO: 33)和 GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNKPT (SEQ ID NO: 34)，其中 X42 选自鸟氨酸、赖氨酸和精氨 酸。在又一个实施方案中，A链包含序列GIVDECCHX9SCDLX14X 15LQMYCN-R13 (SEQ ID NO: 36)， 其中X9、X14和X15独立地为鸟氨酸、赖氨酸或精氨酸。
[0151] 在一个实施方案中，提供包含通式IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其 中 IB 为选自以下的氨基酸序列：HLCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID N0: 31)、 GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 32)、GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNPKT (SEQ ID NO: 33)和 GPEHLCGAELVDALYLVCGDX42GFYFNKPT (SEQ ID NO: 34)，LM 为本文公开的连 接部分。
[0152] 按照一个实施方案，提供包含结构IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中IB包含序 列 X25LCGX29X3QLVX33X34LYLVCGDX 42GFX45 (SEQ ID NO: 28)，LM 为本文公开的共价连接 IB 与 IA 的连接部分，IA 包含序列 GIVEQCCHSICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID N0: 37)或 GIVDECCX 8X9SCDLX14X15LX17X 18X19CX2「R13 (SEQ ID NO: 38)，其中 SEQ ID NO: 58 的 C 端苯丙氨酸残基 在没有任何间插氨基酸的情况下与连接部分LM直接共价结合。按照一个实施方案，提供包 含以下序列的单链胰岛素类似物 ：X25LCGX29X3QLVX33X 34LYLVCGDX42GFX45 (SEQ ID NO: 28)-(S SSSX5(lAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51) n (SEQ ID NO: 66)-GIVDECCX8X9SCDLX14X15LX 17X18X19CX21 -R13 (SEQ ID NO: 27)或 X25LCGX29X30LVX33X34LYLVC⑶X^GFXJY!), (SEQ ID NO: 28)-(SSSS X50APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51) n (SEQ ID NO: 66)-GIVEQCCHSICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 37)，其中 X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸； χ9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； χ14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； χ15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸； χ17为谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺； χ18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸； x19为酪氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸或4-氨基-苯丙氨酸； X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； X25为组氨酸或苏氨酸； X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸； Χ3〇选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； Χ33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸； &4选自丙氨酸和苏氨酸； Χ42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸； Χ45为酪氨酸或苯丙氨酸；和 Χ5(|和X51独立地为精氨酸或赖氨酸，η为1或2。
[0153] 按照一个实施方案，提供包含结构IB-LM-IA的单链胰岛素类似物，其中ΙΒ包含序 列 X25LCGX29X3QLVX33X34LYLVCGDX 42GFX45 (SEQ ID NO: 28)，LM 为本文公开的连接部分，Α 链包 含序列 GIVDECCHX9SCDLX14X15LQMYCN-R13 (SEQ ID N0: 36)，其中父9、父14和父15 独立地为鸟氨 酸、赖氨酸或精氨酸，R13为C00H或C0NH2。
[0154] 在一个实施方案中，B链选自 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID N0: 104)、 HLCGAELVDALYLVCGDOGFY (SEQ ID NO: 39) , GPEHLCGAELVDALYLVCGDOGFY (SEQ ID NO: 40)、GPEHLCGAELVDALYLVCGD0GFYFNPKT (SEQ ID NO: 41)和 GPEHLCGAELVDALYLVCGDOGFYFNKPT (SEQ ID NO: 42)，A链为GIVDECCH0SCDL00LQMX19CN-R13 (SEQ ID NO: 43)或SEQ ID NO: 1，其中X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯 丙氨酸。
[0155] 在一个实施方案中，单链胰岛素还包含与连接部分的氨基酸侧链和/或在选自A 链的A9、A14和A15位或B链的B0、B1、B10、B22、B28或B29位共价连接的聚乙二醇链。在 一个实施方案中，聚乙二醇链与B链的氨基端氨基酸共价连接。
[0156] 胰岛素类似物的合成 本公开内容还涉及编码本文公开的任何胰岛素类似物的核酸序列以及包含所述核酸 序列的宿主细胞。本文公开的单链胰岛素类似物可采用本领域技术人员已知的标准技术和 表达载体表达。本文公开的胰岛素类似物可在原核（例如大肠杆菌）或真核（酵母、哺乳 动物细胞）宿主细胞中表达。按照一个实施方案，高糖基化胰岛素类似物使用重组真核宿 主细胞合成，所述细胞包含编码本文公开的包含CTP肽的胰岛素类似物的核酸序列。在一 个实施方案中，真核宿主细胞是酵母细胞，更通常是经修饰以表达人糖基化基因的酵母细 胞（例如巴斯德毕赤酵母）。或者，在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞（例 如CHO细胞），任选经修饰以表达人糖基化基因。
[0157] 按照一个实施方案，提供产生高糖基化胰岛素类似物的方法，其中该方法包括在 其中产生CTP修饰的胰岛素类似物蛋白质的条件下，培养包含CTP修饰的胰岛素类似物编 码基因的宿主细胞。然后可从培养物中回收表达的蛋白质。在一个实施方案中，宿主细胞 表达通式（CTP肽l) m-(胰岛素 B链）-(CTP肽2)"的胰岛素 B链，其中m为选自0-4的整 数，η为选自0-4的整数，CTP肽1和CTP肽2表示包含CTP肽的氨基酸序列，其中CTP肽1 和CTP肽2可以是相同或不同的氨基酸序列。相同的细胞还可表达胰岛素 Α链，其中从细 胞中回收B链和A链，并重新组成两链胰岛素。或者，A链可在独立的宿主细胞中表达，所 述细胞与第一重组细胞一起共培养或单独培养。
[0158] 在一个实施方案中，提供包含编码单链胰岛素类似物（其中连接胰岛素 B链羧基 端与A链氨基端的连接部分包含CTP肽）的基因的宿主细胞。在备选的实施方案中，基因 编码包含与B链N端连接的CTP肽的单链胰岛素类似物。在一个实施方案中，基因编码包 含与B链N端连接的第一 CTP肽和含有第二CTP肽的连接部分的单链类似物，其中第一和 第二CTP肽相同或不同。在一个实施方案中，CTP肽包含选自SEQ ID NO: 66、SEQ ID N0: 64 或 SEQ ID NO: 75 的序列。
[0159] 在一个实施方案中，宿主细胞表达通式（CTP肽l)m_(胰岛素 B链）_(CTP肽2) n_(胰岛素 A链）的单链胰岛素类似物，其中m为选自0-4的整数，η为选自1-4的整数，CTP 肽1和CTP肽2表示包含CTP肽的氨基酸序列，其中CTP肽1和CTP肽2可以是相同或不 同的氨基酸序列。该方法包括在其中产生所述蛋白质的条件下培养包含编码CTP胰岛素类 似物的基因的宿主细胞，并从培养物中回收蛋白质的步骤。
[0160] 在一个实施方案中，胰岛素类似物作为单链类似物表达，其中连接部分在连接部 分和胰岛素 Α链的连接处包含独特的肽切割部位，且所述方法还包括切割回收的蛋白质以 产生两链胰岛素类似物的步骤。可以使用任何肽切割酶，只要识别肽不位于胰岛素 B或A链 序列内。在一个实施方案中，连接部分包含序列SSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK (SEQ ID NO: 79)，并且表达的单链胰岛素类似物用Lys C切割产生两链胰岛素类似物。在一个实施 方案中，宿主细胞是经修饰只表达人糖基化酶的酵母细胞。在一个备选实施方案中，宿主细 胞是哺乳动物细胞系，包括例如CH0细胞。
[0161] 胰岛素类似物的聚乙二醇化 亲水部分与本文公开的胰岛素类似物的共价连接可进一步提高含CTP的胰岛素类似 物的性质，以提供起效较慢、持续时间延长和显示基础活性概况的类似物。在一个实施方案 中，本文公开的胰岛素类似物（即经修饰含有糖基化位点）被进一步修饰以包含与在选自 A链的A9、A14和A15位或B链的B0、Bl、B10、B22、B28或B29位或连接A链与B链的连接 部分的任何位置上的氨基酸侧链共价连接的亲水部分。在示例性的实施方案中，该亲水部 分与在这些位置的任一个上与Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰基-苯丙氨酸残基共价连 接。在一个实施方案中，亲水部分与连接部分的氨基酸侧链共价连接。
[0162] 示例性的亲水部分包括聚乙二醇（PEG)，例如分子量为约1，000道尔顿-约 40, 000道尔顿或约20, 000道尔顿-约40, 000道尔顿的聚乙二醇。其它合适的亲水部分 包括聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇（例如P0G)、聚氧乙烯化山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖、 聚氧乙烯化甘油（P0G)、聚氧化烯、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇共聚物、单甲氧基聚乙 二醇、单（C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇（PVa)、聚 乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧杂环戊烷、聚-1，3, 6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酐共聚物、 聚（β -氨基酸）（均聚物或无规共聚物）、聚（η-乙烯基吡咯烷酮）聚乙二醇、聚丙二醇 (propropylene glycol)均聚物（PPG)及其它聚环氧烧经、聚环氧丙烧/环氧乙烧共聚物、 肠菌酸（colonic acid)或其它多糖聚合物、聚鹿糖（Ficoll)或葡聚糖及其混合物。
[0163] 按照一些实施方案，亲水部分（例如聚乙二醇链）的分子量选自约500-约40, 000 道尔顿。在一个实施方案中，亲水部分（例如PEG)的分子量选自约500-约5, 000道尔顿 或约1，000-约5, 000道尔顿。在另一个实施方案中，亲水部分（例如PEG)的分子量约 10, 000-约20, 000道尔顿。在另外其它的示例性实施方案中，亲水部分（例如PEG)的分 子量为约20, 000-约40, 000道尔顿。在一个实施方案中，亲水部分（例如PEG)的分子量 为约20, 000道尔顿。在一个实施方案中，提供其中类似物的一个或多个氨基酸被聚乙二醇 化，且共价连接的PEG链的总分子量为约20, 000道尔顿的单链胰岛素类似物。
[0164] 在一个实施方案中，葡聚糖用作亲水部分。葡聚糖是主要通过α 1-6键连接的葡 萄糖亚基的多糖聚合物。可获得许多分子量范围的葡聚糖，例如约1 kD-约100 kD，或从约 5、10、15 或 20 kD 到约 20、30、40、50、60、70、80*90kD。
[0165] 考虑了线性或支链聚合物。所得缀合物的制备物基本上可为单分散的或多分散 的，且每个肽可具有约0. 5、0. 7、1、1. 2、1. 5或2个聚合物部分。
[0166] 在一个实施方案中，亲水部分是聚乙二醇（PEG)链，任选在选自以下的位置上与 氨基酸侧链连接：A链的A9、A14和A15位；B链的氨基端氨基酸；B链的B10、B22、B28或B29 位；或在连接A链和B链的连接部分的任何位置上。在一个实施方案中，单链胰岛素类似物 包含肽连接部分，其中连接部分的氨基酸之一具有与其侧链共价结合的聚乙烯链。在一个 实施方案中，单链胰岛素类似物包含肽连接部分，其中连接部分的氨基酸被聚乙二醇化，且 在选自以下位置的一个或多个氨基酸也被聚乙二醇化：A链的A9、A14和A15 ;B链的氨基端 氨基酸和B链的B10、B22、B28或B29位。在一个实施方案中，共价连接的PEG链的总分子 量约为20, 000道尔顿。
[0167] 在一个实施方案中，提供单链胰岛素类似物，其中连接部分的氨基酸之一具有与 其侧链共价结合的20, 000道尔顿聚乙烯链。在另一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含 与连接部分的氨基酸之一共价结合的聚乙烯链和与氨基端氨基酸或B链的B29连接的第二 PEG链。在一个实施方案中，当两个PEG链与单链胰岛素类似物连接时，各PEG链的分子量 为约10, 000道尔顿。
[0168] 亲水部分（例如聚乙二醇）可在用于使蛋白质与活化聚合物分子反应的任何合 适条件下与胰岛素类似物连接。可采用本领域已知的任何方法，包括通过酰化、还原性烷 基化、迈克尔加成、疏基烧基化或通过PEG部分上的反应基（例如醒基、氣基、醋基、疏基、 α -卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基）与目标化合物上的反应基（例如醛基、氨基、酯基、 巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基）的其它化学选择性缀合/连接方法。可用于 使水溶性聚合物与一个或多个蛋白质连接的活化基团包括而不限于砜、马来酰亚胺、巯基、 硫醇、三氟甲磺酸酯（triflate)、三氟乙磺酸酯（tresylate)、氮杂环丙烧（azidirine)、氧 杂环丙烷和5-吡啶基。如果通过还原性烷基化与肽连接，则所选择的聚合物应具有单个活 性醒，使得聚合度受控制。参见例如Kinstler等，JoV.价叹.ife/ire/y/feK 54:477-485 (2002) ;Roberts 等，JoV.价叹 TfeF. 54:459-476 (2002);以及 Zalipsky 等， Adv. Drug Delivery Rev. 16 :157-182 (1995)。
[0169] 在本发明的一个具体方面，具有巯基的胰岛素类似物中的氨基酸残基被亲水部分 (例如PEG)修饰。在一些实施方案中，巯基在迈克尔加成反应中被马来酰亚胺活化的PEG 修饰，得到包含以下所示硫醚键的聚乙二醇化肽：
【权利要求】
1. 一种包含A链、B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分共价连接B 链的羧基端与A链的氨基端以形成连续氨基酸链，所述连接部分包含CTP肽，其中所述CTP 肽包含 包含序列 SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR (SEQ ID NO: 64)的氨基酸序列； 包含SEQ ID NO: 64的18-28个氨基酸片段的序列；或 包含与（SEQ ID NO: 64)的18-29个氨基酸序列有至少50%序列同一性的18-29个氨 基酸序列的序列， 前提条件是连接部分不含与直接连接B链羧基端的SEQ ID NO: 53的18个氨基酸序 列相同的18个氨基酸序列。
2. 权利要求1的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分包含共18-158个氨基酸残基。
3. 权利要求1的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分包含共28-56个氨基酸。
4. 权利要求2或3的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分包含与B链的羧基端氨基 酸直接连接的29个连续氨基酸序列，其中所述29个连续氨基酸序列与SSSSX 5(iAPPPSLPSPS RLPGPSDTPILPQX51 (SEQ ID NO: 66)有大于 90% 序列同一性，其中 X5(l和X51独立选自精氨酸和赖氨酸。
5. 权利要求2、3或4的单链胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物还包含对天然胰岛 素而言是非天然的糖基化位点。
6. 权利要求5的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分包含N-联糖基化位点。
7. 权利要求5的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分包含0-联糖基化位点。
8. 权利要求2或3的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分包含（SEQ ID N0: 64)的 类似物，其中所述类似物通过1-6个氨基酸取代而不同于（SEQ ID NO: 64)。
9. 权利要求4的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分包含SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 79。
10. 权利要求1、4、8或9中任一项的单链胰岛素类似物，其中 所述 A 链包含序列 GIVX4X5CCX8X9X1(ICX 12LX14X15LX17X18X 19CX21-R13 (SEQ ID N0: 18);和 所述 B 链包含序列 R22-X25LCGX29X3QLVX 33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 17)，其中 X4为谷氨酸或天冬氨酸； X5为谷氨酰胺或谷氨酸； X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸； X9为丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； Χ1(ι为异亮氨酸或丝氨酸； Χ12为丝氨酸或天冬氨酸； Χ14为酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； Χ15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸； Χ17为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、鸟氨酸或赖氨酸； Χ18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸； Χ19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸； χ25为组氨酸或苏氨酸； χ29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸； Χ3〇选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； χ33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸； &4选自丙氨酸和苏氨酸； χ41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺； χ42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸； χ 45为酪氨酸或苯丙氨酸； R22 选自 AYRPSE (SEQ ID NO: 11)、FVNQ (SEQ ID NO: 10)、PGPE (SEQ ID NO: 9)、三 肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽脯氨酸-谷氨酸、二 肽天冬酰胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和键；和 R13 为 C00H 或 C0NH2。
11. 权利要求10的单链胰岛素类似物，其中 所述 A 链包含序列 GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 23)，而 B 链包含序列 X24LCGX29X3QLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 24)，其中父8选自苏氨酸和组氨酸； X17为谷氨酸或谷氨酰胺； X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X23为天冬酰胺或甘氨酸； 乂24选自组氨酸和苏氨酸； X29选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸； Χ3〇选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸。
12. 权利要求10的单链胰岛素类似物，其中Β链包含序列 R22-HLCGSX3(iLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 56)或R24-X25LCGX29X3(iLVX 33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 17)，而 A 链包含序列 GIVEQCCX8SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 26)或 G IVX4ECCX8X9SCDLX14X 15LX17X18X19CX21-R 13 (SEQ ID NO: 15) 其中 X4为谷氨酸或天冬氨酸； X8为组氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸； X9为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； X14为精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； X15为谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或亮氨酸； X17为谷氨酰胺或谷氨酸； X18为甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或苏氨酸； X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； X21选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸； X25为组氨酸或苏氨酸； &9选自丙氨酸和甘氨酸； Χ3〇选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸和半胱磺酸； χ33选自天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸； &4选自丙氨酸和苏氨酸； χ41选自谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺； χ42选自丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸； χ 45为酪氨酸或苯丙氨酸； R22选自X22VNQ (SEQ ID NO: 50)、三肽缬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺、二肽天冬酰 胺-谷氨酰胺、谷氨酰胺和键； 选自 AYRPSE (SEQ ID NO: 11)、PGPE (SEQ ID NO: 9)、三肽甘氨酸-脯氨酸-谷氨 酸、二肽脯氨酸-谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和键；和 R13 为 C00H 或 C0NH2。
13. 权利要求12的单链胰岛素激动剂，其中 X8、X25和X3(l各自为组氨酸。
14. 权利要求11的单链胰岛素激动剂，其中所述B链包含序列 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 104)，A链包含序列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)，且连接部分包含序列（SSSSX5QAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51) n (SEQ ID NO: 66)，其中 X5(l和X51独立选自精氨酸和赖氨酸；和 η为1或2。
15. 前述权利要求中任一项的单链胰岛素激动剂，其还包含与所述类似物连接的亲水 部分，其中所述亲水部分为血浆蛋白、聚乙二醇链或免疫球蛋白的Fc部分。
16. 前述权利要求中任一项的单链胰岛素激动剂，其中所述单链胰岛素激动剂的氨基 酸侧链通过烷基胺、酰胺、醚、酯、硫醚或硫酯键与酰基或烷基共价连接。
17. -种包含A链、B链和CTP肽的胰岛素类似物，其中 A GIVX4X5CCX8X9Xi〇CX12LX 14X15LEX18X19CX21-R 13 (SEQ ID NO: 55)； 所述 B 链包含序列 X25LCGX29X3(ILVX33X 34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 17);和 所述 CTP 肽包含序列（SSSSX5CIAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX51) n (SEQ ID NO: 66)或 MG SSSSX5(IAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQEEEEEX51 (SEQ ID NO: 93)，其中所述 A 链和 B 链通过二 硫键彼此连接，且所述CTP肽与B链的氨基端或羧基端共价结合，此外其中 η为选自1-3的整数； Χ4为谷氨酸或天冬氨酸； Χ5为谷氨酸或谷氨酰胺； Χ8为苏氨酸、组氨酸或苯丙氨酸； Χ9为丝氨酸、精氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； Χ1(ι为丝氨酸或异亮氨酸； Χ12为丝氨酸或天冬氨酸； Χ14为精氨酸、酪氨酸、鸟氨酸或丙氨酸； Χ15为谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、鸟氨酸或亮氨酸； Χ18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸； Χ19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸； χ21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； χ25为组氨酸或苏氨酸； χ29为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸； X3〇为组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸或半胱磺酸； x33为天冬氨酸或谷氨酸； χ34为丙氨酸或苏氨酸； χ41为天冬氨酸或谷氨酸； χ42为丙氨酸、鸟氨酸或精氨酸； χ45为酪氨酸或苯丙氨酸； X5(l和X51独立选自精氨酸和赖氨酸；和 R13 为 COOH 或 CONH2。
18. 权利要求17的胰岛素类似物，其中所述B链的羧基端通过肽接头与A链的氨基端 共价连接形成连续氨基酸链，其中所述肽接头包含所述CTP肽。
19. 权利要求17或18的胰岛素类似物，其中所述CTP肽 包含独立选自以下的序列：（ssssx 5Qapppslpspsrlpgpsdtpilpq) n (SEQ ID NO: 92)、（SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK)n (SEQ ID NO: 79)和 (SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR)n (SEQ ID NO: 64)，其中 n为1或2。
20. -种核酸序列，其编码权利要求1-19中任一项的胰岛素类似物。
21. -种真核宿主细胞，其包含权利要求20的编码胰岛素类似物的核酸序列。
22. 权利要求21的宿主细胞，其中所述细胞是毕赤酵母（Pichia)或CH0细胞。
23. -种产生高糖基化胰岛素类似物的方法，所述方法包括 使权利要求21的细胞在其中产生所述蛋白质的条件下培养；和 从培养物中回收所述蛋白质。
24. 前述权利要求中任一项的胰岛素类似物的衍生物，其还包含结构U-B，其中 U为氨基酸或羟酸； B为通过B的羧基部分和单链胰岛素类似物的胺之间的酰胺键与所述单链胰岛素类似 物连接的N-烷基化氨基酸，其中U、B或U-B与之连接的单链胰岛素类似物的氨基酸为非 编码氨基酸，此外其中在生理条件下在PBS中，U-B自单链胰岛素类似物化学切割的半衰期 (t 1/2)为至少约1小时-约1周。
25. 权利要求24的衍生物，其中U-B包含下式X的结构：
其中 Rp R2、R4 和 R8 独立选自 H、CrC18 烷基、C2-C18 烯基、（CrC18 烷基）OH、（CfC18 烷基）SH、 (C2-C3 烷基）SCH3、（CrC4 烷基）C0NH2、（CrC4 烷基）COOH、（CrC4 烷基）NH2、（CrC4 烷基） NHC (NH2+) NH2、（CQ-C4 烷基）（C3-C6 环烷基）、（CQ-C4 烷基）（C2-C5 杂环基）、（CQ-C4 烷基）（C6-C10 芳基）r7、（crc4烷基）（c3-c 9杂芳基）和Ci-Cu烷基（W) Ci-Cu烷基，其中Wi是选自N、S和 0的杂原子，或 札和r2与它们所连接的原子一起形成c3-c12环烷基或芳基；或 r4和r8与它们所连接的原子一起形成c3-c6环烷基； R3 选自 CrC18 烷基、（C「C18 烷基）OH、（C「C18 烷基）NH2、（C「C18 烷基）SH、（CQ-C4 烷基） (c3-c6)环烷基、（cQ-c4 烷基）（c2-c5 杂环基）、（cQ-c4 烷基）（c6-c1Q 芳基）r7 和（crc4 烷基） (c3-c9杂芳基），或R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环； R5 为 NHR6 或 0H ; R6为H、烷基，或R6和&与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和 R7 选自 H、OH、CrC18 烷基、C2-C18 烯基、（CQ-C4 烷基）C0NH2、（CQ-C4 烷基）COOH、（CQ-C4 烷 基）NH2、（CQ-C4烷基）OH和卤素。
26. 权利要求25的衍生物，其中 札和R2独立地为CrC18烷基或芳基； R3为烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环； R4和R8独立选自氢、烷基和芳基；和 R5为胺或轻基。
27. 权利要求25的衍生物，其中 札和R2独立选自氢、CrC8烷基和芳基； R3为烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环； &和馬各自为氢；和 1?5选自胺、N-取代胺和羟基。
28. 权利要求27的单链胰岛素激动剂，其中所述类似物在选自A14、A15、B0、B1、B10、 B22、B28、B29的一个或多个位置上、在连接部分的氨基酸侧链的侧链或二肽U-B氨基酸的 侧链上被酰化。
29. 权利要求27的单链胰岛素激动剂，其中所述类似物在选自A14、A15、B0、B1、B10、 B22、B28、B29的一个或多个位置上、在连接部分的氨基酸侧链的侧链或二肽U-B氨基酸的 侧链上被聚乙二醇化。
30. -种二聚体或多聚体，其包含前述权利要求中任一项的单链胰岛素激动剂。
31. -种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的单链胰岛素激动剂或其前药衍 生物和药学上可接受的载体。
32. 权利要求1-30中任一项的化合物在制备用于治疗高血糖症的药物中的用途。
【文档编号】A61K38/28GK104114183SQ201280070186
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2012年12月19日 优先权日:2011年12月20日
【发明者】R.D.迪马基, P.李 申请人:印第安纳大学研究及科技有限公司