骨膜蛋白适配体及包含其的抗癌组合物的制作方法

骨膜蛋白适配体及包含其的抗癌组合物的制作方法
【专利摘要】本公开内容涉及特异性结合癌症相关蛋白骨膜蛋白的DNA适配体、包含其作为活性成分的用于抑制癌症和/或癌症转移的组合物和/或用于诊断癌症和/或癌症转移的组合物，其中所述适配体具有与现有抗体不同的结合机制，并因此，可更有效地抑制和诊断癌症/癌症转移。
【专利说明】骨膜蛋白适配体及包含其的抗癌组合物

【技术领域】
[0001] 本发明涉及特异性结合癌症相关蛋白骨膜蛋白的DNA适配体（aptamer)、包含其 作为活性成分的用于抑制癌症和/或癌症转移的组合物和/或用于诊断癌症和/或癌症转 移的组合物。
[0002] 发明背景
[0003] 实体癌向浸润性肿瘤的进展是转移的主要先决条件，并包括细胞形态和运动等的 变化。尽管癌细胞的基因修饰取决于转移性癌症的类型而不同，但其导致的共同结果是癌 细胞从其起源的器官分离并分散到不同器官。在这种肿瘤微环境下，癌细胞和癌症相关 细胞分泌多种生长因子、血管生成因子和蛋白酶，且它们引起癌症生长和血管生成和分解 胞外基质，以促进癌细胞侵袭和转移。另外，骨桥蛋白（OPN)、初黏素-C和基质细胞蛋白 有助于肿瘤转移，并调节正常或肿瘤干细胞的维持和扩张及肿瘤转移微环境（metastatic niche)。作为靶向癌症进展的特定阶段的替代选择，可以考虑选择在癌症发展的多个阶段 执行重要功能的分子并靶向其。在这些分子中，骨膜蛋白被认为是调节细胞粘附以及细胞 与基质相互作用的重要蛋白。
[0004] 骨膜蛋白是一种胞外基质蛋白，且其是参与细胞粘附的分泌蛋白，作为细胞因子 并通过细胞粘附分子整联蛋白〇^^ 3和ανβ5Κ导信号。最初，其被发现作为成骨细胞特 异性因子，并在骨组织的骨膜中高表达。由于骨膜蛋白在多种上皮癌诸如乳腺癌中过表达， 并且功能与恶性进展的关键阶段诸如转移和血管生成有关，最近骨膜蛋白日渐引起人们的 兴趣。尽管骨膜蛋白在正常乳腺细胞系中不表达，但表达在乳腺癌的情况下特异性增加。并 且，骨膜蛋白是转移性定殖、促进细胞存活、血管生成、以及肿瘤干细胞的维持过程中的重 要限制因子。很多临床研究显示骨膜蛋白的过表达以及骨膜蛋白血清浓度的增加与转移性 肿瘤生长和差的预后有关。另外，骨膜蛋白是转移性定殖过程中促进细胞存活、血管生成以 及肿瘤干细胞维持的重要限制因子。因此骨膜蛋白被证实是与肿瘤生长和转移的抑制相关 的有前景的候选物质。
[0005] 近20年来，生物靶向疗法已成为癌症治疗的主流。与甚至对正常细胞也表现出毒 性的现有疗法相比，靶向疗法作为更有效的疗法受到关注，因为其是更特异的且具有对正 常细胞的低毒性。基于核酸的适配体作为靶向治疗分子正在不断增加。适配体是单链DNA 或RNA，且非常紧密并特异性地结合靶分子。适配体通过被称作SELEX (指数富集的配基系 统进化技术，Systematic evlution of ligands by exponential enrichment)的重复筛 选方法发展，且其选择性地识别其靶，并使用特定的三维结构与其结合。适配体可通过与靶 的直接结合来调节蛋白靶的功能。由于短的核酸的特性，与其他的治疗手段相比，适配体具 有改善的稳定性、便于制备和修饰、低免疫原性和低毒性等方面的优势。因此，适配体的价 值在于被识别为基于低分子和抗体的疗法的替代选择。
[0006] 因此，对开发骨膜蛋白作为有前景的抗癌靶、与其特异性结合的适配体、以及使用 所述适配体的抗癌治疗技术存在日益增加的需求。
[0007] 公开内容
[0008] 技术问题
[0009] 因此，本发明的一个实施方案提供了与骨膜蛋白特异性结合并包含修饰的碱基的 骨膜蛋白适配体，所述修饰的碱基在dU (脱氧尿嘧啶）的5-位置处被选自由以下组成的组 的疏水性官能团取代：萘基、苄基、吡咯苄基、和色氨酸。
[0010] 另一个实施方案提供了用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含骨膜蛋 白适配体作为活性成分；用于治疗癌症的方法，所述方法包含对需要治疗癌症的患者施用 药学上有效量的骨膜蛋白适配体的步骤；以及骨膜蛋白适配体用于治疗癌症的用途。
[0011] 又另一个实施方案提供了用于诊断癌症的组合物，所述组合物包含骨膜蛋白适配 体作为活性成分；以及骨膜蛋白适配体用于诊断癌症的用途。
[0012] 又另一个实施方案提供了用于利用骨膜蛋白适配体提供关于癌症诊断的信息的 方法。
[0013] 技术方案
[0014] 本发明人开发了称为PNDA-3的修饰的DNA适配体并完成了本发明，所述PNDA-3 可以以高亲和力与癌细胞分泌的骨膜蛋白结合。还证实了 TONA-3阻断整联蛋白（ανβ3 和ανβ5)与骨膜蛋白之间的相互作用，并抑制骨膜蛋白的生物功能。本文提供的数据 显示结合骨膜蛋白的PNDA-3抑制乳腺癌细胞中的粘附、迁移、和侵袭能力，降低整联蛋白 ανβ3-和ανβ5-依赖的信号转导途径的活化，并阻断细胞表面受体的相互作用。还证实 了 PNDA-3的施用降低了乳腺癌转移小鼠模型中乳腺癌的生长、转移和血管生成。因此，本 发明的适配体可用作抗癌物质，用于抑制实体癌诸如乳腺癌的生长和/或转移。
[0015] 本发明的一个目的是提供与同癌症发展和转移相关的骨膜蛋白高度特异性结合 的骨膜蛋白适配体，从而抑制癌症和/或癌症转移或使得能够诊断癌症；以及包含所述适 配体作为活性成分的癌症和/或癌症转移的抑制剂和癌症诊断剂。
[0016] 本发明提供了特异性结合骨膜蛋白的DNA适配体、包含其作为活性成分的癌症或 癌症转移的抑制剂或用于诊断癌症或癌症转移的组合物；以及利用其用于抑制（治疗）癌 症或癌症转移的方法和用于诊断癌症的方法。
[0017] 骨膜蛋白可来源于哺乳动物优选人类，并且例如其可以是登录号NP_Q15063-人 类、NP_056599-小鼠、NP_001102020. 1-大鼠等，例如NP_Q15063-人类（人类骨膜蛋白）。
[0018] 骨膜蛋白适配体可包含修饰的碱基，其可具有25至100、优选30至80、更优选35 至50的包含修饰的碱基的总的碱基长度，且其特异性结合骨膜蛋白。在本发明的骨膜蛋白 适配体中，除非另有说明，除了修饰的碱基之外的碱基选自由以下组成的组：A、G、C、T、以及 其脱氧形式（例如，2' -脱氧形式）。
[0019] 修饰的碱基指dU (脱氧尿嘧啶）的5-位置处被疏水性官能团取代的修饰形式，并 且其可被用于代替碱基'Τ'。疏水性官能团可以是选自由以下组成的组的至少一种：萘基、 苄基、吡咯苄基、和色氨酸等。如此，由于dU的5-位置被疏水性官能团取代并修饰，与骨膜 蛋白的亲和力与未修饰的情况相比显著增加。
[0020] 骨膜蛋白适配体中修饰的碱基数目可以是5至20、优选10至17。
[0021] 在具体实施方案中，骨膜蛋白适配体可具有25至80、优选30至65、更优选35至 50的总的碱基长度，包含选自由SEQ ID N0:5至SEQ ID N0:40(核酸序列中的'η'是修饰 的碱基或'Τ'，特别地是修饰的碱基）组成的组的至少一个核苷酸序列。
[0022] 在具体实施方案中，骨膜蛋白适配体可仅由选自由SEQ ID N0:5至SEQ ID N0:40 组成的组的至少一个核苷酸序列组成，或者其还可在核苷酸序列的5'端、3'端或两端包 括由3至25、特别地5至20个碱基组成的核苷酸序列，因此具有30至120、35至100或 45至90的总的碱基长度。还被包含在5'端、3'端或两端的核苷酸序列可选自由SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:4组成的组。例如，骨膜蛋白适配体可在选自由SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:40组成的组的至少一个核苷酸序列的5'端包含ACGAG(SEQ ID NO: 1)、在3'端包含 AACAA(SEQIDN0:2)，或者其可在5'端包含GATGTGAGTGTGTGACGAG(SEQIDN0:3)并在3' 端包含 AACAACAGAACAAGGAAAGG(SEQ ID N0:4)，但并不仅限于此。
[0023] 在具体实施方案中，本发明的骨膜蛋白适配体可具有以下SEQ ID N0:45或SEQ ID NO: 46的核苷酸序列：
[0024] 5,-ACGAG-[N]-AACAA-3'（SEQ ID N0:45)
[0025] (N是适配体的可变核心序列，并由25至80、优选30至65个、更优选35至50个 碱基组成，且各碱基独立地选自由A、C、G、其脱氧形式以及修饰的碱基组成的组，所述修饰 的碱基在dU(脱氧尿嘧啶）的5'-位置被疏水性官能团（例如选自由萘基、苄基、吡咯苄基 和色氨酸组成的组中的至少一种）取代）。
[0026] 5'-GATGTGAGTGTGTGACGAG-[N]-AACAACAGAACAAGGAAAGG-3 , (SEQ ID NO :46)
[0027] (N是适配体的可变核心序列，并由25至80、优选30至65个、更优选35至50个 碱基组成，且每个碱基独立地选自由A、C、G、其脱氧形式以及在dU(脱氧尿嘧啶）的5'-位 置被疏水性官能团（例如选自由萘基、苄基、吡咯苄基和色氨酸组成的组中的至少一种）取 代）的修饰的碱基组成的组。
[0028] 如以上说明的，N可选自由SEQ ID NO: 5至SEQ ID NO: 40组成的组。
[0029] 在本文描述的核苷酸序列中以及在所附的核苷酸序列（SEQ ID N0:5至SEQ ID N0:44)中，除非另有说明，'η'指'Τ'或在5'位置被疏水性官能团取代的dU(脱氧尿嘧啶） 的修饰形式、优选在5-位置被疏水性官能团取代的dU (脱氧尿嘧啶）的修饰形式。疏水性 官能团是选自由苄基、萘基、吡咯苄基、色氨酸等组成的组的至少一种。
[0030] 而且，骨膜蛋白适配体可在5'端、3'端或两端被修饰以提高血清稳定性（参见 实施例2、3和4)。骨膜蛋白适配体可通过在5'端、3'端或两端结合选自由以下组成的组 的至少一种被修饰：PEG(聚乙二醇）、idT(反向脱氧胸苷，inverted deoxythymidine)、 LNA(锁核酸，Locked Nucleic Acid)、2' -甲氧基核苷、2' -氨基核苷、2' F-核苷、胺接头 (linker)、硫醇接头、和胆固醇等。在优选的实施方案中，骨膜蛋白适配体可包含附着于5' 端的PEG(聚乙二醇；例如分子量为500-50, OOODa)、附着于3'端的idT(反向脱氧胸苷）、 或者附着于5'端的PEG(例如，分子量为500-50, OOODa)和附着于3'端的idT(反向脱氧 胸苷）。
[0031] idT(反向脱氧胸苷）是用于防止具有低核酸酶耐受性的适配体被核酸酶分解的 分子之一。尽管核酸单位结合前一个单位的3' -OH与后一个单位的5' -OH而形成链，但 是idT结合前一个单位的3' -OH与后一个单位的3' -0H，导致人工改变，使得5' -OH而非 3' -OH外露，从而抑制了一种核酸酶3'外切核酸酶的分解。
[0032] 证实了本发明的骨膜蛋白适配体表现出用于抑制癌细胞粘附、迁移和侵袭以及生 长的显著效应（参见实施例5至8)。
[0033] 因此，另一个实施方案提供了用于治疗癌症和/或抑制癌症转移的药物组合物， 该药物组合物包含上述骨膜蛋白适配体作为活性成分。药物组合物还可包含药学上可接受 的载体。又另一个实施方案提供了用于治疗癌症和/或抑制癌症转移的方法，该方法包括 对需要治疗癌症和/或抑制癌症转移的患者施用药学上有效量的上述骨膜蛋白适配体的 步骤。该方法还可在施用步骤前包括确认患者需要治疗癌症和/或抑制癌症转移的步骤。 又另一个实施方案提供了上述骨膜蛋白适配体用于治疗癌症和/或抑制癌症转移的用途。 [0034] 骨膜蛋白适配体或包含其的药物组合物可被配制成不同的剂型，用于口服施用或 肠胃外施用。
[0035] 例如，其可被配制成任何剂型用于口服施用，诸如片剂、药丸、硬/软胶囊、液体、 混悬剂、乳剂、糖浆、颗粒剂、酏剂等。用于口服施用的剂型除了包含活性成分之外，还可 根据各剂型的常见组成包含药学上可接受的载体诸如稀释剂诸如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露 醇、山梨醇、纤维素、和/或甘氨酸，或助滑剂（slip modifier)诸如二氧化硅、滑石、硬脂酸、 和其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇等。
[0036] 而且，如果用于口服施用的剂型是片剂，其可包含粘合剂诸如硅酸镁铝、淀粉糊、 明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮等，并且如果有必要， 可包含崩解剂诸如淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐、或恒沸混合物（a boiling mixture)和/或 吸收剂、着色剂、增味剂、或甜味剂等。
[0037] 而且，如果骨膜蛋白适配体或包含其的药物组合物被配制成用于肠胃外施用的剂 型，其可通过肠胃外施用途径诸如皮下注射、静脉注射、肌内注射、胸腔注射等被施用。为了 配制为用于肠胃外施用的剂型，药物组合物可在水中与活性成分即骨膜蛋白适配体以及稳 定剂或缓冲剂一起混合以制备溶液或悬液，并且溶液或悬液可被制备成安瓿或小瓶的单位 剂型。
[0038] 而且，药物组合物可被灭菌，或另外包含佐剂诸如防腐剂、稳定剂、水分散粉末 (water dispersible powder)、或乳化剂、用于调节渗透压的盐、和/或缓冲液等，且还可包 含其他治疗上有用的材料，且其可通过混合、制粒或包衣的常规方法来配制。
[0039] 而且，术语"药学上有效量"指能够表现出预期作用即预防和/或治疗癌症、或抑 制癌症转移的作用的活性成分的量。活性成分即骨膜蛋白适配体可以以每天〇. 1至500mg/ kg (体重）、优选0. 5至100mg/kg (体重）的有效量包含在药物组合物中，且药物组合物可 被分成每天两次或更多次并通过口服或肠胃外途径施用。
[0040] 通过本发明的骨膜蛋白适配体或包含其的药物组合物可被治疗的或其转移可被 抑制的癌症可包括所有种类的癌症，并例如，其可以是选自乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胆囊 癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、以及胶质母细胞瘤组成的组中的 至少一种。
[0041] 本发明的骨膜蛋白适配体或包含其的药物组合物的施用对象可以是哺乳动物包 括人类，且优选地，其可以是啮齿动物或人类。
[0042] 而且，由于在患有多种实体癌包括乳腺癌和结直肠癌以及癌症转移的患者中观察 到骨膜蛋白的过表达，骨膜蛋白适配体可用作用于诊断癌症和/或癌症转移的组合物。 [0043] 根据另一个实施方案，提供了骨膜蛋白适配体用于诊断癌症和/或癌症转移的用 途，和用于利用骨膜蛋白适配体提供关于癌症和/或癌症转移的诊断的信息的方法。
[0044] 用于提供关于癌症诊断信息的方法包括：
[0045] 使患者的生物样品与骨膜蛋白适配体反应；以及 [0046] 测量生物样品中骨膜蛋白适配体的结合程度，
[0047] 其中如果患者生物样品中骨膜蛋白适配体的结合程度高于正常样品，则患者被判 断为癌症患者。因此，该方法还可包括测量正常样品中骨膜蛋白适配体的结合程度的步骤。 [0048] 患者可以是哺乳动物包括人类，优选地啮齿动物或人类，且这意味着其中癌症发 展或癌症转移的受试者被判断出。
[0049] 可由该方法提供其诊断信息的癌症可包括所有种类的癌症，并例如，其可以是选 自由乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胆囊癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、头颈鳞状细胞癌、前列腺癌、以 及胶质母细胞瘤组成的组中的至少一种。
[0050] 正常样品可获自哺乳动物包括人类，优选地哨齿动物或人类，且这意味着从不具 有其诊断信息被提供的癌症，例如选自由以下组成的组的癌症发展的受试者获得的生物样 品：乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胆囊癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、头颈鳞状细胞癌、前列腺癌、以 及胶质母细胞瘤。
[0051] 生物样品可以是除了人类以外的哺乳动物身体、从哺乳动物包括人类分离的细 胞、组织、血液、唾液等。
[0052] 在生物样品中测量骨膜蛋白适配体结合程度的步骤可通过相关【技术领域】内通常 使用的DNA适配体结合测量技术进行，并例如，骨膜蛋白适配体的末端可用荧光或放射性 物质标记或与生物素连接以测量荧光或放射性强度，或者可对其成像并观察，但并不限于 此。
[0053] 根据一个具体实施方案，在这些骨膜蛋白适配体中，选择具有与骨膜蛋白的不 同结合区域并且不会妨碍彼此结合的一对适配体，将一个固定在基质上（捕获适配体 (capture aptamer))，并将另一个（检测适配体（detection aptamer))的末端用突光或放 射性物质标记（或者与能够发生荧光或放射性反应的物质结合），并测量强度，从而测量样 品中是否存在骨膜蛋白或者骨膜蛋白是否过表达。
[0054] 如此，当使用适配体证实样品中存在骨膜蛋白或骨膜蛋白过表达时，与使用现有 抗体的检测相比，显示非常出色的灵敏度。本发明的结合骨膜蛋白并抑制活性的新DNA适 配体，还结合纯化的蛋白以及癌细胞表面表达的骨膜蛋白（KdN InM)。本发明的适配体还 可结合小鼠骨膜蛋白和与骨膜蛋白具有结构相似性的其他蛋白诸如PIG-H3。本发明的适 配体可特异性结合细胞表面的所有种类的细胞表达骨膜蛋白，并抑制骨膜蛋白介导的信号 通路。而且，证实本发明的适配体有效抑制实体癌诸如乳腺癌的粘附、迁移和侵袭。数据强 烈显示了本发明的适配体在骨膜蛋白靶向的治疗和诊断中的多种生物医学应用。
[0055] 乳腺癌是最常见的癌症，并且是癌症死亡的第二原因。癌症转移是癌症相关死亡 的主要原因。特别地，大部分乳腺癌患者通常在转移进展后才被诊断出，并且不管是手术还 是化学疗法都显示约80%的复发率。因此，治疗癌症转移是癌症治疗的主要目标。癌细胞 应克服多种压力和限速步骤，使得转移在新器官的微环境中生长。已知癌细胞中过表达的 分子诸如骨膜蛋白促进转移和恶性肿瘤的进展。骨膜蛋白被认为是治疗实体癌诸如乳腺 癌的重要靶，因为其在血管生成和转移中执行重要功能并作为胞外基质蛋白具有好的可及 性。一些骨膜蛋白的抗体已被建议作为抗癌剂或放射性同位素载体以及人类癌症包括转移 的治疗策略。特别地，靶向骨膜蛋白的抗体体外影响癌细胞的增殖、迁移、侵袭和粘附，并且 体内具有抗增殖和抗转移作用。然而，由于这些抗体具有低亲和力（uM范围的Kd)，以及不 期望的药代动力学性质（例如，具有低的肿瘤侵袭能力并很快被清除），它们在应用于靶向 递送方面具有局限性，并因此，开发具有改善的药代动力学性质和血清稳定性的高亲和力 分子变得越来越重要。
[0056] 同时，DNA适配体可化学合成，并容易被修饰用于体内应用，并且具有出色的肿瘤 组织渗透性。因此，DNA适配体作为抗癌分子具有多种优势。由于天然寡核苷酸对核酸酶 的水解敏感，磷酸骨架的稳定性是DNA适配体生物医学应用的主要问题。尽管DNA适配 体被中性基团诸如甲基磷酸酯和氨基磷酸酯修饰以提高核酸酶耐受性，但是相比未修饰 的DNA适配体，修饰的DNA适配体显示较低的结合亲和力。为了提高结合亲和力并抵消缓 慢的解离速率，使用多种官能团修饰的核苷酸进行SELEX。得到的数据显示用苄基修饰的 DNA适配体显示与骨膜蛋白的高亲和力（ΙηΜ)，且交叉反应性被最小化。由于纯化的蛋白 和内源蛋白之间潜在的形态差异，当体内应用时选择的适配体不能总是与靶蛋白结合。所 以，为了鉴定显示体内活性的适配体，有必要将体内相关条件整合入筛选过程。本发明的 新骨膜蛋白DNA适配体（PNDA-3)特异性结合乳腺癌细胞表面表达的骨膜蛋白，同时其不 结合骨膜蛋白阴性的细胞系。基于细胞的方法的主要风险是用于筛选的细胞的起源生物 体的物种，且用于确认体内结合的测试动物模型的物种彼此不同。尽管用于配体筛选的人 类细胞或人类细胞系的使用符合最终的生物医学应用，配体与靶分子的结合特异性和亲和 力未能在测试动物模型中充分证明，并且未能进行临床前研究。因此，在本发明中，测试了 适配体与具有结构同质性（homogeneity)的不同蛋白的结合。尽管人类和小鼠之间存在 物种差异，适配体结合两种类型的蛋白，其被认为是由于人类骨膜蛋白和小鼠骨膜蛋白之 间的高序列和结构同质性（92%)。如此，由于适配体与骨膜蛋白的结合不依赖于物种，配 体的性质可在多种小鼠疾病模型中被证实并提供用于生物医学使用。在人类中，已知四 种蛋白包含fas-Ι结构域。β IG-3H和骨膜蛋白是具有4个fas-Ι结构域的分泌蛋白，且 stabilin-1和stabilin-2是具有7个fas-Ι结构域的膜蛋白。尽管这些蛋白的生物学功 能未被完全认知，由于所有fas-Ι结构域都包含整联蛋白相互作用的酪氨酸-组氨酸（YH) 基序（integrin-interactive tyrosine-hystidine (YH)motif)，表明行使调节细胞-基质 相互作用功能的可能性。本发明的适配体阻断骨膜蛋白与整联蛋白的相互作用。通过完全 抑制骨膜蛋白与细胞系表面的整联蛋白的结合并抑制相互作用，本发明的适配体功能上阻 断骨膜蛋白的作用。
[0057] 而且，本发明的分离的适配体可用于诊断骨膜蛋白介导的转移或分子水平的成 像。适配体特异性结合小鼠骨膜蛋白以及人类骨膜蛋白。在来源于正常乳腺组织或正常乳 腺上皮细胞的永生化细胞系中，未检测到骨膜蛋白的表达。然而，根据基因阵列数据和蛋白 质组分析数据，与正常乳腺组织相比，在大多数乳腺癌样品中骨膜蛋白的表达增加20倍或 更多。而且，在具有骨转移的乳腺癌患者的情况下，骨膜蛋白的血清浓度显著增加。因此，该 适配体可有效地用于癌症患者中转移可能性和癌症预后的体外测量。在本发明中，生物素 标记的适配体可被用于从多种蛋白混合物中特异性检测骨膜蛋白。而且，荧光物质（Cy3_) 结合的适配体可特异性检测从乳腺癌转移的小鼠模型和实际的乳腺癌患者分离的组织中 的骨膜蛋白。与抗体相比，本发明的DNA适配体显示被肿瘤（= >肿瘤细胞）的快速吸收、 更快速的血液清除、和更持久的肿瘤保留，因此使能够以高的肿瘤与血液的比显著成像。因 此，本发明的适配体可有效用于肿瘤转移的身体微环境中骨膜蛋白分泌细胞的体内成像。
[0058] 分泌的骨膜蛋白作为用于通过细胞粘附蛋白和细胞粘附分子（ανβ3和α νβ5整 联蛋白）进行信号转导的细胞因子。骨膜蛋白促进EGFR(表皮生长因子受体）的募集和 Akt/PKB和FAK-介导的信号传导通路的激活。本发明的适配体通过抑制骨膜蛋白与整联蛋 白的结合来抑制细胞内信号的激活。在本发明中，通过TIR荧光显微镜证实适配体结合细 胞表面表达的骨膜蛋白，并抑制与整联蛋白的相互作用。而且，根据利用结构域缺失的突变 体蛋白证实结合能力的结果，可以看出适配体结合fas-Ι结构域，其对与整联蛋白的结合 是重要的。
[0059] 整联蛋白α νβ 3和α νβ 5的刺激激活PI-3激酶和FAK介导的信号传导通路。一 致地，在乳腺癌细胞系4Τ1和MDA-MB-231中，适配体强烈地减弱由骨膜蛋白引起的FAK和 Src的磷酸化。已报道骨膜蛋白通过整联蛋白ανβ3激活Akt/PKB信号传导通路以促进结 肠癌中癌细胞存活。然而，本发明适配体的治疗不会影响Akt磷酸化和细胞存活。因此，可 以解释，适配体的FAK和Src磷酸化抑制能力是由于抑制骨膜蛋白-整联蛋白复合物的形 成。
[0060] 已报道了关于骨膜蛋白在癌细胞增殖中作用的多种结果。结直肠癌细胞和胆管癌 细胞的增殖受重组骨膜蛋白的增加诱导。相反，卵巢癌细胞系和乳腺癌细胞系中骨膜蛋白 的异常表达对细胞增殖无影响，或更确切地说抑制细胞增殖。最近利用胰腺癌细胞的研究 结果表明，骨膜蛋白可在肿瘤发生过程中发挥双向影响。本发明展示的体外细胞增殖数据 显示，本发明的适配体对细胞增殖无影响，其意味着骨膜蛋白在乳腺癌中并不是促增殖因 子。
[0061] 骨膜蛋白的过表达影响转移相关的功能以及癌症生长。临床数据显示在很多晚期 癌症患者中发现骨膜蛋白的过表达，且这也与患者的差的预后相关。而且，如果向小鼠模型 中注射骨膜蛋白过表达癌细胞系，则观察到癌症转移的促进。最近，有报道称，对应于转移 起始的EMT(上皮-间质转化）过程受骨膜蛋白调节。骨膜蛋白促进癌细胞粘附、迁移和侵 袭，其是癌症转移的主要功能。在本发明中，已证实骨膜蛋白诱导的癌细胞粘附、迁移和侵 袭被骨膜蛋白适配体处理抑制。换言之，该适配体具有抑制癌症转移的功能。
[0062] 总之，该适配体可用作设计新种类的抗癌剂的先导化合物，且其可被添加至靶向 骨膜蛋白过表达癌症的抑制剂的储备（repertory)。本发明首次表明抑制骨膜蛋白功能的 适配体在乳腺癌转移中具有显著的抑制作用。
[0063] 发明的有益效果
[0064] 本发明提供的骨膜蛋白适配体抑制骨膜蛋白和整联蛋白的相互作用，以阻断信号 传导通路，并抑制癌细胞粘附、增殖、迁移、和侵袭，并因此，其可有效用作抗癌剂和/或用 于诊断癌症。

【专利附图】

【附图说明】
[0065] 图1显示了根据一个实施例骨膜蛋白DNA适配体（PDNA)与骨膜蛋白的结合能力， 并显示了利用32P-标记的PNDA和不同浓度的人类重组骨膜蛋白（直至IOOnM)测量的结合 亲和力的结果。
[0066] 图2显示了根据一个实施例PNDA与骨膜蛋白的特异性相互作用，其中2A是显示 PNDA竞争性结合重组人类骨膜蛋白（rhPN)的图，2B是显示适配体与结构相似的蛋白的结 合特异性的结果，以及2C和2D是显示利用生物素结合的TONA只能从不同的蛋白复合物集 合中特异性检测骨膜蛋白，并且这一反应是浓度依赖性的。
[0067] 图3显示了根据一个实施例PNDA结合细胞表面上表达的骨膜蛋白并抑制与整联 蛋白的相互作用，其中3A是显示适配体结合骨膜蛋白阳性细胞系4T1的结果，3B是骨膜蛋 白阴性细胞系MCF7的结果，以及3C是显示PNDA抑制骨膜蛋白和整联蛋白相互作用的TIR 荧光显微镜结果。
[0068] 图4A和4B是显示根据一个实施例PNDA结合骨膜蛋白fas-Ι结构域的结果。 [0069] 图5显示根据一个实施例PNDA对乳腺癌细胞粘附、迁移和侵袭的抑制作用，其 中5A是细胞粘附测定的结果，5B是显示PNDA对乳腺癌细胞迁移的作用的结果，5C是 Matrigel侵袭测定的结果，且是证实PNDA对用于实验的乳腺癌细胞系毒性的结果。
[0070] 图6显示了根据一个实施例PNDA对骨膜蛋白依赖的信号通路的抑制，其中6A是 在4T1细胞中的结果，且6B是在MDA-MB-231细胞中的结果。
[0071] 图7示意性地显示了根据一个实施例的PNDA的功能。
[0072] 图8A至8E显示了根据一个实施例PNDA的乳腺癌细胞生长和转移抑制的体内结 果，其中8A是显示根据PNDA处理的肿瘤大小变化的图，8B是显示根据PNDA处理的小鼠模 型的体重变化的图，8C是显示根据PNDA处理的乳腺癌向肺部转移的抑制的照片（箭头指示 结节（nodule))，8D是定量8C的肺部结节的图，且8E是显示根据PNDA处理的肺组织H&E 染色的显微镜照片。
[0073] 图9A至9C显示了根据一个实施例PNDA对肿瘤细胞生长和血管生成的体内作用， 其中9A是显示根据PNDA处理的原发性肿瘤切片的免疫染色结果的显微镜照片，且9B和9C 是定量显示利用Ki-67抗体（9B)和⑶31抗体（9C)的免疫组织化学实验结果的图。
[0074] 实施发明的方式
[0075] 下文将参考实施例、比较实施例和实验实施例详细解释本发明。然而，提供这些实 施例、比较实施例和实验实施例仅帮助理解本发明，且本发明的范畴和范围不限于此。
[0076] 参考实施例
[0077] 抗体和试剂的准备
[0078] 人类骨膜蛋白和小鼠骨膜蛋白购买自R&D system(Minneapolie, MN)。整联蛋 白ανβ3和ανβ5抗体购买自Millipore(Temecula,CA,USA)。蛋白质印迹使用的抗体如 下：Anti-ERK、phosphor-ERK、AKT、phosphor-AKT、FAK、phosphor-FAK、SRC、phosphor-SRC Ab (cell signaling, Beverly, ΜΑ) > β -肌动蛋白 Ab (Santa Cruz Biotechmology, Snata Cruz, CA)〇
[0079] 细胞培养
[0080] MCF7、MDA-MB-231人类乳腺癌细胞系、4T1小鼠乳腺癌细胞系、以及人类胚肾细胞 293T从美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection) (Manassas, VA, USA) 获得。MCF7细胞在补充有10%胎牛血清（Gibco)、盘尼西林（100单位/ml, Gibco)、和链 霉素（100单位/ml，Gibco)的RPMI-1640(Lonza)培养基中于37°C和5% CO2条件下培 养。MDA-MB-231、HEK 293T、4T1细胞在补充有10%胎牛血清（Gibco)、盘尼西林（100单 位 /ml)、和链霉素（100 单位 /ml)的 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（Dulbecco' s modified Eagle's medium, Lonza)中于37°C和5% CO2条件下培养。为了去除血清，用I XPBS洗漆 MCF7、MDA-MB 231和4T1细胞3次，并在无血清培养基（DMEM或RPMI-Lonza)中于37°C下 培养20小时，以上准备的骨膜蛋白、整联蛋白抗体及以下的适配体通过以下各实施例中描 述的方法处理。
[0081] 实施例1 :抗骨膜蛋白DNA适配体的体外选择
[0082] 为了制备SELEX所需的单链修饰的DNA文库，合成了 5'带有生物素的反义文库 [5'-生物素-d(CCTTTCCTTGTTCTGTTGTT-N40-CTCGTCACACACTCACATC)-3'（SEQIDN0:47)]。 将反义文库与 50uM 5' 引物（GATGTGAGTGTGTGACGAG;SEQ ID N0:48)、0.5mM dNTP(ATP、 GTP、CTP、Bz-dU)、0.25U/ul KOD XL(Invitrogen)、10X 延伸缓冲液（I. 2MTris-HCl ρΗ7· 8、 IOOmM KCl、60mM(NH4)2S04、70mM MgS04、l%Triton X-100，lmg/ml BSA)在 70°C下反应 I 小 时，来制备双链DNA。单链修饰的DNA文库用20mM NaOH洗脱，且然后用HCl溶液中和。将 Inmol 合成的文库加入选择缓冲液（200mM HEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)，分 别在95°〇、701：、481：、371：下反应5分钟，且然后与1(^1^的10\蛋白竞争缓冲液（1(^皿 凝血素、10 μ M酪蛋白、0. 1% (w/v)HSA(人类血清白蛋白，SIGMA))混合用于阴性选择，且然 后加入到移出的上清液Hexa-His结合至其的Talon珠（50% (w/v))浆并在37°C下反应10 分钟。
[0083] 阴性选择后，只取上清液并转移到新的管中，且然后与骨膜蛋白结合的Talon珠 于 37°C 下反应 1 小时。用 IOOyL 选择缓冲液（200mM HEPES、510mM NaCl、25mM KCl、25mM MgCl2)洗涤结合有DNA-骨膜蛋白复合物的Talon珠5次。在第5次洗涤时，将其转移到新的 平板并洗漆。加入85yL 2mM的NaOH溶液以洗脱祀结合文库（target-binding library), 且然后，用20 μ L 8mM HCl溶液中和。
[0084] 使用QPCR(定量PCR，IQ5多色实时PCR检测系统，Bio-rad)扩增靶结合文库。将5' 引物（GATGTGAGTGTGTGACGAG，SEQ ID N0:48)和 3'引物（生物素-CCTTTCCTTGTTCTGTTGTT， 生物素 -SEQ ID N0:49) (5XQPCR master Mix, Novagen)各 5uM、0.075U/ul KOD(Novagen)、 lmMdNTP(Roche Applied science)、25mM MgC12、5XSYBR green I (Invitrogen)混合，使 得总体积变为125μ L，并重复96°C 15秒、55°C 10秒和68°C 30分钟的I个循环，以及96°C 15 秒和72°C 1分钟的30个循环以制备双链文库。
[0085] 将通过QPCR制备的DNA文库与25 μ L Myone SA珠（Invitrogen)在室温下混合10 分钟以固定。混合的DNA的量是60μ1 QPCR产物。加入20mMNa0H溶液，以制备单链DNA。 并且，包括修饰的核酸的DNA通过与文库制备相同的方法合成，并用于下一轮。进行8轮 SELEX，并且为了更多的选择性结合，从第4至第6轮以及第7至第8轮，将DNA-蛋白（骨 膜蛋白）复合物在IOmM DxSO4(Sigma)溶液中稀释至1/200、1/400,并选择DNA适配体。
[0086] 实施例2 :与骨膜蛋白相互作用的DNA适配体的选择以及相互作用测试
[0087] 成功进行SELEX循环后，使用TA克隆试剂盒（SoIGent)克隆最终获得的DNA 集合。并使用存在于载体上的M13引物（CAGGAAACAGCTATGAC ; SEQ ID NO: 50)进行 测序以获得以下序列。高度特异性结合获得的骨膜蛋白的DNA适配体具有核酸序列 5'-GATGTGAGTGTGTGACGAG-[核心序列]-AACAACAGAACAAGGAAAGG-3'（SEQIDN0:46)，其中 核心序列如以下表1所示，且η代表苄基-dU。
[0088] 表 I
[0089]

【权利要求】
1. 一种骨膜蛋白适配体，所述骨膜蛋白适配体特异性结合骨膜蛋白且为25至100个碱 基的长度，包含5至20个在dU (脱氧尿嘧啶）的5-位置被选自由以下组成的组的疏水性 官能团取代的修饰的碱基：萘基、苄基、吡咯苄基和色氨酸。
2. 根据权利要求1所述的骨膜蛋白适配体，其中所述骨膜蛋白适配体为25至100个碱 基的长度，包含选自由SEQ ID NO:5至SEQ ID N0:40组成的组的核苷酸序列，其中所述核 苷酸序列中的n是在dU(脱氧尿嘧啶）的5-位置被选自由以下组成的组的疏水性官能团 取代的修饰的碱基：萘基、苄基、吡咯苄基和色氨酸。
3. 根据权利要求1所述的骨膜蛋白适配体，其中所述骨膜蛋白适配体包含在5'端、3' 端或两端的由3至25个碱基组成的附加的核苷酸序列且由共30至120个碱基组成。
4. 根据权利要求3所述的骨膜蛋白适配体，其中在5'端、3'端或两端的所述附加的核 苷酸序列选自由SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:4组成的组。
5. 根据权利要求4所述的骨膜蛋白适配体，其中所述骨膜蛋白适配体由以下核苷酸序 列 SEQ ID N0:45 或 SEQ ID N0:46 表示： 5'-ACGAG-[N]-AACAA-3'（SEQ ID N0:45)或 5'-GATGTGAGTGTGTGACGAG-[N]-AACAACAGAACAAGGAAAGG-3, (SEQ ID NO :46), 在所述核苷酸序列中，'N'由25至80个碱基组成，每个碱基独立地选自由A、C、G、脱 氧形式的A、C、和G、和在dU (脱氧尿嘧啶）的5-位置被萘基、苄基、吡咯苄基和色氨酸取代 的修饰的碱基组成的组，且所述修饰的碱基的数目为5至20。
6. 根据权利要求5所述的骨膜蛋白适配体，其中所述'N'为选自由SEQ ID NO: 5至SEQ ID NO:40组成的组的核苷酸序列。
7. 根据权利要求6所述的骨膜蛋白适配体，其中所述骨膜蛋白适配体由选自由SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:44组成的组的核苷酸序列表示。
8. 根据权利要求2所述的骨膜蛋白适配体，其中所述骨膜蛋白适配体包含在5'端、3' 端或两端的由3至25个碱基组成的附加的核苷酸序列，且由共30至120个碱基组成。
9. 根据权利要求1至8中任一项所述的骨膜蛋白适配体，其中所述骨膜蛋白适配体通 过将选自由以下组成的组的至少一种结合到所述骨膜蛋白适配体的5'端、3'端、或两端被 修饰：PEG(聚乙二醇）、idT(反向脱氧胸苷）、LNA(锁核酸）、2' -甲氧基核苷、2' -氨基核 苷、2' F-核苷、胺接头、硫醇接头和胆固醇。
10. -种用于治疗癌症或抑制癌症转移的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利 要求1至8中任一项所述的骨膜蛋白适配体作为活性成分。
11. 根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述骨膜蛋白适配体通过将选自由以下 组成的组的至少一种结合到所述骨膜蛋白适配体的5'端、3'端、或两端被修饰：PEG(聚乙 二醇）、idT(反向脱氧胸苷）、LNA(锁核酸）、2' -甲氧基核苷、2' -氨基核苷、2' F-核苷、 胺接头、硫醇接头和胆固醇。
12. 根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述癌症是选自由以下组成的组的至少 一种：乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胆囊癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌 和胶质母细胞瘤。
13. -种用于诊断癌症或癌症转移的药物组合物，包含权利要求1至8中任一项所述的 骨膜蛋白适配体作为活性成分。
14. 根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述骨膜蛋白适配体通过将选自由以下 组成的组的至少一种结合到所述骨膜蛋白适配体的5'端、3'端、或两端被修饰：PEG(聚乙 二醇）、idT(反向脱氧胸苷）、LNA(锁核酸）、2' -甲氧基核苷、2' -氨基核苷、2' F-核苷、 胺接头、硫醇接头和胆固醇。
15. -种用于提供关于癌症或癌症转移诊断的信息的方法，所述方法包括以下步骤： 将受试者的生物样品与权利要求1至8中任一项所述的骨膜蛋白适配体反应；以及 测量骨膜蛋白适配体在所述生物样品中的结合程度， 其中如果骨膜蛋白适配体在所述受试者的生物样品中的结合程度比正常样品高，则所 述患者被确定为癌症患者。
16. 根据权利要求1至8中任一项所述的骨膜蛋白适配体用于癌症或癌症转移诊断的 用途。
17. 根据权利要求16所述的用途，其中所述骨膜蛋白适配体通过将选自由以下组成的 组的至少一种结合到所述骨膜蛋白适配体的5'端、3'端、或两端被修饰：PEG(聚乙二醇）、 idT(反向脱氧胸苷）、LNA(锁核酸）、2' -甲氧基核苷、2' -氨基核苷、2' F-核苷、胺接头、 硫醇接头和胆固醇。
18. -种用于治疗癌症或抑制癌症转移的方法，所述方法包括对需要治疗癌症或抑制 癌症转移的受试者施用药学上有效量的权利要求1至8中任一项所述的骨膜蛋白适配体。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述骨膜蛋白适配体通过将选自由以下组成的 组的至少一种结合到所述骨膜蛋白适配体的5'端、3'端、或两端被修饰：PEG(聚乙二醇）、 idT(反向脱氧胸苷）、LNA(锁核酸）、2' -甲氧基核苷、2' -氨基核苷、2' F-核苷、胺接头、 硫醇接头和胆固醇。
20. 根据权利要求18所述的方法，其中所述癌症是选自由以下组成的组的至少一种： 乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胆囊癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌和胶 质母细胞瘤。
21. 权利要求1至8中任一项所述的骨膜蛋白适配体用于治疗癌症或抑制癌症转移的 用途。
22. 根据权利要求21所述的用途，其中所述骨膜蛋白适配体通过将选自由以下组成的 组的至少一种结合到所述骨膜蛋白适配体的5'端、3'端、或两端被修饰：PEG(聚乙二醇）、 idT(反向脱氧胸苷）、LNA(锁核酸）、2' -甲氧基核苷、2' -氨基核苷、2' F-核苷、胺接头、 硫醇接头和胆固醇。
23. 根据权利要21所述的用途，其中所述癌症是选自由以下组成的组的至少一种：乳 腺癌、结直肠癌、肺癌、胆囊癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌和胶质 母细胞瘤。
【文档编号】A61K48/00GK104411825SQ201280074467
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2012年11月12日 优先权日:2012年7月2日
【发明者】徐判吉, 金一信, 李侑真, 金润东, 蔡荣灿, 林钟勋, 柳成浩 申请人:国立大学法人蔚山科学技术大学校产学协力团, 浦项工科大学校产学协力团