专利名称：组合的ctl抗原表位及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，特别涉及肿瘤抗原的联合的抗原表位，还涉及联合的抗原表位的应用。
背景技术：
肺癌是当前世界各地最常见且发病率呈持续增高的少数几种恶性肿瘤之一。在西方发达国家和我国，肺癌已经成为男性癌症死亡的首位原因，美国女性肺癌的死亡率在20世纪80年代后期也已超过乳腺癌成为女性癌症死亡的第一位原因。因此，肺癌是目前世界上对人类健康与生命威胁最大的恶性肿瘤。我国内地肺癌的发病率和死亡率也由20世纪60年代的第四、五位(男、女性)迅速上升至今天的第一、二位，在大城市和重工业地区的上升尤为显著。肿瘤免疫治疗是近年来受到关注的新疗法之一，已成为除手术、放疗和化疗外的治疗肿瘤的重要手段,肿瘤免疫治疗主要通过治疗性疫苗激发和增强机体的免疫机能，以达到控制和杀灭肿 瘤细胞的目的。肿瘤治疗性疫苗包括肿瘤细胞疫苗、基因工程疫苗、多肽疫苗和基因疫苗等，其激活机体的特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte, CTL)、产生肿瘤的保护性免疫应答的作用在动物实验中已得到肯定，多种疫苗已进入临床试验阶段，是一种有着广阔应用前景的肿瘤免疫治疗方法。多肽疫苗还具有安全性，相对易于临床生产等优势，因此，肿瘤治疗性疫苗有望成为肿瘤免疫治疗中的重要手段。随着越来越多的TAA(肿瘤相关抗原)、TSA(Trichostatin A)及各种肿瘤抗原的Th (辅助性T细胞)表位和CTL表位等的相继被发现、鉴定，具有高度特异性的多肽疫苗应运而生。现已确认，在抗肿瘤的免疫应答中细胞免疫起着主要作用，特别是CTL，它是抗肿瘤免疫的主要效应细胞。将来自肿瘤病人的肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)的特异性CTL克隆回输病人体内，可使病人肿瘤消退。因此应用基于肿瘤抗原的CTL表位肽直接诱导特异性CTL抗肿瘤应答，已经为一种方便有效的办法。NY-ES0-1属于肿瘤-睾丸抗原(CTA)家族中的一员，能在睾丸、卵巢及多种不同类型的肿瘤组织中表达，但NY-ES0-1在正常组织中不表达，所以，NY-ES0-1被视为一种较强的肿瘤标志物。NY-ES0-1因能引起机体产生细胞免疫和体液免疫而被医学界广泛关注。申请号为200910103436.2，名为“肿瘤抗原Ran HLA_A*0201限制性模拟CTL表位及其应用”的中国发明专利，公开了一段CTL表位；与天然表位相比，其有更强的亲和力和结合稳定性，并能诱导特异性CTL分泌高水平的IFN- Y，其具有制备Ran表达阳性肿瘤的治疗性多肽疫苗。精子蛋白17(Sperm proteinl7, Spl7)是新近发现的一种CT抗原(肿瘤-睾丸抗原，或癌-睾丸抗原)，在受精过程中参与了顶体反应，一直以来在免疫避孕中倍受关注。近来发现在多发性骨髓瘤，卵巢癌及众多肿瘤细胞系中有表达。在输精管切除术后的男性的血清中可检测到Spl7特异性抗体的存在,Maurizio等用体外重组Spl7蛋白诱导产生的CTL可以杀伤自体的肿瘤细胞，提示Spl7具有良好的免疫原性，可以作为肿瘤治疗的靶标。Ran是一种大量分布于细胞核内的GTP酶，是Ras类原癌基因大家族中的一员。Ran的功能多种多样，有许多证据表明Ran及其结合蛋白参与调控细胞周期中的多个过程.目前比较确认的功能主要包括:通过调节核质物质转运而调控细胞周期调控因子的定位、调控核膜装配、调控DNA复制、调控纺锤体组装等.此外,还有资料显示Ran参与细胞核结构的维持、mRNA转录和剪接、RNA由核内向胞质中转运等。多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗。与活疫苗或重组疫苗比较，多肽疫苗可特异地直接针对免疫系统的特异免疫表位，避开病毒株间高度变异的区域。多肽疫苗安全，相对易于规模化生产，对较少的免疫表位诱发特异的免疫应答。但多肽疫苗存在一些缺点，如免疫原性差，不能克服MHC的多态性等。免疫原性弱是多肽疫苗的一大弱点。单用多肽疫苗免疫病人，多肽在体内易被肽酶降解，所诱导的CTL不易突破使肿瘤消退所需的阈值。对表位多肽进行修饰(单个氨基酸的替换、多肽的PMRI修饰和脂肽等)或采用多价疫苗则可有效提高其免疫原性，诱导更强的CTL活性。肿瘤抗原的表位改造可以通过改善其与MHC的结合和稳定性达到增强肽免疫原性的目的，并克服T细胞耐受。改造TCR结合位点以改变TCR-pMHC结合信号提高T细胞的活化。改造T细胞抗原受体(Tcell receptor TCR)结合位点以改变TCR与肽MHC分子复合物(peptide/MHC pMHC)结合信号提高T细胞的活化，并克服T细胞耐受，从而达到使肿瘤消褪的目的。由这些方法得到的候选肽在体内体外的实验中都证实可以一定程度上提高特异性CTL的增殖。·
发明内容
有鉴于此，本发明提供多个表位组合的方式，采用该组合方式制备的多肽可诱导产生针对多种不同抗原表位的抗肿瘤免疫,这种对肿瘤细胞表面多靶位的多价疫苗比单一抗原刺激更有效。本发明通过以下技术手段解决上述技术问题:多个表位组合的方式，具体为组合的CTL抗原表位，选自不少于两条如SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的多肽。如SEQ ID NO:1-2的氨基酸序列的两条多肽组合，再如SEQIDNO:2-3的氨基酸序列的两条多肽的组合，或如SEQ ID NO:1与如SEQ ID NO:3的氨基酸序列的两条多肽的组合，或如SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的三条多肽的组合。组合，是指借组上述多肽的优势抗原表位来设计新的多表位肽，达到比单价疫苗的协同作用。优选的多个表位组合的方式，具体为所述的组合的CTL抗原表位，由A、B和C三条多肽连接，其中，所述A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述B的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，所述C的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。连接的方式优选为串联。蛋白质的串联方法为现有技术，如非对称粘性末端互补法、接头连接法、同尾酶法、表达盒串联法等。优选的多个表位组合的方式，更优选的连接方式，具体为所述CTL抗原表位的氨基酸序列如 SEQ ID NO:4 所示:N-YMFDVTSRVSLLEKREKTSLLMFITWV-C。进一步，所述的组合的CTL抗原表位，用PEG4分别修饰所述A、B和C的N末端，得A衍生物、B衍生物和C衍生物，依次连接A衍生物、B衍生物和C衍生物。进一步，所述的组合的CTL抗原表位，将A衍生物的PEG4末端与如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的多肽的C末端连接。由所述的表位肽的衍生物制备的多价疫苗，所述多价疫苗为所述衍生物与药学上可接受的载体结合。本发明的目的之二在于提供所述组合的CTL抗原表位的新应用，该应用为肿瘤的治疗提供了新的思路。所述的组合的CTL抗原表位在制备肿瘤免疫原中的应用。进一步，所述的应用，其在制备肺癌免疫原中的应用。进一步，所述的应用，其在制备卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和黑色素瘤的免疫原中的任一种免疫原中的应用。如SEQ ID NO:1_3所述的氨基酸序列的多肽联合应用在制备多肽疫苗中的应用。本发明是基于申请号为200810232895.6和200910103436.2的中国发明专利的后
续研究。本发明的有益效果:多肽经过PEG修饰后具有以下优点:更长的半衰期；较低的最大血药浓度；血药浓度波动较小；较少的酶解作用；较少的免疫原性及抗原性；较少的毒性；更好的溶解性；用药频率减少；提高病人的依从性，提高生活质量，降低治疗费用。HLA-A2+人外周血用多表位疫苗刺激前后，以pentamer、⑶8、⑶3抗体染色法对表位特异性CD8+CTL应答进行定量检测；结果显示，健康人外周血未经刺激时未检测到抗原特异性CD8+CTL应答，经多表位疫苗刺激后，抗原特异性CTL频率显著增高。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
图1为多表位疫苗刺激人外周血单个核T细胞诱导抗原特异性CTL的产生IFN- Y的能力分析图。图2为检测多表位疫苗诱导的CTL多肿瘤细胞的杀伤效应的分析图。
具体实施例方式以下将结合附图对本发明进行详细说明，实施例1合成肽如SEQ ID NO:4所示的多肽，委托杭州中肽生化有限公司采用标准Fmoc方案进行合成，并采用方向高效液相色谱法进行纯化和纯度分析，质谱法进行鉴定和分子量测定。结果显示，所述多肽的纯度高于95%，分子量与理论值相符。具体合成步骤:1.去保护:Fmoc保护的柱子和单体必须用碱性溶剂，如piperidine去除氨基的保护基团。2.激活和交联:下一个氨基酸的羧基被激活剂所激活溶解，激活的单体与游离的氨基在交联剂的作用下交联，形成肽键。3.循环:前两步反复循环直到整条肽链合成完毕。实施例2经修饰后的多肽的衍生物聚乙二醇(PEG)是经环氧乙烷聚合而成的，由重复的氧乙烯基组成。PEG不仅具有良好的水溶性，也能溶于二氯甲烷、N-N-二甲基酰酚、苯、乙腈和乙醇等有机溶剂。一端以甲基封闭的为甲氧基聚乙二醇(mPEG)，线性mPEG的分子式为CH3- (O-CH2-CH2) n-OH，在多肽的聚乙二醇化修饰研究中应用最多的是mPEG的衍生物。聚乙二醇是中性、无毒且具有独特理化性质和良好生物相容性的高分子聚合物，也是FDA批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。聚乙二醇具有高度的亲水性，当偶联到药物分子时，可以将其优良性质赋予修饰后的药物分子，改变他们在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏蔽，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快消除。聚乙二醇类修饰剂的药物动力学性质因它们的相对分子量和注射给药方式而异，分子量越大，半衰期越长。用PEG4 分别修饰所述 A (SEQ ID NO:1 所示)、B(SEQ ID NO:2 所示)和 C (SEQ IDNO: 3所示)的N末端，得A衍生物、B衍生物和C衍生物，依次连接A衍生物、B衍生物和C衍生物。并在A衍生物的PEG4末端与如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的多肽的C末端连接。具体修饰的方法参见王旭东等人的《蛋白药物的聚乙二醇定点修饰策略与最佳位点》一文。其中，“SLLMFITQV”源自肿瘤抗原NY-ES0-1的157-165位模拟表位5F9V。“SLLEKREKT”源自Spl745_53、“YMFDVTSRV”源自RAN88_96模拟表位I1Y，上述三段多肽和人造通用Th表位PADRE (如SEQ ID NO:5)经PEG4串联修饰而成的含40氨基酸和三个PEG分子的多肽疫苗，N-AKFVAAWTLKAAA-PEG4-YMFDVTSRV-PEG4-SLLEKREKT-PEG4-SLLMFITWV-C。合成多肽疫苗委托杭州中肽生化有限公司，步骤详见实施例1，与实施例1略有不同点在于，当合成至IJ 5F9V (SLLMFITQV)、Sp1745_53 (SLLEKREKT)、RAN88^96 模拟表位IIY(YMFDVTSRV)的首位氨基酸时，加入的PEG化的氨基酸衍生物，而不是原氨基酸，由此达到定点修饰的作用。多肽经过PEG修饰后具有以下优点:(I)更长的半衰期；(2)较低的最大血药浓度；(3)血药浓度波动较小；(4)较少的酶解作用；(5)较少的免疫原性及抗原性；(6)较少的毒性；(7)更好的溶解性；(8)用药频率减少；(9)提高病人的依从性，提高生活质量，降低治疗费用。实施例3细胞毒性活性与疫苗体外诱导CTL介导的细胞免疫能力效应细胞:HLA-A*0201阳性健康人的抗凝新鲜全血经常规聚蔗糖-泛影葡胺分层液梯度离心法分离，获得外周血单个核细胞，用含有体积百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1.0X106/mL，接种至24孔培养板中，每孔lmL，每组用浓度为10 μ g/mL的表位、浓度为50U/mL的重组白细胞介素2 (rhIL-2)连续刺激PBMC3次，每周I次，末次刺激后第3日收集细胞，即得表位诱导的特异性CTL，用含有体积百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度，作为效应细胞。1多表位疫苗刺激人外周血单个核T细胞诱导抗原特异性CTL的产生IFN- Y酶联免疫法检测分泌IFN- Y的能力:采用ELISP0T检测试剂盒，在96孔培养板中，每孔加入体积百分浓度为70%的乙醇100 μ L，室温放置10分钟，用PSB洗涤后，加入用PBS按1: 100稀释的IFN-Y捕获抗体100 μ L，室温4°C孵育过夜，用PBS洗涤后，加入效应细胞100 μ L，和靶细胞100 μ L，其中，效应细胞与靶细胞的数量比(Ε/Τ)为10，在温度37°C, CO2气体浓度为50mL/L条件下孵育20小时，用含有质量百分浓度为0.1%的吐温20的PBS洗涤后，加入含有质量百分浓度为I %的BSA的PBS按1: 100稀释的生物素标记的抗IFN-Y抗体100 ，在温度37°C，CO2气体浓度为50mL/L条件下孵育1.5小时，用含有质量百分浓度为0.1%的吐温20的PBS洗涤后，加入用含有质量百分浓度为1%的BSA的PBS按1: 5000的体积比稀释的联袂亲和素标记的碱性磷酸酶100 μ L，孵育I小时，洗涤后，拍干96孔板，用蒸馏水终止反应，干燥后读点。实验分组:1实验组(NSR):选用实施例2制备的多肽疫苗；2NY-ES0_1抗原对照组:其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽；3Spl7抗原对照组:其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示的多肽；4RAN抗原对照组:其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；5溶剂空白组。结果，如图1所示，5组中，实验组诱导的特异性CTL分泌IFN-Y的能力明显高于其他4组，表现诱导分泌IFN- Y的能力最强，相对于对照各肽在百万细胞可诱导约200个细胞分泌IFN- Y的能力，实验组可诱导约700个细胞分泌IFN- Y，其活化T细胞的能力提高了 3倍多。2多表位疫苗诱导的CTL多肿瘤细胞的杀伤效应采用时间分辨荧光DELFIA EUTDA细胞毒性试验进行分析。抗原诱导CTL为效应细胞(E)，负载抗原肽的T2细胞为靶细胞(T)，检测杀伤活性。效应细胞与靶细胞的数量比例为50:1，培养4h。时间分辨荧光检测仪检测荧光强度，每个样本设3个复孔，取平均值为检测结果。细胞杀伤活性=(待测孔荧光强度-自然释放孔荧光强度)/(最大释放孔荧光强度自然释放孔荧光强度)X 100 %。实验分组:I实验组抗原:选用实施例2制备的多肽疫苗；2NY-ES0_1抗原对照组:其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽；3Spl7抗原对照组:其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽；4RAN抗原对照组:其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；5溶剂空白组。结果如图2所示，实验组抗原在效靶细胞共培养过程中造成靶细胞的特异性溶破，各对照组多肽所诱导的效应细胞仅能杀伤负载有相应肽的靶细胞，而实验组诱导的效应细胞，可同时杀伤负载有上述三种对照肽的靶细胞，扩大了实验肽的适用范围。结果表明，多表位疫苗刺激人外周血单个核T细胞，能较强的诱导抗原特异性CTL的产生，检测分泌功能细胞因子(IFN-Y)的能力(图1)，并在效靶细胞共培养过程中造成靶细胞的特异性溶破(图2)。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.组合的CTL抗原表位，其特征在于，选自不少于两条如SEQID N0:l-3的氨基酸序列的多肽。
2.根据权利要求I所述的组合的CTL抗原表位，其特征在于由A、B和C三条多肽串联，其中，所述A的氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，所述B的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，所述C的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。
3.根据权利要求2所述的组合的CTL抗原表位，其特征在于所述CTL抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
4.根据权利要求2所述的组合的CTL抗原表位，其特征在于用PEG4分别修饰所述A、B和C的N末端，得A衍生物、B衍生物和C衍生物，依次连接A衍生物、B衍生物和C衍生物。
5.根据权利要求4所述的组合的CTL抗原表位，其特征在于将A衍生物的PEG4末端与如SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列的多肽的C末端连接。
6.由权利要求I所述的组合的CTL抗原表位制备的多价疫苗，其特征在于所述多价疫苗为所述衍生物与药学上可接受的载体结合。1
7.权力要求I所述的组合的CTL抗原表位在制备肿瘤免疫原中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，其在制备肺癌免疫原中的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，其在制备卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和黑色素瘤的免疫原中的任一种免疫原中的应用。
10.如SEQID NO :1-3所述的氨基酸序列的多肽联合应用在制备多肽疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及免疫学领域，特别涉及肿瘤抗原的联合的抗原表位，还涉及联合的抗原表位的应用；组合的CTL抗原表位，包含至少一种选自SEQ ID NOS1-3的多肽；所述衍生物是所述表位肽经聚乙二醇修饰而成；多肽经过PEG修饰后更长的半衰期；较低的最大血药浓度；血药浓度波动较小；较少的酶解作用；较少的免疫原性及抗原性；较少的毒性；更好的溶解性；用药频率减少；提高病人的依从性，提高生活质量，降低治疗费用；多表位疫苗刺激人外周血单个核T细胞，能较强的诱导抗原特异性CTL的产生，检测分泌功能细胞因子IFN-γ的能力，并在效靶细胞共培养过程中造成靶细胞的特异性溶破；其有望成为治疗肿瘤的疫苗。
文档编号A61K39/00GK103254313SQ20131011969
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月8日 优先权日2013年4月8日
发明者吴玉章, 尚小云, 倪兵, 王莉, 曹毅, 杨玓, 李凡 申请人:中国人民解放军第三军医大学