利用活性炭色谱柱一步分离纯化独一味中总环烯醚萜苷类成分的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用活性炭色谱柱分离纯化独一味中总环烯醚萜苷的方法，其特征是：将独一味地上部分用乙醇提取，提取液浓缩成浸膏，浸膏溶解后上活性炭色谱柱，先用蒸馏水冲洗至无色，再用70%-90%乙醇洗脱，收集流份，即得。其中采用活性炭(0.42-0.5mm)为色谱柱固定相，用70%-90%乙醇为流动相洗脱，所得总环烯醚萜苷类成分的含量达80-90%，并且回收率可达到70-82%。本发明采用一步分离纯化的方法，所得总环烯醚萜苷类成分分离效率高、纯度好、得率高的优点。
【专利说明】利用活性炭色谱柱一步分离纯化独一味中总环烯醚萜苷类成分的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种独一味中分离纯化总环烯醚萜苷的制备方法，即利用活性炭柱色谱法从独一味中分离纯化高纯度的有效部位总环烯醚萜苷的方法。
【背景技术】
[0002]独一句 Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo系唇形科无莖多年生草本植物,具有活血化瘀、镇痛止血、消肿抗炎等作用。现代药理研究表明，独一味地上部分及根中主要化学成分有黄酮类、环烯醚萜苷类和苯乙醇苷类等，其中总环烯醚萜苷为独一味中止血，镇痛，抗炎的主要活性部位。现有独一味中环烯醚萜苷类成分的分离方法为采用聚酰胺去黄酮，再经大孔吸附树脂富集纯化总环烯醚萜苷类成分，这种方法不仅步骤繁琐，且纯度不高，因此，由于其特殊药理作用，如何快速、高效地从生药材粗提物中分离并纯化得到总环烯醚萜苷类成分是大家比较关心的课题。
[0003]对独一味总环烯醚萜苷的分离纯化，现有的方法包括:聚酰胺结合大孔吸附树脂法，中压柱层析法。
[0004]聚酰胺结合大孔吸附树脂色谱法:这种方法先利用聚酰胺柱吸附独一味中黄酮类成分，流出液经大孔吸附树脂柱，用50%-70%的乙醇洗脱，所得产品中总环烯醚萜苷的含量为57.91%，回收率为78.22%。(中国实验方剂学杂志，2011，17 (13):32_35)该方法能够用于独一味总环烯醚萜苷的富集，但产品中还包含部分黄酮、苯乙醇苷及未知成分，颜色较深，且步骤繁琐。
[0005]中压柱层析法能够获得高纯度的总环烯醚萜苷，甚至单体成分，但得率太低，一次获得的量太少，不能实现工业化生产。
[0006]目前，活性炭多被用于脱色，但活性炭为非极性吸附，吸附能力最强，可用来分离水溶性物质，尤其是对苷类、糖类和氨基酸等成分的分离。
【发明内容】
[0007]针对现有工艺中存在的问题，本发明旨在提供一种利用活性炭色谱柱一步分离纯化总环烯醚萜苷类成分的方法以得到一个简便、快速、高效的分离独一味总环烯醚萜苷类成分的方法。
[0008]本发明的目的是这样实现的:
一种利用活性炭色谱柱一步分离纯化独一味中总环烯醚萜苷类成分的方法，将独一味地上部分切碎，过40-50目筛，用10倍量的60-70%乙醇在60°C _100°C将40目独一味回流提取三次，每次2 h，合并所得药液，过滤，减压回收溶剂并蒸干得浸膏。取活性炭用水拌匀，湿法装柱，所用柱内径为2.1cm，柱长25cm;取浸膏，用蒸馏水完全溶解后常压上样，待上样完毕，以活性炭为色谱柱固定相，在4BV/h的流速下，用水洗脱5BV以除去杂质至流出液呈无色，再用乙醇为流动相洗脱4BV得到含量达80-90%的独一味总环烯醚萜苷产品。[0009]上述使用的活性炭粒径在0.42-0.5 mm。
[0010]上述色谱柱中活性炭的重量为浸膏重量的8-12倍。
[0011]上述有机溶剂为乙醇，洗脱浓度在60%_90%;活性炭洗脱用乙醇的最佳浓度为90%,收集量为5倍量柱体积。
[0012]独一味总环烯醚萜苷理化性质:白色结晶体，味苦。易溶于水、甲醇；溶于乙醇、正丁醇等溶剂；难溶于氯仿、乙醚、苯等亲脂性溶剂。
[0013]本发明分离纯化中:
根据环烯醚萜苷的理化性质，其可溶于乙醇、丙酮和正丁醇，难溶于氯仿、乙醚、苯等亲脂性有机溶剂，易被酸水解。本发明在采用活性炭柱层析过程中，曾尝试了比较了用正丁醇、丙酮、乙醇作为洗脱系统，得率大小为乙醇 > 丙酮 > 正丁醇。利用高效液相色谱法分析所得样品中8-0-乙酰山桅子苷甲酯的转移率大小为乙醇 > 丙酮 > 正丁醇。综合上述结果，选择乙醇作为洗脱溶剂。
[0014]利用乙醇作为洗脱剂，在保证纯度和回收率的前提下，考察了上样量和洗脱剂的浓度。在其他条件(温度、流速、上样体积)不变的前提下，对上样量考察了 1:24 ；1:12 ；1:8 ；1:6 ；1:4.8 (浸膏量/活性炭量；g/g)五个条件，各组的吸附率分别为97.04%,96.78%、93.5%,76.79%,41.62%,因此，上样量(浸膏量/活性炭量；g/g)优选在1:12_1:8之间。选用30%、50%、70%、90%乙醇浓度进行优选，紫外235nm处考察吸收峰值结果显示洗脱率90%>70%>50%>10% ;采用HPLC法测定其中的8-0乙酰山桅苷甲酯结果得转移率:90%乙醇洗脱82%，70%乙醇洗脱:70%，50%乙醇洗脱:43%，30%乙醇洗脱:12%。以峰面积归一化法计算总环烯醚萜苷的纯度得:90%乙醇洗脱:88.69%, 70%乙醇洗脱:79.04%。优化上述条件，分离纯化独一味中总环烯醚職苷的最佳方案是:活性炭粒径0.42-0.5mm,上样量在1:12_1:8(浸膏量/活性炭量；g/g)之间，洗脱乙醇浓度在90%，洗脱体积为5倍量柱体积。
[0015]活性炭色谱柱优选湿法装柱，所用溶剂为蒸馏水，色谱柱中活性炭的重量为浸膏重量的8-12倍。
[0016]本发明的优点:
独一味中主要包含黄酮类成分、环烯醚萜苷类成分和苯乙醇苷类成分。黄酮类成分在250nm和344nm处有最大吸收峰,环烯醚職苷类成分在235nm处有最大吸收峰,苯乙醇苷类成分在332nm处有最大吸收峰。由图1结果可以看出，由文献(中国实验方剂学杂志，2011，17 (13):32-35)方法所得的独一味总环烯醚萜苷(I)在235nm，285nm和332nm均有最大吸收峰,说明其中不仅包含环烯醚萜苷类成分,还含有苯乙醇苷类成分和黄酮类成分。本发明采用活性炭为固定相，采用90%和70%乙醇洗脱所得的独一味总环烯醚萜苷，其在235nm处有最大吸收峰，而在250nm，332nm, 344nm处并无吸收峰或干扰，表明其不含或极少含有黄酮类和苯乙醇苷类成分。
[0017]本发明所用材料经济、所用方法简单、所用溶剂也易回收，避免了环烯醚萜苷类成分分解变质，此外，应用此发明只需一步即可分离纯化得到含量和得率高的总环烯醚萜苷，避免了多步骤的繁琐及带来的产品损失。本发明高效、快速、工艺简单，可利用简单的设备和经济的分离材料的基础上达到显著的分离效果，具有分离效率高、产品中总环烯醚萜苷类成分的含量达80-90%，并且回收率可达到70-82%。【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为本发明利用活性炭色谱柱一步分离纯化独一味中总环烯醚萜苷类成分的紫外图谱，图中:
1.大孔树脂富集独一味总环烯醚萜苷的紫外图谱；
2.采用活性炭柱，90%乙醇洗脱所得独一味总环烯醚萜苷的紫外图谱；
3.采用活性炭柱，70%乙醇洗脱所得独一味总环烯醚萜苷的紫外图谱。
[0019]【具体实施方式】 实施例1
取500g独一味地上部分切碎，过50目筛，用10倍量的70%乙醇在60°C将50目独一味回流提取三次，每次2 h，合并所得药液，过滤，减压回收溶剂并蒸干得15g浸膏。取5g、40目活性炭用10倍水量拌匀，湿法装柱，所用柱内径为2.1cm，柱长25cm;取Ig浸膏，用5倍体积蒸馏水完全溶解后常压上样，待上样完毕。以活性炭为色谱柱固定相，在4BV/h的流速下，用水洗脱5BV以除去杂质至流出液呈无色，再用70%乙醇为流动相洗脱4BV得到含量达84%的独一味总环烯醚萜苷产品，以8-0乙酰山桅苷甲酯计算，回收率达71.4%。
[0020]实施例2
取500g独一味地上部分切碎，过50目筛，用10倍量的60%乙醇在100°C将50目独一味回流提取三次，每次2 h，合并所得药液，过滤，减压回收溶剂并蒸干得12.5g浸膏。取5g、40目活性炭用10倍水量拌匀，湿法装柱，所用柱内径为2.1cm，柱长25cm;取Ig浸膏，用5倍体积蒸馏水完全溶解后常压上样，待上样完毕。以活性炭为色谱柱固定相，在4BV/h的流速下，用水洗脱5BV以除去大极性物质至流出液呈无色，再90%乙醇为流动相洗脱4BV得到含量达89.4%的独一味 总环烯醚萜苷产品，以8-0乙酰山桅苷甲酯计算，其回收率达85.3%。
[0021]由于活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中较弱，故用有机溶剂脱吸附。以乙醇-水进行洗脱时，随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。因此采用90%乙醇洗脱时，回收率高于70%乙醇洗脱。
【权利要求】
1.一种利用活性炭色谱柱一步分离纯化独一味中总环烯醚萜苷类成分的方法，将独一味地上部分切碎，过40-50目筛，用10倍量的60-70%乙醇将50目独一味在60°C _100°C减压回流提取三次，每次2 h，合并所得药液，过滤，减压回收溶剂并蒸干得浸膏；取活性炭用水拌匀，湿法装柱，所用柱内径为2.1cm，柱长25cm;其特征在于:取浸膏，用蒸馏水完全溶解后常压上样，待上样完毕，以活性炭为色谱柱固定相，在4BV/h的流速下，用水洗脱5BV以除去大极性物质至流出液呈无色，再用乙醇为流动相洗脱4BV得到含量达的独一味总环烯醚萜苷产品。
2.如权利要求1所述一种利用活性炭色谱柱一步分离纯化独一味中总环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于:所述活性炭粒径为0.42-0.5 _。
3.如权利要求1所述一种利用活性炭色谱柱一步分离纯化独一味中总环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于:所述色谱柱中活性炭的重量为浸膏重量的8-12倍。
4.如权利要求1所述一种利用活性炭色谱柱一步分离纯化独一味中总环烯醚萜苷类成分的方法，其特征在于:所述有机溶剂为乙醇、洗脱浓度为60%-90% ;活性炭洗脱用乙醇的最佳浓度为90%，收集量为5倍`量柱体积。
【文档编号】A61K36/53GK103432195SQ201310275118
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月3日 优先权日:2013年7月3日
【发明者】张泉龙, 贾正平, 李茂星 申请人:张泉龙