专利名称：结构域抗体构建体的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于人类治疗的结构域抗体构建体。更具体而言，本发明涉及与人TNF-α结合的结构域抗体构建体以及其在治疗特征在于TNF-α活性的病症中的用途。
背景技术：
肿瘤坏死因子a (TNF-a )是参与介导休克和多种人类疾病和病症的病理生理学的一种细胞因子，所述人类疾病和病症包括脓毒症、感染、自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎和其它肠病况、银屑病、中毒性休克、移植排斥以及移植物抗宿主病。TNF-a主要由激活的巨噬细胞和T淋巴细胞产生，但在急性炎症反应过程中也由嗜中性粒细胞、内皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞产生。由于其在炎症中的作用，在减轻炎性病症的症状的努力中，TNF-a已作为重要的用于抑制的靶标而显露出来。已追求了多种为了疾病的临床治疗而抑制TNF-a的方法，特别是包括可溶性TNF-a受体和特异于TNF-a的抗体的用途。结构域抗体结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能性结合单元，并且相应于抗体的重链可变区(Vh)或轻链可变区(')。结构域抗体具有约13kDa的分子量，或小于完整抗体大小的十分
之一 O 与常规抗体不同，结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物系统中良好表达。它们的小尺寸允许更高的摩尔量/克产物，从而提供了效力/毫克剂量的显著增加。此外，dAb可以用作构建部件，以制备治疗产物例如多重靶向性的包含dAb的分子，其中两个或更多个dAb结合至两个或更多个不同的分子靶，或者可以将dAb合并入为肺或口服施用而设计的结构中。本发明者现在已设计出一种新的包含免疫球蛋白可变结构域的结构域抗体构建体，所述可变结构域连接至包括有截短的ChI结构域的恒定区。推测包含恒定区有助于延长通常具有短的持续时间的dAb的体内半衰期。新世界灵长类免疫球蛋白进化上遥远的灵长类，例如新世界灵长类，足够类似于人以具有类似于人抗体的抗体，从而使得当衍生自此类灵长类的抗体被引入人中时，宿主不产生抗抗体免疫应答。新世界灵长类(广鼻猴下目(Platyrrhini))包含至少53个种，其通常分成2个科:狨科(Callithricidae )和悬猴科(Cebidae )。狨科由狨和|组成。悬猴科包括松鼠猴、青猴、蜘蛛猴、绒毛猴、悬猴、夜或枭猴和吼猴。先前的研究已表征了表达的普通狨(Callithrix jacchus)的免疫球蛋白重链储库(von Budingen H-C等人，Characterization of the expressed immunoglobulin IGHVrepertoire in the New World marmoset Callithrix jacchus.1mmunogenetics;53:557-563(2001))。鉴定了 6个IGHV亚群，其显示了与它们的人IGHV对应物的高度序列相似性。当与互补决定区(CDR)相比较时，构架区是更保守的，其中最高程度的可变性位于CDR3中。普通狨与人IGHV序列之间的相似性程度小于旧世界灵长类与人之间的相似性程度。发明概述第一方面，本发明提供了与人TNF-α结合的结构域抗体构建体，所述构建体包含:(a)与人TNF-α结合的结构域抗体(dAb);(b)经修饰的铰链区序列；(c)人或灵长类重链恒定区序列，其具有不多于20个残基，更优选地不多于10个残基，更加优选地不多于5个残基和更为优选地单个残基的截短的ChI结构域，其中所述经修饰的铰链区序列包含缺失或者半胱氨酸残基的单氨基酸置换，所述半胱氨酸残基通常促进重和轻抗体链间二硫键的形成。第二方面，本发明提供了编码本发明第一方面的结构域抗体构建体的核酸序列。第三方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码与人TNF-a结合的结构域抗体构建体的序列，其中所述核酸分子包含与SEQ ID No:50或SEQ ID No:51所示的序列至少60%同一的，优选地至少80%同一的，更优选地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的核酸序列，和最优选地包含SEQ ID No:50或SEQ ID No:51所示的序列。第四方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码与人TNF-a结合的结构域抗体构建体的序列，其中所述核酸分子包含与SEQ ID No:50或SEQ ID No:51所示核苷酸序列在高严紧度条件下杂交的核酸`序列。第五方面，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的根据第一方面的结构域抗体构建体，以及药学上可接受的载体或稀释剂。第六方面，本发明提供了根据本发明第一方面的结构域抗体构建体在检测人TNF-a的诊断应用中的用途。第七方面，本发明提供了用于在人受试者中治疗特征在于人TNF-a活性的病症的方法，其包括给所述受试者施用根据本发明第二方面的药物组合物。附图简述
图1显示了接纳体(acceptor) dAb的氨基酸序列(SEQ ID No:5)和核苷酸序列(SEQ ID No:6)。图2显示了本发明的结构域抗体构建体的优选实施方案的结构，作为(A)单体和(B) 二聚体。图3显示了十一个(11)狨和六个(6 )枭猴V K基因区段的核苷酸和氨基酸序列。图4显示了接纳体dAb的氨基酸序列(SEQ ID No:5)和核苷酸序列(两条链)(SEQID No:6和SEQ ID No:68)。图中标示了 KpnI和SanDI的限制性消化位点，其切出包含CDR2的区域。被除去的CDR2残基以下划线标示。图5显示了化合物170 (SEQ ID No: 11)在鼠类L929细胞生存力测定法中中和TNF-α介导的细胞毒性的能力。图6显示了，化合物170 (SEQ ID No: 11)阻止TNF-α与人ρ55或p75TNF受体的相互作用。
图7显示了，表达跨膜TNF-α的NS027D4细胞(黑色实线)的化合物170 (SEQID No: 11)染色显现出比不相关特异性同种型-匹配的对照(irrelevant specificityisotype-matched control)(灰色填充)更高的突光强度。图8显示了在细菌表达系统中产生的化合物170 (SEQ ID No: 11)在ELISA中保持与TNF-α的结合。图9显示了相对于特异性对照人IgG1而言，化合物170 (SEQ ID No: 11)在TNF介导的鼠关节炎模型中的功效。以每周一次的间隔对小鼠进行评分(关节炎得分)(A)，和称重(B)。图10显示了对化合物112 (SEQ ID No:59)和化合物170 (SEQ ID No:ll)的蛋
白质表达的影响。图11显示了化合物170 (SEQ ID No: 11)的非还原性SDS PAGE分析，所述化合物170来自4X IOL先导细胞系(lead cell line)发酵并经蛋白A纯化。泳道1=测定法间对照；泳道2=分子量标准参照物；泳道3=空白；泳道4=经蛋白A纯化的在IOL发酵ID (运行I)中的化合物170 (SEQ ID No: 11);泳道5=经蛋白A纯化的在IOL发酵ID (运行2)中的化合物170 ;泳道6=经蛋白A纯化的在IOL发酵ID (运行3)中的化合物170 ;泳道7=经蛋白A纯化的在IOL发酵ID (运行4)中的化合物170。图12显示了化合物170(SEQ ID No: 11)的还原性SDS PAGE分析，所述化合物170来自4X IOL先导细胞系(lead cell line)发酵并经蛋白A纯化。泳道1=测定法间对照；泳道2=分子量标准参照物；泳道3=空白；泳道4=经蛋白A纯化的在IOL发酵ID(运行I)中的化合物170 (SEQ ID No: 11);泳道5=经蛋白A纯化的在IOL发酵ID (运行2)中的化合物170 ;泳道6=经蛋白A纯化的在IOL发酵ID (运行3)中的化合物170 ;泳道7=经蛋白A纯化的在IOL发酵ID (运行4)中的化合物170。发明详述本发明者已产生了结构域抗体构建体，其与人TNF-α结合并且被推测当给人施用时展现出低免疫原性。该结构域抗体构建体包含相应于免疫球蛋白重链或轻链可变结构域(即结构域抗体(dAb))的部分、铰链区和相应于抗体重链恒定区的部分，但其中所述恒定区具有截短的ChI结构域。推测包含恒定区部分能增加dAb的体内半衰期，以及提供效应子功能，所述效应子功能被认为是抗TNF抗体的抗炎机制的组成部分。第一方面，本发明提供了与人TNF-a结合的结构域抗体构建体，所述构建体包含:(a)与人TNF-α结合的结构域抗体(dAb);(b)经修饰的铰链区序列；(c)人或灵长类重链恒定区序列，其具有不多于20个残基，更优选地不多于10个残基，更加优选地不多于5个残基和更为优选地单个残基的截短的ChI结构域，其中所述经修饰的铰链区序列包含缺失或者半胱氨酸残基的单氨基酸置换，所述半胱氨酸残基通常促进重和轻抗体链间二硫键的形成。在一个优选的实施方案中，ChI结构域和铰链区为XEPKSZDKTHTCPPCPA (SEQ IDNo:64)，其中X为缬 氨酸、亮氨酸或异亮苷酸，和Z不存在或为除半胱氨酸以外的其他氨基酸。优选地，X为缬氨酸，和Z为丝氨酸。在本发明的一个优选实施方案中，所述dAb包含免疫球蛋白重链或轻链可变结构域，其中所述可变结构域包含至少一个具有来源于新世界灵长类的序列的互补决定区(CDR)，其中所述 CDR 选自 AATKLQS (SEQ ID No:1),EASSLQS (SEQ ID No: 2),EASKLQS (SEQID No:3)和 SASNLET (SEQ ID No:4)。在另一优选的实施方案中，所述⑶R为⑶R2。在一个优选的实施方案中，dAb具有选自下列的序列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITGRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQVVff RPFTFGQGTKVE I KR (化合物 145 ; SEQ ID No: 7)DIQMTQSPS SLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQVVff RPFTFGQGTKVE I KR (化合物 123 ; SEQ ID No:8)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLLPEDFATYYCQQVVff RPFTFGQGTKVE I KR (化合物 100 ; SEQ ID No:9)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLLPEDFATYYCQQVVff RPFTFGQGTKVE I KR (化合物 196 ; SEQ ID No: 10)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKPPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQVVff RPFTFGQGTKVE I KR (化合物 134 ; SEQ ID No:52)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQVVff RPFTFGQGTKVE I KR (化合物 137 ; SEQ ID No:53)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLVPEDFATYYCQQVVff RPFTFGQGTKVE I KR (化合物 121 ；SEQ ID No:54);和与这些序列之一至少95%，更优选地至少96%、97%、98%或99%同一的序列。在进一步的优选实施方案中，所述恒定区包含Ch2和Ch3结构域，其一起具有下列序列:PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ； (SEQID NO:63)
或者与其至少60%同一的，优选地至少80%同一的，更优选地至少90%、95%、96%、97%,98%或99%同一的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述结构域抗体构建体包含与SEQ ID No: 11所示的序列至少60%同一的，优选地至少80%同一的，更优选地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的氨基酸序列，和最优选地包含SEQ ID No:ll所不的序列。此处所用的术语“与......结合”意指抗原被免疫球蛋白可变区以I μ M或更低的
解离常数(Kd)进行结合，如使用例如BIAcore 表面等离子体共振系统和BIAcore 动力学评估软件(例如，2.1版)通过表面等离子体共振分析所测量的。特异性结合相互作用的亲和力或解离常数(Kd)优选地为约500nM或更低，更优选地约300nM或更低，以及优选地至少300nM 至 50pM，200nM 至 50pM，和更优选地至少 IOOnM 至 50pM，75nM 至 50pM，IOnM 至 50pM。此处所用的术语“dAb”指与抗原特异性地结合的抗体单可变结构域(VH或VJ多肽。
在本发明的一个进一步的优选实施方案中，结构域抗体构建体与另一个根据本发明的结构域抗体构建体形成同或异二聚体。二聚化能够增加抗原结合的强度，其中所述结合的强度与多个结合位点的结合亲和力总和有关。为了促进二聚体的形成，结构域抗体构建体的铰链区包含至少一个，和优选地两个半胱氨酸残基。在本发明的一个特别优选的实施方案中，结构域抗体构建体和一个相同的结构域抗体构建体形成同二聚体。因此，在另一个方面中，本发明提供了与人TNF-α结合的二聚结构域抗体构建体，其中所述二聚体由两个根据本发明的结构域抗体构建体组成。优选的是，二聚结构域抗体构建体为同二聚体，并且特别优选的是，组成同二聚体的所述结构域抗体构建体包含与SEQ ID No: 11所示的序列至少60%同一的，优选地至少80%同一的，更优选地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的氨基酸序列，和最优选地包含SEQ ID No: 11所示的序列。第二方面，本发明提供了编码本发明第一方面的结构域抗体构建体的核酸序列。第三方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码与人TNF-a结合的结构域抗体构建体的序列，其中所述核酸分子包含与SEQ ID No:50或SEQ ID No:51所示的序列至少60%同一的，优选地至少80%同一的，更优选地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的核酸序列，和最优选地包含SEQ ID No:50或SEQ ID No:51所示的序列。第四方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码与人TNF-a结合的结构域抗体构建体的序列，其中所述核酸分子包含与SEQ ID No:50或SEQ ID No:51所示核苷酸序列在高严紧度条件下杂交的核酸序列。在确定两个多肽序列是 否落在同一性百分比限度内时，本领域技术人员将会意识到必须进行并列比较或者序列的多重比对。在这样的比较或比对中，差异将在不相同的残基的定位中出现，这取决于用来进行比对的算法。在本文本中，提及两个或更多个氨基酸序列之间的“同一性百分比”或者“相似性”应被视为分别指所述序列之间相同的或相似的残基的数目，如用本领域技术人员已知的任何标准算法所测定的。例如，氨基酸序列同一性或相似性可以用GAP程序进行计算和/或用PILEUP程序(Computer GeneticsGroup, Inc.，University Research Park, Madison, Wiscons in, United States ofAmerica) (Devereaux 等人，1984)进行比对。GAP 程序使用了 Needleman 和 Wunsch (1970)的算法来使相同的/相似的残基的数目最大化并使在比对中序列缺口的数目和长度最小化。备选地或者另外地，当比较多于两个的氨基酸序列时，可以使用Thompson等人(1994)的Clustal W程序。在确定两个核苷酸序列是否落在这些百分比限度内时，本领域技术人员将会意识到必须进行并列比较或者序列的多重比对。在这样的比较或比对中，差异可在不相同的残基的定位中出现，这取决于用来进行比对的算法。在本文本中，提及两个或更多个核苷酸序列之间的“同一性百分比”应被视为指所述序列之间相同的残基的数目，如用本领域技术人员已知的任何标准算法所测定的。例如，可以采用BESTFIT程序或者其它合适的程序(Computer Genetics Group, Inc., University ResearchPark, Madison, Wisconsin, United States of America) (Devereaux 等人，Nucl.AcidsRes.，12:387-395, 1984)来对核苷酸序列进行比对并计算它们的同一性。
高严紧度优选涉及在65°C和0.1XSSC (IXSSC=0.15M NaCl, 0.015M柠檬酸钠，PH7.0)的条件下的杂交。在一个实施方案中，本发明还基于用于扩增新世界灵长类免疫球蛋白可变区基因的方法，例如使用对于重链和轻链可变区基因家族特异的引物通过聚合酶链式反应(PCR)从提取自新世界灵长类淋巴细胞的核酸中进行扩增。例如，关于重链和轻链可变结构域基因(分别为Vh和的边界的信息可以用于设计PCR引物，所述引物从经克隆的重链或轻链编码序列中扩增可变结构域，所述重链或轻链编码序列编码已知与给定抗原相结合的抗体。然后，将扩增的可变区单独地或者作为与另一本发明的人或灵长类恒定区多肽序列的融合物插入合适的表达载体中，以产生本发明的结构域抗体构建体。合适的表达载体将是本领域技术人员所熟知的。VH、'和恒定区结构域储库可以是天然存在的免疫球蛋白序列储库或合成的储库。天然存在的储库是例如从表达免疫球蛋白的细胞制备的储库，所述表达免疫球蛋白的细胞从一种或多种灵长类中收获。此类储库可以是原初的(naive)，即从新生的表达免疫球蛋白的细胞制备，或者是重排的，即从例如成年灵长类B细胞制备。需要时，随后对从天然储库或任何储库中鉴定的结合靶抗原的克隆实施诱变并进一步进行筛选，以产生和选择具有改善的结合特征的变体。单个免疫球蛋白可变结构域的合成储库是通过向经克隆的可变结构域中人工弓I入多样性来制备的。可以通过例如噬菌体展示，就所希望的结合特异性和功能行为来筛选Vh和\结构域储库。用于构建噬菌体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法在本领域中是众所周知的。噬菌体展示技术已在本领域中进行了广泛描述，以及用于产生和筛选这样的文库以及对它们的产物进行亲和力成熟的方法和化合物的例子可以在例如下列文献中找到=Barbas等人，(1991) PNAS88:7978-7982 ;Clarkson 等人.(1991) Nature352:624-628 ;Dower 等人，PCT.91/17271，美国专利号 5，427，908，美国专利号 5，580，717 和 EP527, 839 ；Fuchs 等人，(1991)Bio/Technology9: 1370-1372 ；Garrad 等人，(1991)Bio/Technology9:1373-1377 ；Garrard 等人，PCTW092/09690 ;Gram 等人，(I992)PNAS89Z3576-358O5Griffiths 等人，(1993) EMB0J12:725-734 !Griffiths 等人，美国专利号 5，885，793 和 EP589, 877 ；Hawkins 等人，(1992)JMol Biol226:889-896 ；Hay 等人，(1992)Hum AutibodHybridomas3:81-85 ；Hoogenboom 等人，(1991)Nuc Acid Resl9:4133-4137 ；Huse 等人，(1989)Science246:1275-1281 ；Knappik 等人，(2000)JMol Biol296:57-86 ；Knappik等人，PCT W097/08320 ；Ladner 等人，美国专利号 5，223，409，5，403，484，5，571，698，5，837，500 和 EP436, 597 ；McCafferty 等人，(1990) Nature348:552-554 ；McCafferty 等人，PCT.W092/01047,美国专利号 5，969，108 和 EP589, 877 ;Salfeld 等人，PCT W097/29131,美国专利申请号 20050004354 ;和 Winter 等人，PCT W092/20791 和 EP368, 684。表达Vh和\结构域储库的重组文库可以在微生物例如酵母或细菌的表面上进行表达(参见 PCT 公开 W099/36569 和 98/49286)。本发明的结构域抗体构建体可以通过重组方法来产生，包括从真核表达系统中产生，所述真核表达系统包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞，以及真菌表达系统和病毒编码的表达系统，如此处所描述的或者本领域已知的。
本发明的结构域抗体构建体可以用S抗体编码核酸来制备，以便提供转基因植物和培养的植物细胞(例如，但不限于，烟草和玉米)，其在植物的某些部位中或者在由其培养出的细胞中产生这样的构建体。作为非限制性的例子，表达重组蛋白质的转基因烟草叶已被成功用于提供大量的重组蛋白质，例如，采用诱导型启动子(参见例如，Cramer等人，Curr.Top.Microbol.1mmunol.240:95-1181999)和其中所引用的参考文献。此外，转基因玉米也已经用于以商业生产水平来表达哺乳动物蛋白质，其生物活性等价于在其他重组系统中生产的或者从天然来源中纯化的蛋白质(参见例如，Hood等人，Adv.Exp.Med.Biol.464:127-1471999和其中所引用的参考文献)。也已从转基因植物种子(包括烟草种子和马铃薯块茎)中大量生产抗体，包括抗体片段例如单链抗体(scFv’s)(参见例如，Conrad等人，Plant Mol.Biol.38:101-109，1998和其中所引用的参考文献)。因此，本发明的结构域抗体构建体也可以根据已知的方法用转基因植物来生产(也参见例如，Fischer 等人，Biotechnol.Appl.Biochem.30:99-1080ctober, 1999 ；Ma&Hein., TrendsBiotechnol.13:522-71995 ;Ma 等人，Plant Physiol.109:341-61995 ；ffhitelam 等人，Biochem.Soc.Trans.22:940-9441994 ;和其中所引用的参考文献；以上每一篇参考文献在此通过提及而整体合并入本文)。本发明的结构域抗体构建体包括天然纯化的产物、化学合成方法的产物和通过重组技术从真核宿主(包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生的产物。取决于在重组生产方法中所采用的宿主，本发明的抗体构建体可以是糖基化的或者非糖基化的，其中优选是糖基化的。这样的方法在许多标准的实验室手册中已有描述，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor, N.Y.1989,第 17.37-17.42 节；Ausubel 等人，编辑，Current Protocols inMolecular Biology1987-1993,第 10，12, 13, 16, 18 和 20 章；Colligan 等人，Current Protocols in ProteinScience, John ffiley&Sons, NY, N.Y.1997-2001, Protein Science,第 12-14章，所有文献在此通过提及而整体合并入本文。
在一种表达系统中，在核糖体上展示重组肽/蛋白质文库(例如参见Roberts，Rff 和 Szostak, J.W.1997.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.94:12297 — 123202 以及 PCT
发明者A·G·多伊尔, B·P·伍尔文, I·M·汤姆林森, J·A·李, P·A·詹宁斯 申请人:赛法隆澳大利亚控股有限公司