专利名称：一种具有多生长因子次第释放特性的组织工程支架的制作方法
技术领域：
本发明为一种具有多生长因子次第释放特性的组织工程支架，属于药物剂型改变及其制备方法技术领域，特别是利用超临界流体技术的方法制备一种具有次第释放特性的多种生长因子的组织工程支架，有望用于骨组织的再生修复。
背景技术：
组织工程骨的形成、发育及修复的过程中，各种生长因子对局部组织、细胞的调控至关重要，分别作用于不同时相，且存在相互协调作用。可溶性细胞因子的直接使用存在半衰期短，需反复手术补充等应用障碍。因此，构建一种控释系统用于持久可控地输送多种生长因子以发挥其最大的生物学协同功能，具有显著的临床应用价值。然而，目前通常以单一的微球或支架为缓释载体，缺乏一种以生理修复状况为模式的多种生长因子次第释放载体系统。本项目基于不同生长因子协同调控骨再生修复机理，结合微球和支架缓释系统各自的特点，采用乳化一溶剂挥发法将骨形态发生蛋白(BMP-2)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)包埋于可生物降解的高分子材料聚乳酸/聚乙二醇(PLLA/PEG)中，制备成不同的载生长因子缓释微球，再利用超临界发泡技术将不同微球载入聚乳酸-羟基乙酸/羟基磷灰石(PLGA/HA)多孔支架中，设计一种生长因子释放初期以VEGF和bFGF为主，中后期以BMP-2为主的组织工程支架。我们旨在制备一种具有持久可控次第释放特性的多种生长因子控释系统，应用于骨缺损修复的组织工程支架。
乳化一溶剂挥发法是一种最常用的聚合物微球的制备方法，它是将药物和聚合物一起溶解于某种不能与水混溶的挥发性溶媒中，然后借助乳化剂的作用，使用高速搅拌器、高速乳化器或超声乳化器，形成乳状液或悬浮分散液，经连续搅拌、过滤、干燥，即得载药微球。可以通过在制备过程中改变聚合物的组成、分子量等因素来控制微球的物理化学性质和药物的释放规律。支架的传统制备方法很多，比如溶液浇铸/粒子浙滤法、原位聚合法、有机泡沫浸溃法、溶胶-凝胶技术、热致相分离技术等，但是存在许多问题，如操作复杂，有机溶剂残留，制备过程条件苛刻难以引入生长因子等。而超临界二氧化碳(Sc-CO2)发泡法绿色环保，过程中不涉及高温和有机溶剂，有利于生长因子的加入，可以用来制备多孔支架材料。Sc-CO2发泡法是将可溶胀聚合物置入特定的模具之中，用Sc-CO2浸泡聚合物一定时间使其溶胀，直到聚合物中的CO2达到饱和状态，然后迅速地降至常温常压。由于气体的热力学不稳定性导致气泡成核和增长，形成三维孔洞结构。本发明的目的:提供一种利用乳化一溶剂挥发法以聚乳酸/聚乙二醇(PLLA/PEG)为载体材料制备生长因子缓释微球，进而利用超临界二氧化碳发泡技术以聚乳酸-羟基乙酸/羟基磷灰石(PLGA/HA)为载体材料制备多种生长因子可控次第释放组织工程支架的方法。本发明的基本构思:生长因子缓释系统不能仅仅局限释放单一生长因子，而应该在一种类似生理修复状况模式下以最佳的比例释放多种生长因子到需要的靶向细胞。血管类生长因子与骨诱导类生长因子的搭配复合可能对骨再生修复具有重要希望，但目前常用的方法以各种材料的微球或支架为缓释载体，缺乏一种以生长因子作用的时间依赖性为基础的多种生长因子载体系统。因此，若将微球与支架进行复合，将BMP-2、VEGF和bFGF分别载入微球和支架，使三种生长因子达到不同的释放规律，以满足骨再生生理状况下的时间和空间上的生长因子需要。为了制备可降解的多孔支架，支架的传统制备方法操作复杂，制备过程条件苛刻，涉及到高温、有机溶剂残留、难以引入生长因子等。Sc-CO2发泡法绿色环保，产品无有机溶剂残留、过程中不涉及高温、有利于生长因子的加入，可以用来制备多孔支架材料。该多相生长因子缓释系统的构建，基于骨修复不同阶段需要多种生长因子协调发挥不同生物活性功能机理，结合药物缓释及支架材料的各自特点，利用乳化一溶剂挥发法将BMP-2、VEGF和bFGF三种关键生长因子各自载入缓释微球，再采用sc_C02发泡技术将缓释微球与多孔材料相结合形成多相载体控释系统作为骨组织工程支架，能够在骨修复初期以VEGF和bFGF的释放为主，中后期以BMP-2的释放为主，旨在按一种类似生理修复状况模式下以最佳的比例释放多种生长因子到需要的靶向细胞，协同实现对骨组织的再生修复。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结合乳化一溶剂挥发法及超临界流体技术制备能够次第释放多种生长因子缓释支架的方法。本发明的目的主要是通过以下技术路线实现的:采用W/0/W复乳法，将PLLA及PEG溶于有机溶剂，将药物水溶液分散在其中形成水溶性药物的W/0型乳液，配制含有稳定剂的水溶液作外部水相。将制得的W/0型乳液在搅拌的条件下分散到外部水相中形成W/0/W型乳液。经蒸发、过滤、干燥得到载药PLLA微球。以不同分子量的PLLA及不同加入量的PEG为载体，分别包埋BMP-2、VEGF和bFGF，以期获得三种生长因子具有不同释放动力学的特性。再利用Sc-CO2流体发泡技术将已制备好的BMP-2-PLLA、VEGF-PLLA和bFGF-PLLA载药缓释微球按照设计释放剂量与PLGA/HA复合微粒共混后发泡形成具有一定力学强度的多相复合载体系统。Sc-C O2发泡技术制备复合支架过程如下:将四氟乙烯模具放入高压釜中，将钢瓶中的二氧化碳冷却后，由高压柱塞泵加压，通过热交换机持续地将CO2泵入高压釜内，待达到要求的压强后，维持温度和压强，保温达到特定的时间后，Sc-CO2充分地浸入高聚物基材中。迅速打开阀门放气，待温度和压强回复至常温常压状态时，打开高压釜，取出样品。本发明的用途:本发明主要用于制备可控次第释放多种药物的缓释支架，保持药物生物活性，提高药物生物利用度，降低毒副作用，提高治疗效果。本发明的优点:本方法制备过程温和，绿色环保，毒性小，操作简单，所制备的生长因子缓释支架具备良好的理化性质及可控次第释放特性。
图1.BMP-2-PLLA载药微球形貌观察 图2.VEGF-PLLA载药微球形貌观察
图3.bFGF-PLLA载药微球形貌观察图 4.BMP-2-PLLA、VEGF-PLLA 和 bFGF-PLLA 载药微球释放规律 图5.复合支架的形态电镜观察
图6.胰蛋白酶-HA/PLGA支架(a)、胰蛋白酶-PLLA微球(b)、胰蛋白酶-PLLA微球/HA/PLGA支架(c)的蛋白缓释效果
具体实施例方式以下结合发明人给出的具体实例，对所发明的药物次第释放支架作进一步的详细阐述。但本发明并不仅限于如下实施例的范围。实例一制备BMP-2-PLLA、VEGF-PLLA 和 bFGF-PLLA 载药微球
(I)分别将10 ii g的BMP-2、VEGF和bFGF溶于250 uL PBS中作为内水相。(2)称取250 mg的PLLA (分子量为I 10万)和聚乙二醇(PEG，分子量为400 10000)，PLLA与PEG的质量比为1:2 2:1，溶于5mL 二氯甲烷中作为油相(内水相与油相体积比为1:20)。(3)将内水相缓缓倒入油相中，高速搅拌2分钟，形成初乳(W/0)。(4)将初乳缓缓滴入10 mL, I %的PVA中，高速搅拌5分钟，形成复乳(W0/W)。(5)将复乳缓慢滴入250mL，0.1 %的PVA中，室温搅拌4小时，500 r/min，用于挥发有机溶剂。(6) 4000 r/min离心10分钟，收集微球，去离子水洗涤3次，冷冻干燥收集。 以上过程制备的rhBMP-2-PLLA`、VEGF-PLLA和bFGF-PLLA载药微球呈光滑球形，平均粒径分别为32.2 ii m、4.8 y m和2.2 u m,微球的载药量为0.10% 0.14%，包封率为57.9% 80.1%，不同条件制备的生长因子缓释微球具有不同的释放特性，具体结果可参见附图。实例2制备含有胰蛋白酶缓释微球的HA/PLGA多孔支架
(I)将购买的PLGA (PLA:PLG=50:50, Mff=IOO, OOODa)与HA粉末以1:4的比例进行研磨，研磨时间为8小时，再加入10%的胰蛋白酶缓释微球与粉末充分混匀。(2)准确称量混合粉末0.125g放入直径为5mm的圆柱形模具中进行压制，压强为IOMPa,压制时间为Imin,得到直径为5mm,高约为3mm的小圆片,取出后放入实验室定制的四氟乙烯模具之中。(3)将四氟乙烯模具放入高压釜中，开启超临界发泡装置，制冷系统开始工作，设定反应温度为39°C，压力为8Mpa，打开高压柱塞泵，恒温水浴箱和鼓干燥箱，对反应釜进行升压升温。调节放气阀门和温控开关使反应釜的温度、压力恒定为设定值。反应8h后，超临界CO2充分地浸入到聚合物基质中。迅速打开阀门放气，待温度和压强回复至常温常压状态时，打开高压釜，取出样品。以上过程制备的复合支架孔径分布在15(r300i!m，孔的连通性较好，孔隙率为76.84%，抗压强度为5.llMPa，胰蛋白酶缓释微球均匀的分布在支架上。胰蛋白酶-HA/PLGA支架，胰蛋白酶48h的累积释放量达85%以上；胰蛋白酶-PLLA微球，胰蛋白酶48h累计释放率为65.2% ;胰蛋白酶-PLLA微球/HA/PLGA支架，胰蛋白酶21d累计释放量仅为60.6%。
权利要求
1.一种结合乳化一溶剂挥发技术和超临界二氧化碳发泡技术的方法所制备的具有多种生长因子次第释放特性的组织工程支架，其特征在于，采用乳化一溶剂挥发法将多种生长因子分别包埋于可生物降解的高分子材料中，制备成不同的载生长因子缓释微球，再利用超临界发泡技术将不同微球载入多孔支架中，构建具有多种生长因子可控次第释放特性的组织工程支架。
2.根据权利要求1中所述的一种利用乳化一溶剂挥发法制备多种生长因子缓释微球的方法，其特征在于，载入的生长因子分别为骨形态发生蛋白(BMP-2)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
3.根据权利要求1中所述的一种利用乳化一溶剂挥发法制备多种生长因子缓释微球的方法，其特征在于，药物载体为可生物降解的聚乳酸(PLLA)和聚乙二醇(PEG)，其中PLLA分子量为I万 10万，PEG分子量为400 10000，PLLA与PEG的质量比为1:2 2:1。
4.根据权利要求1中所述的一种利用乳化一溶剂挥发法制备多种生长因子缓释微球的方法，其特征在于，所制备的生长因子缓释微球呈现光滑的球形，骨形态发生蛋白、血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等三种生长因子的缓释微球平均粒径分别为32.2 μπι、4.8 μπι和2.2 μ m，微球的载药量为0.10% 0.14%，包封率为57.9% 80.1%，根据不同PLLA分子量和不同PLLA/PEG配比，分别得到具有不同释放特性的缓释微球。
5.根据权利要求1中所述的一种利用超临界二氧化碳(Sc-CO2)发泡技术制备生长因子复合组织工程支架的方法，其特征在于系统超临界二氧化碳压强为8MPa，温度为39°C，饱和时间8h。
6.根据权利I中所述的采用Sc-CO2发泡技术制备生长因子复合组织工程支架，其特征在于，支架基质材料为可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA，分子量5万 15万)，复合支架孔径分布在150 300 μ m,孔的连通性较好，孔隙率为76.84%，抗压强度为5.1lMPa,药物21天累计释放 量仅为60.6%，生长因子释放初期以血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子为主，中后期以骨形态发生蛋白为主。
全文摘要
本发明为一种具有多生长因子次第释放特性的组织工程支架，属于药物剂型改变及制备方法技术领域。本发明中，结合微球缓释系统和支架的特点，采用复乳法分别制备BMP-2、VEGF和bFGF等生长因子的PLLA/PEG缓释微球，再利用超临界二氧化碳发泡技术将微球载入PLGA多孔支架中，构建具有可控次第释放特性的组织工程支架。本方法药物活性保持度高，有机溶剂残留量低，操作简单。所制备微球粒度分布窄，具有良好的缓释效果。复合支架孔径分布在150~300μm，连通性好，孔隙率为76.84%，抗压强度为5.11MPa，21天累计释放量为60.6%。本发明制备的支架在组织工程修复体中具有应用前景。
文档编号A61L27/54GK103143065SQ201310087748
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者尹光福, 白燕, 李培培 申请人:四川大学