黑枸杞有效提取物、提取方法以及提取物应用的制作方法

专利名称：黑枸杞有效提取物、提取方法以及提取物应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及国际专利分类A61K36/815枸杞属或C07D杂环化合物的处理技术领域，尤其是黑枸杞有效提取物、提取方法以及提取物应用。
背景技术：
现有技术中，枸杞是重要的经济植物及药食兼用的佳品，属于茄科，枸杞属落叶灌木。这一属有80多种，在我国分布的有宁夏枸杞、枸杞、黑果枸杞、新疆枸杞、截萼枸杞、柱筒枸杞、云南枸杞7种枸杞。其中，传统药用价值的有3种,分别是黄果枸杞或宁夏枸杞变种、北方枸杞或枸杞变种、红枝枸杞或新疆枸杞变种3个变种。另外，新近引入药用的黑果枸杞。黑枸杞是野生爺科枸杞属植物,是黑果枸杞Lycium ruthenicumMurr的干燥果实，维吾尔文称阿勒卡特。黑枸杞属棘刺落叶小灌木，株高20-50厘米，是喜光树种，全光照条件下发育健壮，在庇荫条件下生长细弱，花果极少，适应性·很强，在盐碱荒地、盐化沙地、盐湖岸边、渠道两旁、河滩等各种盐溃化土壤中生长良好，能耐38.5°C的高温，耐寒性也很强，在-25.6°C低温条件下无冻害，在荒漠地仍能生长耐干旱，黑果枸杞是我国西北部分地区一种特有的野生植物资源，其浆果球形，成熟后的紫黑色，无毒有甜味。已知其药性与宁夏枸杞有相似之处，具有明目益肝，抗疲劳、美容、抑制肿瘤的作用。采用原子吸收法测定黑果枸杞中钙、镁、铜、锌、锰、铁、铅、镍、镉、钴、铬、钾、钠等元素的含量，结果表明:黑果枸杞中钠含量与其相当，但钙、镁、铜、锌、铁等元素的含量远高于宁夏枸杞中相应各元素的平均含量，钾、锰含量远低于其平均值，钴含量远高于绿叶蔬菜的含量，铬含量较牛奶中含量低，镍含量比谷物、腌肉、蔬菜中的高，尤其是，黑枸杞中铅、镉含量较一般植物中的0.5
3.0 μ g/g含量低得多。黑枸杞是天然补钴剂，钴对人体具有低毒和参与维生素B12组成和刺激造血的作用，黑果枸杞中钴的含量，远高于绿叶蔬菜的干重含量0.2 0.6ppm，但该浓度范围尚不会对人体构成毒害威胁，黑果枸杞具有作为单纯意义的补钴剂药物的作用。黑枸杞是天补镍剂铬、镍也都是人体所，必需的微量元素，但含量较高时会产生中毒现象，铬与人体中糖的代谢，脂质的代谢，蛋白质的合成，核酸代谢等有密切的关系。黑枸杞中铬的含量比正常牛奶中含量低(5 15ug/ml)，不会对人体产生中毒现象。镍在人体作为生物配体辅因子，促进肠内三价铁的吸收，黑果枸杞中镍的含量比谷物腌肉蔬菜(0.1
0.3 μ g/g)中的要高，但该浓度范围也不会对人体构成毒害威胁，因此黑果枸杞又具有作为单纯意义的补镍剂药物作用。黑枸杞其成熟浆果中富含紫红色色素，不仅可以作为天然食用色素使用，而且具有一定的生物活性，属于典型的天然花色苷类植物色素资源，具有优异的抗氧化、调血脂作用，同时，黑果枸杞果实多糖也具有一定的抗疲劳、降血糖的生物功效。黑果枸杞鲜果资源量丰富。同时，黑果枸杞测定rDNA-1TS全序列，已在Genbank注册，序列号为AY880681，从分子水平为该植物的鉴定提供了 DNA指纹图谱依据。
传统医学关于黑枸杞的功效论述黑枸杞能滋补肝肾、益精明目、适用于腰膝酸软、头晕目眩、两眼昏花等症状，藏医药经典《四部医典》、《晶珠本草》等记载黑果枸杞主治心热病、心脏病、月经不调、停经等。《维吾尔药志》记载维吾尔医常用黑果枸杞果实及根皮治疗尿道结石、癣疥、齿龈出血等症，民间作滋补强壮以及降压药。现代科学研究证实了上述说法，并且认为黑果枸杞可以降低胆固醇，兴奋大脑神经，增强免疫功能，防治癌症，抗衰老和美容，黑果枸杞提取物可促进细胞免疫功能，增强淋巴细胞增殖及肿瘤坏死因子的生成，对白细胞介素II有双向调解作用，能缓解糖尿病患者多饮多食、体重减轻症。黑果枸杞内含的有效提取物知识得到少量公开，对柴达木野生黑果枸杞果实中的主要营养成分进行了分析，结果表明，黑果枸杞鲜果含水质量分数85.03%，其干果蛋白质量分数10.61 %，脂肪6.66 %，多糖4.28 %，总黄酮质量分数4.29 %，原花青素3.42 %，果实含有Y-VE及δ-VE，每百克分别为0.0075和0.016mg，从黑果枸杞籽中提取的构祀籽油维生素E含量较果实要高的多，籽油富含a-VE、γ-VE及δ-VE，每百克分别为0.1906mg、
1.8939mg和0.045mg，黑果枸杞中氨基酸种类相对较丰富，亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸等含量相对较高，黑果枸杞中矿质元素丰富，其中钾的含量最高，且远高于钠的含量，属于高钾低钠的食品。为探讨该资源色素提取和精制技术条件，公开的文章中列举了部分提取方法。比如，成熟浆果中富含紫红色色素，属于典型的天然花色苷类植物色素资源。采用单因素比较和正交实验法，得到黑果枸杞色素的最佳提取条件为:以PH3.0的80%乙醇作浸提剂，提取温度50°C，提取时间3h，固液配比1: 40;用X-5大孔吸附树脂对色素进行精制，以树脂柱径高比1: 15、流速3mL/min、pH3.0、色素液浓度lg/L为最佳吸附条件，色素吸附量可达0.03715g/mL湿树脂体积；而以95% 7醇做洗脱液，在pH2.0、流速5mL/min、3倍于柱床体积的洗脱液条件下解吸附效果最佳，色素回收率达到97.78% ;制取的色素产品外观呈紫红色，色价为36.7。该方法简单易行，具有很好的重复性，色素产率达到9.07%。并且进一步证明，在上述技术条件下制取 的色素理化性质研究表明，黑果枸杞色素Pigment ofLyciumruthenicum Murr.,简称:PLR属花色苷类,为水溶性色素,在酸性条件下,具有一定的耐热性能，但耐氧化性能不佳；对室内、外自然光与紫外光的耐受性较好；对还原剂有一定的耐受性；适用PH范围广，尤以酸性状态色泽最佳；蔗糖和防腐剂以及金属离子Zn2+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+对色素稳定性无不良影响，而Fe2+、Fe3+、Cu2+、A13+、Pb2+、Sn2+则随离子浓度增加而对色素的不利影响加大。当向色素液中加入稳定剂(0.04%维生素則+0.01(%单宁酸+0.01%半胱氨酸)后，即可提高色素耐热性。毒理学实验证明，PLR对KM小鼠的LD50大于24g/kg BW，说明该受试物属于无毒级物质。遗传毒性试验=Ames试验、骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸变试验的结果皆为阴性，未显示出致突变性。而30天喂养试验表明，PLR在2.4g/kg、l.2g/kg、0.24g/kg BW剂量时，对动物的身体、脏器的生长发育以及血液生化指标等均无明显不良影响。而且，色素中的有害微量元素含量均低于国家卫生标准。由此说明黑果枸杞色素具有食用安全性。在药理学研究中体外抗氧化实验表明，PLR具有一定的抗氧化能力，表现出很强的DPPH自由基清除活性，IC50达到0.164mg/mL ;能显著的抑制小鼠红细胞溶血，IC50为0.112mg/mL ;能增强小鼠血清抗活性氧能力，抑制小鼠肝组织脂质过氧化产物MDA生成和小鼠肝线粒体肿胀度，并显示出一定的量效关系。高脂血症预防实验显示，PLR可降低小鼠血清总TC和TG、LDL-C的含量，升高血清和肝组织T-AOC、GSH-PX活性，显著降低肝组织MDA含量(P < 0.05)，说明黑果枸杞色素对高脂血症小鼠血脂水平升高和脂质过氧化均有一定抑制作用。另外，公开的黑果枸杞果实多糖的制备以及抗疲劳、降血糖的生物功效实验结果包括:1.确定了 80%乙醇前处理去除低分子糖的实验条件，优化了热水浸提黑果枸杞果实多糖的提取工艺。研究了温度、固液配比和时间对低分子糖去除效果的影响，确定了去除低分子糖的最佳条件为:提取温度为70°C，固液配比1: 8，提取时间为40min;研究了提取温度、提取时间和提取次数对黑果枸杞果实多糖提取的影响，确定了黑果枸杞果实多糖提取的最佳条件为:提取温度为90°C，提取时间为60min，提取3次。在上述条件下，三次提取黑果枸杞果实多糖平均得率为(3.67 ±0.31) %，黑果枸杞果实粗多糖含量为46.62%。2.对黑果枸杞果实多糖抗疲劳功效进行了检验。通过对小鼠进行低、中、高三个黑果枸杞果实多糖剂量的灌胃并与对照组比较，结果表明:黑果枸杞果实多糖能延长小鼠负重游泳时间，增强小鼠血清与肝脏超氧化物歧化酶SOD活力，降低小鼠血清与肝脏丙二醛MDA的含量，提高小鼠肝糖元、肌糖原的储备量，降低小鼠运动后血清尿素氮和血乳酸水平，说明黑果枸杞果实多糖具有抗疲劳作用。3.对黑果枸杞果实多糖降血糖功效进行了检验。通过对小鼠进行低、中、高三个黑果枸杞果实多糖剂量的灌胃，腹腔注射四氧嘧啶后，黑果枸杞果实多糖剂量组与糖尿病模型组比较，血糖含量明显降低；通过对糖尿病小鼠，血糖> 11.lmmol/L，进行低、中、高三个黑果枸杞果实多糖剂量的灌胃并与糖尿病模型组、盐酸二甲双胍组比较，结果表明:黑果枸杞果实多糖能显著降低糖尿病小鼠血糖含量，增强糖尿病小鼠血清与肝脏超氧化物歧化酶SOD活力，降低糖尿病小鼠血清与肝脏丙二醛MDA的含量，并促进糖尿病小鼠的葡萄糖转变为肝糖元。说明黑果枸杞果实多糖对糖尿病有防治作用，虽然降糖效果弱于盐酸二甲双胍，但提高糖尿病小鼠机体抗氧化能力的效果优于盐酸二甲双胍；黑果枸杞果实多糖对糖尿病小鼠多饮多食、体重减轻的症状也有一定的缓解作用。另外，公开的黑果枸杞黄酮`类化合物属植物次级代谢产物，天然无毒，具有多种生物活性。部分黄酮类化合物兼有抗氧化和降血脂作用，对预防动脉粥样硬化具有广阔的应用前景。从其叶中提取总黄酮，对总黄酮抗氧化和降血脂生物功效进行研究，为预防动脉粥样硬化提供新药来源，为黑果枸杞开发利用提供理论依据。主要研究内容及结果如下:1.采用显色反应和紫外光谱法对黑果枸杞叶浸提液总黄酮进行鉴定。用分光光度法测定总黄酮含量，通过单因素最佳值筛选和多因素正交试验，得出从黑果枸杞叶中提取总黄酮的最佳工艺条件为:用60%的乙醇作溶剂，固液比为1: 25，70°C下提取40min，提取率达0.23%，粗制品总黄酮含量达0.14%。2.通过6种大孔树脂静态吸附和解吸附试验比较，结果表明AB-8型大孔树脂较适合于精制黑果枸杞总黄酮。选用该树脂精制黑果枸杞总黄酮的最佳条件为0.20mg/mL、pH= 5.0的黑果枸杞总黄酮溶液上柱，流速为2.0mL/min，用95%乙醇洗脱，流速4.0mL/min、用量为5倍柱床体积，总黄酮回收率达79.82%。采用该工艺分离精制的黑果枸杞总黄酮含量为2.80%，比粗制品提高了 20倍。3.通过体外化学反应体系得出黑果枸杞总黄酮具有还原能力、清除OH的能力和抗脂质体过氧化反应的活性。与生物大分子相结合反应得出黑果枸杞总黄酮可以抑制红细胞溶血、增强小鼠血清清除OH的能力，降低小鼠肝脏MDA含量。4.通过高脂血症模型小鼠体内试验得出，黑果枸杞总黄酮可以降低高脂血症小鼠血浆TC、TG和LDL-C含量，升高HDL-C含量，说明其具有降血脂功效。黑果枸杞总黄酮还可以提高小鼠血浆T-A0C、肝脏GSH-Px、S0D活力，降低MDA含量，说明其也具有体内抗氧化生物活性，可以作为预防AS的新药来源。5.依据文献报道芦丁、槲皮素、木犀草素、异鼠李素和山奈素是抗氧化和降血脂的常见黄酮成分。试验通过薄层层析和高效液相色谱分析得出黑果枸杞总黄酮亦含有此5种黄酮成分，在精制品中含量分别为0.8870%,0.0414%,0.0411%,0.0258%和0.0448%。5种黄酮成分的总量达精制品的1.04%,占黑果枸杞总黄酮含量的37.14%。黑果枸杞总黄酮的抗氧化和降血脂生物活性可能是这5种黄酮成分发挥作用的结果。公知技术中，对于前述问题的研究和改进的可参考文献较少，尤其是相关专利文献也不多，比如，中国专利申请200510066480.2黑果枸杞植物果实提取物及其制备方法和应用以黑果枸杞植物的果肉、果皮及果核为原料，将新鲜的原料或是干燥粉碎后的原料经醇浸、回流、浓缩、树脂吸附、洗脱、浓缩后得液状提取物，或干燥制成粉末状固体得粉状提取物。中国专利申请201210341955.4涉及一种提取黑果枸杞果总黄酮提取物及制备方法。黑果枸杞果总黄酮提取物是用如下方法制得，用水、含水或者不含水的甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇或其它的液体有机化合物之一种或几种的混合物作提取溶剂，以黑果枸杞果:提取溶剂为1: 5-30的重量比进行配比，把配比后的黑果枸杞果和提取溶剂进行混合，再经浸泡、煎熬或回流提取、过滤去渣、浓缩回收有机试剂得浸膏，然后对浸膏进行分离纯化得黑果枸杞果总黄酮提取物。中国专利申请201210356006.3锐孔法制备黑果枸杞色素微胶囊的方法，包括以下步骤:以黑果枸杞鲜果或黑果枸杞干果为原料，破碎，酸性乙醇浸提，微波提取仪中提取，过滤后将残渣用酸性乙醇再 提取2-3次，合并提取液，减压浓缩得到色素浓缩液；将所述色素浓缩液经大孔树脂吸附、洗脱、解吸、减压浓缩后，按比例加入包埋剂，固化、过滤、复膜、过滤、返浸，在40-50°C的条件下常压干燥，得到黑果枸杞色素微胶囊。经此工艺制得的黑果枸杞色素微胶囊包埋率在70% 80%，黑果枸杞色素经微胶囊化后，具有缓释作用，24h内可以释放色素在70%以上，且保持形态完整，黑果枸杞色素微胶囊在75%的相对湿度环境中的稳定性明显提高，微胶囊的吸湿增重小于10%。中国专利申请201210341954.X黑果枸杞果总黄酮提取物在制备具备降血压、降血糖或降血脂功效的食品添加剂、保健品或药品上的新用途。即黑果枸杞果总黄酮提取物在治疗或预防高血压病、高血脂病、高血糖病的食品、保健品和药品制备过程中作为添加剂使用的新用途，添加剂黑果枸杞果总黄酮提取物在治疗或预防高血压病、高血脂病、高血糖病的食品、保健品和药品中的重量含量为0.5-100%。中国专利申请201010571739.X从黑果枸杞果实中提取花色苷的方法，该方法包括以下步骤:⑴将黑果枸杞果实原料用PH值为I 4的乙醇溶液浸提取I 30小时后，过滤，得到浸提液；(2)将所述步骤(I)所得的浸提液进行真空浓缩后，得到固形物浓度>40%的浓缩液；(3)将所述步骤(2)所得的浓缩液采用大孔树脂吸附后，用乙醇水溶液洗脱，当洗脱液颜色变深时开始收集，则得到纯化的黑果枸杞果实花色苷提取液；(4)将所述步骤(3)所得的黑果枸杞果实花色苷提取液进行真空浓缩后，得到固形物浓度>60%的浓缩液；该浓缩液经冷冻干燥后，即得黑果枸杞果实花色苷。中国专利申请201010542518.X抗氧化黑果枸杞提取物制备方法，该方法以黑果枸杞干燥果实为原料，经水浸提，胶体磨研磨及高压均质，再用微滤陶瓷膜除去杂质，经过大孔树脂分离、干燥，得到抗氧化黑果枸杞提取物。中国专利申请201010525734.3黑果枸杞原花青素产品，该产品以黑果枸杞鲜果为原料，经分离纯化后得到的低聚原花青素含量为40% 70%、高聚体原花青素含量为10 % 35 %、其它杂质为10 % 40 %的淡紫红色粉末产品。中国专利申请201010241351.3 一种黑果枸杞原花青素提取物的制备方法，该方法以黑果枸杞果汁或黑果枸杞浓缩液为原料，经非极性大孔吸附树脂分离后，用去离子水洗脱至无糖，再用盐酸-乙醇溶液洗脱，得到含有原花青素的洗脱液；然后将含有原花青素的洗脱液经真空减压浓缩或纳滤膜浓缩后，得到原花青素浓缩液；最后将浓缩液经喷雾干燥或冷冻干燥后，即可得到原花青素含量> 50%、总多酚含量> 50%、花色苷含量> 1%的的黑果枸杞原花青素提取物。可见，细分的适宜工业应用的黑果枸杞的有效物提取技术仍然缺乏。

发明内容
本发明的发明目的在于提供一种黑枸杞有效提取物、提取方法以及提取物应用技术，适宜工业应用，更加全面开发黑果枸杞有效提取物经济价值。实现本发明的发明目的措施在于:将黑枸杞进一步真空干燥，粉碎，加入含1%Hcl的95%乙醇，回流2次，每次I小时；过滤，滤液于75°C旋蒸至稠，转移至蒸发皿中，水浴蒸干，于70°C真空干燥2小时，得干浸膏；加甲醇定容，过0.45um有机系微孔滤膜；提取原花青素；或者，将黑枸杞进一 步真空干燥，粉碎，加入含95%乙醇，回流2次，每次I小时；过滤，滤液于75°C旋蒸至稠，转移至蒸发皿中，水浴蒸干，于70°C真空干燥2小时，得干浸膏；加甲醇定容，过0.45um有机系微孔滤膜；提取原花青素。本发明的优点在于，采用科学合理的提取方法进一步揭示开发黑果枸杞果提取物具有降血糖、降血脂和降血压活性的新用途，为在治疗或预防糖尿病、高血脂和高血压的产品中有效充分应用提供新的技术措施。不但缩短了提取分离的时间，减少了工艺过程中的能耗，有效降低了生产成本，而且所得产品纯度高、性能稳定，提取物杂质少，质量优良，可应用具有抗氧化作用的医药保健品原料。


图1是本发明中是实例7中的原花青素标准曲线2:是本发明中是实例7中的标准品、供试品800_200nm全波长扫描峰标准品与黑1、黑2样品UV对照
具体实施例方式本发明中，将黑枸杞进一步真空干燥，粉碎，加入含1% Hcl的95%乙醇，回流2次，每次I小时；过滤，滤液于75°C旋蒸至稠，转移至蒸发皿中，水浴蒸干，于70°C真空干燥2小时，得干浸膏；加甲醇定容，过0.45um有机系微孔滤膜；提取原花青素；或者，将黑枸杞进一步真空干燥，粉碎，加入含95%乙醇，回流2次，每次I小时；过滤，滤液于75°C旋蒸至稠，转移至蒸发皿中，水浴蒸干，于70°C真空干燥2小时，得干浸膏；加甲醇定容，过0.45um有机系微孔滤膜；提取原花青素。本发明采用植物学、分子生物学、植物化学、食品卫生学、药理学等学科相结合的研究方法，对黑果枸杞的原植物、色素、多糖、的提取精制工艺、主要化学成分类型、稳定性及其抗氧化、调血脂等方面作系统的研究，最终确定黑果枸杞色素不仅可以作为天然食用色素使用，而且具有一定的生物活性。以下通过实施例和附图进一步说明。实施例1:采用黑果枸杞干浸膏或由此提取的原花青素为有效物制得用于高脂血症治疗的黑果枸杞色素药物。采用单因素比较和正交实验法，得到黑果枸杞色素的最佳提取条件为:以pH3.0的80%乙醇作浸提剂，提取温度50°C，提取时间3h，固液配比1: 40 ;用X-5大孔吸附树脂对色素进行精制，以树脂柱径高比1: 15、流速3mL/min、pH3.0、色素液浓度lg/L为最佳吸附条件，色素吸附量可达0.03715g/mL湿树脂体积；而以95% 7醇做洗脱液，在pH2.0、流速5mL/min、3倍于柱床体积的洗脱液条件下解吸附效果最佳,色素回收率达到97.78% ;制取的色素产品外观呈紫红色，色价为36.7。该方法简单易行，具有很好的重复性，色素产率达到 9.07%。在上述技术条件下制取的色素理化性质研究表明，黑果枸杞色素PigmentofLycium ruthenicum Murr,简称:PLR,属花色苷类,为水溶性色素,在酸性条件下,具有一定的耐热性能，但耐氧化性能不佳；对室内、外自然光与紫外光的耐受性较好；对还原剂有一定的耐受性；适用PH范围广，尤以酸性状态色泽最佳；蔗糖和防腐剂以及金属离子Zn2+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+ 对色素稳定性无不良影响，而 Fe2+、Fe3+、Cu2+、A13+、Pb2+、Sn2+ 则随离子浓度增加而对色素的不利影响加大。当向色素液中加入稳定剂，0.04%维生素B1+0.01%单宁酸+0.01%半胱氨酸后，即可提高色素耐热性。毒理学实验证明，PLR对KM小鼠的LD50大于24g/kg Bff,说明该受试物属于无毒级物质。遗传毒性试验:Ames试验、骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸变试验的结果皆为阴性，未显示出致突变性。而30天喂养试验表明，PLR在2.4g/kg、1.2g/kg、0.24g/kg BW剂量时，对动物的身体、脏器的生长发育以及血液生化指标等均无明显不良影响。而且，色素中的有害微量元素含量均低于国家卫生标准。由此说明黑果枸杞色素具有食用安全性。在药理学研究中体外抗氧化实验表明，PLR具有一定的抗氧化能力，表现出很强的DPPH自由基清除活性，IC50达到0.164mg/mL ;能显著的抑制小鼠红细胞溶血，IC50为0.112mg/mL ;能增强小鼠血清抗活性氧能力，抑制小鼠肝组织脂质过氧化产物MDA生成和小鼠肝线粒体肿胀度，并显示出一定的量效关系。高脂血症预防实验显示，PLR可降低小鼠血清总TC和TG、LDL-C的含量，升高血清和肝组织T-A0C、GSH-PX活性，显著降低肝组织MDA含量P < 0.05，说明黑果枸杞色素对高脂血症小鼠血脂水平升高和脂质过氧化均有一定抑制作用。实施例2:采用黑果枸杞干浸膏或由此提 取的原花青素为有效物制得用于清除DPPH自由基、-OH和-O2均具有较好的治疗的黑果枸杞色素保健药物。
利用超声-微波协同萃取法提取黑果枸杞色素，并用分光光度法检测黑果枸杞色素对DPPH自由基、羟自由基-OH和超氧阴离子自由基-02的清除能力；结果表明，黑果枸杞色素溶液对DPPH自由基、-OH和-02均具有较好的清除作用。对黑果枸杞色素的理化性质和稳定性进行了研究，结果表明黑果枸杞色素易溶于水，属于花色苷类色素；在酸性条件下，对热有一定的耐受性，耐可见光和紫外光的性能也较好，蔗糖和防腐剂苯甲酸钠对该色素稳定性无影响，而氧化剂H202对色素的稳定性有不良影响，还原剂Na2S03对色素的影响不显著，而金属离子Fe2+、Fe3+、Cu2+和Sn2+离子对色素的稳定性具不良影响。实施例3:以黑果枸杞果实为原料，乙醇为提取剂，探讨了乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度等单因素对黑果枸杞色素提取效果的影响:在单因素试验的基础上，通过L16(45)正交试验，确定黑果枸杞色素的最佳提取工艺.结果表明黑果枸杞色素的最佳提取工艺为乙醇体积分数50%，提取时间60min，料液比1: 12，提取温度50°C。采用邻二氮菲_Fe2+氧化法，邻苯三酚自氧化法测定了黑果枸杞提取物的抗氧化作用；结果表明，不同溶剂的黑果枸杞提取物对自由基均有一定的清除作用，对羟自由基-OH的清除率60 %乙醇> 95 %乙醇 > 丙酮 >含盐酸0.5 %的95 %乙醇；对超氧阴离子-02-自由基的清除率9 5%乙醇> 60%乙醇>含盐酸0.5%的95%乙醇>丙酮；该结果提示黑果枸杞的提取物具有抗氧化的作用。实施例4:黑果枸杞果实中含有的多糖的制备以及抗疲劳、降血糖的生物功效，采用黑果枸杞干浸膏提取的多糖有效物制得用于抗疲劳、降血糖的黑果枸杞多糖药物，实验结果如下:1.确定了 80%乙醇前处理去除低分子糖的实验条件，优化了热水浸提黑果枸杞果实多糖的提取工艺。研究了温度、固液配比和时间对低分子糖去除效果的影响，确定了去除低分子糖的最佳条件为:提取温度为70°C，固液配比1: 8，提取时间为40min;研究了提取温度、提取时间和提取次数对黑果枸杞果实多糖提取的影响，确定了黑果枸杞果实多糖提取的最佳条件为:提取温度为90°C，提取时间为60min，提取3次。在上述条件下，三次提取黑果枸杞果实多糖平均得率为(3.67 ±0.31) %，黑果枸杞果实粗多糖含量为46.62%。2.对黑果枸杞果实多糖抗疲劳功效进行了检验。通过对小鼠进行低、中、高三个黑果枸杞果实多糖剂量的灌胃并与对照组比较，结果表明:黑果枸杞果实多糖能延长小鼠负重游泳时间，增强小鼠血清与肝脏超氧化物歧化酶SOD活力，降低小鼠血清与肝脏丙二醛MDA的含量，提高小鼠肝糖元、肌糖原的储备量，降低小鼠运动后血清尿素氮和血乳酸水平，说明黑果枸杞果实多糖具有抗疲劳作用。3.对黑果枸杞果实多糖降血糖功效进行了检验。通过对小鼠进行低、中、高三个黑果枸杞果实多糖剂量的灌胃，腹腔注射四氧嘧啶后，黑果枸杞果实多糖剂量组与糖尿病模型组比较，血糖含量明显降低；通过对糖尿病小鼠，血糖> 11.lmmol/L，进行低、中、高三个黑果枸杞果实多糖剂量的灌胃并与糖尿病模型组、盐酸二甲双胍组比较，结果表明:黑果枸杞果实多糖能显著降低糖尿病小鼠血糖含量，增强糖尿病小鼠血清与肝脏超氧化物歧化酶SOD活力，降低糖尿病小鼠血清与肝脏丙二醛MDA的含量，并促进糖尿病小鼠的葡萄糖转变为肝糖元。说明黑果枸杞果实多糖对糖尿病有防治作用，虽然降糖效果弱于盐酸二甲双胍，但提高糖尿病小鼠机体抗氧化能力的效果优于盐酸二甲双胍；黑果枸杞果实多糖对糖尿病小鼠多饮多食、体重减轻的症状也有一定的缓解作用。从黑果枸杞果实中提取多糖，研究黑果枸杞果实多糖的抗疲劳作用及其最佳用量，以昆明系小自鼠为实验受体，分高、中、低3个剂量组进行喂养，分别从小白鼠体重Body Weights, BW、游泳时间Swimming Time, ST、血清和肝脏超氧化物歧化酶Blood/LiverSuperoxide Dismutase, SOD、血清和肝脏丙二醒Blood/Liver MDA、肝糖原和肌糖原 Blood/Liver Glycogen、血清尿素氮 Blood Urea Nitrogen, BUN、血乳酸 Blood Lactic Acid, BLA等10个指标进行研究；结果表明:多糖浓度为10 50mg/ (kg d)时能够明显增加小白鼠游泳时间P < 0.01，增加血清和肝匀浆SOD活性P < 0.01，降低血清和肝匀浆MDA含量P<0.01，增加肝糖原和肌糖原含量P < 0.05，减少血清BUN和BLA含量P < 0.0I，P < 0.05。比较不同提取方法对黑果枸杞多糖的提取效果；方法采用常规水浴法、超声法、微波法、超声-微波协同萃取法提取多糖，用蒽酮-硫酸比色法测定其含量；结果四种方法提取的黑果枸杞多糖含量分别为:9.64%,5.70%,7.35%、10.89% ;提取效果为:超声-微波协同萃取法>常规水浴提取法>微波提取法>超声波提取法；结论采用超声-微波协同萃取法提取黑果枸杞多糖效果好。采用超声-微波协同萃取法从黑果枸杞中提取多糖，并用蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量；结果表明用超声-微波协同萃取法提取，测得黑果枸杞多糖含量为10.89%，平均回收率为100.07%, RSD = 1.89% (η = 3);该方法简单、快速、准确。分析不同枸杞子样品中枸杞多糖的含量；采用硫酸苯酚法测定，结果为，不同种枸杞子中多糖含量顺序是:云南枸杞> 宁夏枸杞>柱筒枸杞>枸杞>新疆枸杞>截萼枸杞>北方枸杞>黄果枸杞>黑果枸杞>红枝枸杞，不同产地枸杞子样品含量顺序是:宁夏>新疆> 内蒙古>青海>河北> 陕西> 山西>甘肃，栽培枸杞子样品枸杞多糖含量大于野生样品；结论包括:枸杞子中的枸杞多糖含量:栽培样品高于野生，宁夏及其周边地区和全国主要栽培基地产的样品高于其他地区，宁夏枸杞的样品高于其他种。实施例5:采用水浴法、微波辅助提取法与超声一微波协同萃取法提取黑果枸杞叶片多糖，确定最适提取方法.通过单因素试验和正交试验确定最优提取工艺.采用蒽酮一硫酸法测定多糖含量.结果表明:最佳提取方法为超声一微波协同萃取法.最优提取条件是:料液比为1: 25，提取温度为90°C，提取时间为30min，多糖平均提取率为10.07%，RSD:1.60% (η = 3).回收率 100.7%, RSD = 1.84% (η = 3)。黑果枸杞多糖具有多种生理功效，用苯酚-硫酸法对黑枸杞多糖含量进行了测定。结果显示，测得多糖平均含量为16.74%，平均回收率为103.2%, RSD = 2.61% (η =3)。实施例6:优化黑果枸杞花色苷色素的提取方法，以色素含量为指标，通过提取溶齐U、辐射功率、提取时间、料液比和浸泡时间5个因素，对黑果枸杞花色苷色素提取效果的影响进行了单因素实验和正交实验，各因素对黑果枸杞花色苷色素含量的影响依次为:料液比>乙醇浓度>辐射功率>提取时间>浸泡时间；黑果枸杞花色苷色素的优化提取条件为:提取溶剂75%乙醇，辐射功率70W，提取时间20min，料液比1: 50，浸泡时间20h，在此条件下花色苷色素提取率为15.32%，总花色苷含量936.27mg/100g ;该方法具有操作简单、提取时间短、提取率闻等优点。

为研究黑果枸杞色素的提取方法与其抗氧化活性，利用常规水浴法、超声波、微波、超声-微波协同萃取4种提取方法提取黑果枸杞色素，用DPPH法测定色素提取物的抗氧化活性，并与维生素C、E进行比较；结果表明，4种提取物对DPPH自由基均有较强的清除作用，其大小顺序依次为超声-微波协同萃取法提取物>常规水浴法提取物>微波法提取物>超声波提取物.研究认为，采用超声-微波协同萃取法提取的黑果枸杞色素抗氧化活性好。选用75%乙醇作提取溶剂，采用正交设计试验，研究提取温度、提取时间和料液比对黑果枸杞色素提取条件的影响；结果表明，黑果枸杞色素提取的优化工艺条件为温度60°C，时间30min，料液比1: 20 ;该条件下色素粗品得率为65.62%。探讨黑果枸杞色素对实验性小鼠高脂血症的调节作用及脂质过氧化的影响；方法:将ICR雄性小鼠按体重和血脂水平随机分成6组，分别接受正常饲料、高脂饲料、高脂饲料加辛伐他汀、高脂饲料加黑果枸杞色 素，低、中、高剂量分别为100、200、400mg/kg处理；喂养6w，测定血清总胆固醇TC、甘油三脂TG、高密度脂蛋白胆固醇HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C和机体总抗氧化能力T-A0C、超氧化物歧化酶SOD活性、谷光甘肽过氧化物酶GSH-PX活性、丙二醛MDA水平等指标.结果:与高脂组小鼠相比，给予黑果枸杞色素可降低小鼠血清总TC和TG、LDL-C的含量，升高血清和肝组织T-AOC、GSH-PX活性，显著降低肝组织MDA含量P < 0.05 ;但对血清HDL-C和血清、肝组织中SOD活性未见显著影响p > 0.05 ;结论:黑果枸杞色素对高脂血症小鼠血脂水平升高和脂质过氧化均有一定抑制作用。本试验以新疆地产黑果枸杞果实为试验材料，通过单因素实验和正交实验，对影响色素提取效果的各因素进行研究。确定黑果枸杞色素的最佳提取工艺为:以PH3.0的75%乙醇作浸提剂，超声功率为400w、提取时间为lOmin、固液配比为1: 30。在此条件下，色素粗提取率为40.98g色素/IOOg干果,平均色价为4.65 士 0.44。对732强酸型阳离子交换树脂吸附分离黑果枸杞色素的条件与方法进行了研究，结果表明:以pH3.0黑果枸杞色素水溶液上样，上样速度为2ml/min，以1.5mol/L盐酸作为洗脱液，洗脱流速为lml/min的工艺条件制取的色素纯化产品色泽鲜丽，外观呈紫红色，品质优良，色素经纯化后平均色价为37.61 ± 1.246。本试验以全血中谷光甘肽过 氧化物酶GSH-PX活力升高率为药理效应指标，采用药理效应法对黑果枸杞色素在健康家兔体内进行了药动学研究，结果如下:1、以75、100、125mg/kg.b.w三个剂量分别单剂量灌服黑果枸杞色素。由时间-效应数据得出三个剂量给药后的主要效应动力学参数:75mg/kg.b.w组:药效消除半衰期tl/2(E) = 2.75711，药效呈现速率常数1^ ) = 1.594/h，药效消除速率常数Kel (E)=0.251/h，药效呈现半衰期 tl/2Ka(E) = 0.435h，药效达峰时间 Tp (E) = 1.5h; IOOmg/kg.b.w组:药效消除半衰期tl/2 (E) = 4.35311，药效呈现速率常数1^ ) = 1.45/h，药效消除速率常数Kel (E) = 0.159/h，药效呈现半衰期tl/2Ka = 0.478h，药效达峰时间Tp (E)=1.5h ;125mg/kg.b.w组:药效消除半衰期tl/2(E) = 3.826h，药效呈现速率常数Ka(E)=1.568/h, Kel(E) = 0.181/h, tl/2Ka (E) = 0.442h，药效达峰时间 Tp (E) = 1.5h。由上可知(I)黑果枸杞色素在兔体内的tl/2(E)、tl/2Ka(E)在一定范围内与剂量呈正相关，但当剂量为125mg/kg.bw其tl/2(E)、tl/2Ka(E)反而较低剂量组更短；⑵在一定剂量范围内，所用黑果枸杞色素剂量小，Ka(E)、Kel (E)值大，剂量增大，Ka(E)、Kel (E)值反而更小；
(3)黑果枸杞色素在体内的Tp(E)值与给药剂量无关。
2、研究了 75mg/kg.b.w剂量组黑果枸杞色素在兔体内的表观动力学参数，结果表明:黑果枸杞色素在家兔体内的时间-药物体存量数据符合一级吸收二室模型，W=I/Ce，拟合方程为:C = 227.645-0.656t+38.552-0.018t_235.508-0.962t ;主要药动学参数如下:吸收速率常数Ka = 0.962/h，消除速率常数β = 0.018/h，吸收半衰期tl/2Ka =0.72h，药物分布半衰期tl/α = 1.057h，药物消除半衰期tl/β = 37.64h，表观分布容积V1/F = 0.68L/kg，0-t药时曲线下面积AUC (0-t) = 521.129mg/L*h，单剂量给药后的最高血药浓度 Cmax = 72.19mg/L。此外，对黑果枸杞色素的临床给药剂量进行了探讨，结果表明:黑果枸杞色素在28.70mg/kg.b.w和100mg/kg.b.w的剂量范围内对兔全血中的GSH-PX活力的升高作用具有一定的量效关系。其量效方程Y = 64.2812X-93.7151，r = 0.9742，由量效方程计算最低起效剂量Xmin = 28.70mg/kg.b.W0建议在临床上兔口服黑果枸杞色素28.70mg/kg.b.w 100mg/kg.b.w 给药为宜。研究黑果枸杞色素作为食用色素使用的毒理学安全性，方法:利用小鼠急性毒性试验、Ames试验、骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸变试验和30d喂养试验进行毒理学研究，结果:急性毒性试验表明，黑果枸杞色素的KM小鼠LD50大于24g/kg bw,说明该受试物属于无毒级物质；遗传毒性试验=Ames试验、骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸变试验的结果皆为阴性，未显示出致突变性；而30(1喂养试验表明，黑果枸杞色素在2.4、1.2、0.248/1^ bw剂量时，对动物的身体、脏器的生长发育以及血液生化指标等均无明显不良影响.结论:黑果枸杞色素具有较好的食用安全性，可以作为药食两用天然色素使用。

利用超声-微波协同萃取法提取黑果枸杞色素，并用分光光度法检测黑果枸杞色素对DPPH自由基、羟自由基(OH)和超氧阴离子自由基(02_)的清除能力；结果表明，黑果枸杞色素溶液对DPPH自由基、OH和02_均具有较好的清除作用。对黑果枸杞色素的理化性质和稳定性进行了研究，结果表明黑果枸杞色素易溶于水，属于花色苷类色素；在酸性条件下，对热有一定的耐受性，耐可见光和紫外光的性能也较好，蔗糖和防腐剂苯甲酸钠对该色素稳定性无影响，而氧化剂H202对色素的稳定性有不良影响，还原剂Na2S03对色素的影响不显著，而金属离子Fe2+、Fe3+、Cu2+和Sn2+离子对色素的稳定性具不良影响。实施例7:1.配制标准品溶液；原花青素标准品溶液的配制:精密称定原花青素标准品17.94mg，加甲醇定容于5ml容量瓶中，得3.588mg/ml标准品溶液；2.配制供试品溶液；I)黑枸杞；a.将一包自然风干的黑枸杞称量得33.4g，70°C真空干燥2小时后称得30.2g，研碎称量得29.2g粉末，均分为两份，每份14.6g ;分别用不同的工艺进行实验；b.工艺一；14.6g粉末+150ml含1% Hcl的95%乙醇，其中，含1% Hcl的95%乙醇由146ml95%乙醇+4ml 37.5Hcl配制；回流2次，每次I小时；过滤，滤液于75°C旋蒸至稠，转移至蒸发皿中，水浴蒸干，于70°C真空干燥2小时，得7.5g干浸膏；标记为:黑I ;c.工艺二；14.6g粉末+150ml 95%乙醇回流2次，每次I小时；过滤，滤液于75°C旋蒸至稠膏，转移至蒸发皿中，水浴蒸干，于70°C真空干燥2小时，得10.2g干浸膏。(标记为:黑2 ；d.按Ig生药量的标准取用相应的浸膏量，经过换算:取黑1，精密称定为
0.5554g，加甲醇定容至50ml，得供试品溶液；取黑2，精密称定0.7649g，加甲醇定容至50ml，得供试品溶液，过0.45um有机系微孔滤膜后进样；e.分别取适量原花青素标准品溶液于IOml容量瓶中，加入I %香草醒溶液
2.25ml，该溶液由0.1g香草醛固体+IOml Hcl配制，8% Hcl溶液1.75ml，用甲醇定容，摇匀，室温避光显色20min后用空白甲醇作参比，进行测定，绘制标准曲线，计算曲线方程；空白样品的配制:取适量甲醇，同法加入各种试剂后，甲醇定容，摇匀；f.移取1.0ml供试品溶液于IOml容量瓶中，加入I %香草醛溶液2.25ml, 8% Hcl溶液1.75ml，用甲醇定容，摇匀，室温避光显色20min后用空白甲醇作参比，进行测定。4.UV测定原花青素含量方法及相应结果；I)标准曲线的绘制；精密称定原花青素17.94mg用甲醇定容于5ml容量瓶中，得浓度为3.588mg/ml标准品溶液，取相应量的标准品溶液按照2.1中e方法处理，UV测定结果如下:
权利要求
1.黑枸杞有效提取物、提取方法以及提取物应用，其特征是:将黑枸杞进一步真空干燥，粉碎，加入含1% Hcl的95%乙醇，回流2次，每次I小时；过滤，滤液于75°C旋蒸至稠，转移至蒸发皿中，水浴蒸干，于70°C真空干燥2小时，得干浸膏；加甲醇定容，过0.45um有机系微孔滤膜；提取原花青素；或者，将黑枸杞进一步真空干燥，粉碎，加入含95%乙醇，回流2次，每次I小时；过滤，滤液于75°C旋蒸至稠，转移至蒸发皿中，水浴蒸干，于70°C真空干燥2小时，得干浸膏；加甲醇定容，过0.45um有机系微孔滤膜；提取原花青素。
2.如权利要求1所述的黑枸杞有效提取物、提取方法以及提取物应用，其特征在于，以色素含量为指标，通过提取溶剂、辐射功率、提取时间、料液比和浸泡时间5个因素，对黑果枸杞花色苷色素提取效果的影响进行了单因素实验和正交实验，各因素对黑果枸杞花色苷色素含量的影响依次为:料液比>乙醇浓度>辐射功率>提取时间>浸泡时间；黑果枸杞花色苷色素的优化提取条件为:提取溶剂75%乙醇，辐射功率70W，提取时间20min，料液比1: 50，浸泡时间20h，在此条件下花色苷色素提取率为15.32%，总花色苷含量936.27mg/100g。
3.如权利要求2所述的黑枸杞有效提取物、提取方法以及提取物应用，其特征在于，采用超声-微波协同萃取法提取的黑果枸杞色素抗氧化活性好。
4.如权利要求1所述的黑枸杞有效提取物、提取方法以及提取物应用，其特征在于，采用黑果枸杞干浸膏或由此提取的原花青素为有效物制得用于高脂血症治疗的黑果枸杞色素药物。
5.如权利要求1所 述的黑枸杞有效提取物、提取方法以及提取物应用，其特征在于，采用黑果枸杞干浸膏或由此提取的原花青素为有效物制得用于清除DPPH自由基、-OH和-O2均具有较好的治疗的黑果枸杞色素保健药物。
6.如权利要求1所述的黑枸杞有效提取物、提取方法以及提取物应用，其特征在于，当向黑果枸杞干浸膏或由此提取的原花青素色素液中加入稳定剂，0.04%维生素B1+0.01%单宁酸+0.01%半胱氨酸后，即可提高色素耐热性。
7.如权利要求1所述的黑枸杞有效提取物、提取方法以及提取物应用，其特征在于，采用黑果枸杞干浸膏提取的多糖有效物制得用于抗疲劳、降血糖的黑果枸杞多糖药物。
全文摘要
黑枸杞有效提取物、提取方法以及提取物应用，将黑枸杞进一步真空干燥，粉碎，加入95%乙醇回流2次，每次1小时；过滤，滤液于75℃旋蒸至稠，转移至蒸发皿中，水浴蒸干，于70℃真空干燥2小时，得干浸膏；加甲醇定容，过0.45μm有机系微孔滤膜；提取原花青素。采用科学合理的提取方法进一步揭示开发黑果枸杞果提取物具有降血糖、降血脂和降血压活性的新用途，为在治疗或预防糖尿病、高血脂和高血压的产品中有效充分应用提供新的技术措施。不但缩短了提取分离的时间，减少了工艺过程中的能耗，有效降低了生产成本，而且所得产品纯度高、性能稳定，提取物杂质少，质量优良，可应用具有抗氧化作用的医药保健品原料。
文档编号A61P39/00GK103230473SQ20131006274
公开日2013年8月7日 申请日期2013年2月28日 优先权日2013年2月28日
发明者黄盼华 申请人:上海基赛生物医药科技有限公司