鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备方法。本发明所涉及的疫苗是采用免疫原性良好的鸡滑液囊支原体HN01株接种于适宜培养基，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，加入油佐剂混合乳化制成。用于预防鸡滑液囊支原体病。此疫苗具有安全性好、免疫效力高等优点。
【专利说明】鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽用生物制品【技术领域】，更具体是涉及一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备方法。
【背景技术】[0002]鸡滑液囊支原体是禽支原体中最重要的致病性菌之一，可感染鸡与火鸡，主要引起关节渗出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎，具有很强的传染性，且常与细菌或病毒混合感染致病，对养鸡业造成了巨大的经济损失。防治MS主要采用药物治疗和免疫接种。体外试验显示，MS对某些抗生素敏感，包括土霉素、恩诺沙星、林可霉素、利高霉素、四环素、泰乐菌素、替米考星等，但MS极易产生耐药性，因此药物控制首先需注意间歇用药、轮换用药和筛选敏感药物，避免耐药性的产生，其次抗生素疗法不能清除鸡群的MS感染；因此免疫接种是控制该病更为有效的措施。疫苗免疫在国外相关试验中已证明可有效控制该病，并在澳大利亚已经广泛应用，但在国内目前尚无成功的疫苗上市。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备方法，用于鸡滑液囊支原体病的免疫预防。
[0004]本发明的目的是通过下述技术方案来实现的。
[0005]一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备方法按照下述步骤和方法制备:
1、制苗用培养基及其制备方法:
(I)基础培养基成分=PPLO肉汤20.0~25.5g、水解乳蛋白5~8 g、酵母浸出粉3~7g、烟酰胺0.3 g、质量浓度为0.4%的酚红溶液2ml、去离子水700~800ml。
[0006](2)成品培养基制备方法:将上述(I)培养基成分121 °C高压灭菌15分钟，冷却后加入滤过除菌的150-200ml猪血清和1000单位/ml青霉素，20%Na0H调PH7.6~7.8，无菌分装，2~8°C保存备用。
[0007]2、鸡滑液囊支原体菌液的培养及灭活疫苗的制备:
(1)将鸡滑液囊支原体按1:10的比例接种于鸡滑液囊支原体成品培养基中，在36~37°C培养24~48h收获作为一级种子液；以同样方法将一级种子液按1:10的比例再接种传代I次收获作为二级种子液；
(2)采用机械搅拌发酵罐连续增菌培养鸡滑液囊支原体菌液:先将发酵罐中鸡滑液囊支原体基础培养基成分进行灭菌，待温度降至37~38°C时，按1:5~1:10的比例接种鸡滑液囊支原体二级种子液。调节PH、补料，采用连续增菌培养方式，PH为7.6~7.8，37°C恒温培养，罐压为0.03~0.05Pa,溶氧量为40%，待PH下降至6.5左右，添加基础培养基为原培养体积的30%，用20%Na0H调PH7.6~7.8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养PH下降到6.4时，加甲醛溶液灭活，连续增菌培养结束，留样检验，置2~8°C保存，不超过2曰。[0008](3)根据活菌计数结果，鸡滑液囊支原体菌液浓度达到IO8~109(XU/mL; (4)鸡滑液囊支原体灭活疫苗的配制与疫苗乳化:取96份灭活菌液，加入4份吐温-80,混匀后作为水相溶液备用；取96份注射用白油，加入4份司本-80,混匀后作为油相溶液备用；将油相溶液和水相溶液按照体积比2.8~3.5:1混和均匀，即获得鸡滑液囊支原体灭活疫苗。
[0009]3、疫苗的检验
(I)物理性状检验:该疫苗为矿物油油包水型，外观应呈乳白色的均匀乳剂。吸取疫苗IOml加入离心管，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.3ml。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第一滴呈云雾状扩散外，以后各滴均不扩散。用Iml吸管(上口内径2.7mm、下口内径1.2mm),吸取25°C左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出
0.4ml所需时间，应在8秒以内。
[0010](2)无菌检验:按现行《中国兽药典》附录进行，应无细菌生长。
[0011](3)安全检验:取7日龄SPF鸡10只，各颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身反应。
[0012](4)效力检验:选择其一进行
免疫攻毒法:用I月龄SPF鸡20只，其中10只颈部皮下注射疫苗0.3ml，另10只不接种，作为对照。30天后，免疫鸡和对照鸡同时各爪垫接种鸡滑液囊支原体培养物0.1 ml(108(XU/ml)，观察14日，观察爪垫肿胀情况，对照鸡全部发病，免疫鸡至少保护8只。
[0013]血清抗体检测法:按上述方法免疫，30天后，连同条件相同的对照鸡10只一起采血，分离血清，测定鸡毒支原体ELISA抗体效价S/P值。免疫鸡ELISA抗体平均S/P值> 0.6，对照鸡平均S/P值应< 0.2。
[0014]本发明的优点在于:(1)使用了发酵罐连续增菌培养工艺，不仅提高了产量，而且还大大降低了生产成本，简化了生产工艺，鸡滑液囊支原体通过此工艺生长滴度可达到
IX 109CCU/ml; (2)该疫苗对不同年龄的鸡均安全，适用于各种年龄的商品肉鸡、蛋鸡和种鸡，对鸡滑液囊支原体引起的鸡腿瘫病的免疫保护率可达8/10以上。疫苗一次接种的有效免疫期为8个月，2~8°C下保存期为12个月。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
I制备培养基
2008年9月21日~22日，配制鸡滑液囊支原体基础培养基3000ml。称量PPLO肉汤84g、水解乳蛋白28 g、酵母浸出粉12g、烟酰胺1.2g、质量浓度为0.4%的酚红溶液8ml、去离子水3000ml，混合后经121°C高压灭菌15分钟。
[0016]成品培养基即在基础培养基基础添加20%左右的猪血清和1000单位/ml青霉素，20%Na0H 调 PH7.7，4°C保存备用。
[0017]2鸡滑液囊支原体菌液的培养及灭活疫苗的制备:
(I)鸡滑液囊支原体二级种子液的繁殖:将鸡滑液囊支原体HNOl株按1:10的比例接种于鸡滑液囊支原体成品培养基，在37°C培养48h，培养物PH值下降至6.6，收获作为一级种子液；以同样方法将一级种子液按1:10的比例再接种传代I次收获作为二级种子液，测定其生长滴度为108_ 5CXUAiL ；
(2)采用机械搅拌发酵罐连续增菌培养鸡滑液囊支原体菌液:在灭菌好的发酵罐配制鸡滑液囊支原体成品培养基，按1:10的比例接种鸡滑液囊支原体二级种子液。用20%Na0H调节PH7.7，37°C恒温培养，罐压为0.05Pa，溶氧量为40%，观察发酵罐电脑显示屏，待PH下降至6.5左右，往发酵罐内无菌添加基础培养基为原培养体积的30%，再次调节PH至7.7，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养PH下降到6.4时，取样留作灭活前样品检测，加甲醛溶液0.2%灭活，期间间隙搅拌，在37°C下灭活24小时后，留样检验，置4°C保存，不超过2日。测定灭活前菌液浓度为109(XU/mL。
[0018](3)鸡滑液囊支原体灭活检验:灭活时间到，将灭活的鸡滑液囊支原体菌液抽样5ml，取0.5ml接种鸡滑液囊支原体成品培养基4.5ml，进行10倍系列稀释至10_5，置37°C培养10天，均无鸡滑液囊支原体生长。
[0019]3疫苗配制
采用一步乳化法，制成油包水油乳剂疫苗。
[0020]水相成分:鸡滑液囊支原体灭活抗原96份即4000ml加入4份吐温-80即2680ml。
[0021]油相成分:取96份注射用白油即116250ml，加入4份司本-80即4840ml。
[0022]乳化方法:现将油相成分进料到均质机内，在将水相成分进料，循环搅拌至充分混合，乳化成乳白色的均匀乳剂灭活苗，批号081101，批量12.5万ml。
[0023]4疫苗检验
(I)物理性状检验:该疫苗为矿物油油包水型，外观应呈乳白色的均匀乳剂。3000r/min离心15分钟不分层。用Iml吸管(上口内径2.7mm、下口内径1.2mm),吸取25°C左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，流出0.4ml所需时间为4秒。
[0024](2)无菌检验:按现行《中国兽药典》附录进行，均无细菌生长。
[0025](3)安全检验:取7日龄SPF鸡10只，各颈部皮下注射疫苗lml，观察14日，无减食、精神沉郁、体温反应、注射局部炎症等不良反应，且全部健活。
[0026](4)效力检验:用I月龄SPF鸡20只，其中10只颈部皮下注射疫苗0.3ml，另10只不接种，作为对照。30天后，连同条件相同的对照鸡10只一起采血，分离血清，测定鸡毒支原体ELISA抗体效价S/P值。结果免疫鸡ELISA抗体平均S/P值>0.6，对照鸡平均S/P值< 0.2。
[0027]实施例2 I制备培养基
2009年4月12日~13日，配制鸡滑液囊支原体基础培养基5250ml。称量PPLO肉汤147g、水解乳蛋白42 g、酵母浸出粉28g、烟酰胺2.lg、质量浓度为0.4%的酚红溶液14ml、去离子水5250ml，混合后经121°C高压灭菌15分钟。
[0028]成品培养基即在基础培养基基础添加20%左右的猪血清和1000单位/ml青霉素，20%Na0H 调 PH7.8，4°C保存备用。
[0029]2鸡滑液囊支原体菌液的培养及灭活疫苗的制备:
(I)鸡滑液囊支原体二级种子液的繁殖:将鸡滑液囊支原体HNOl株按1:10的比例接种于鸡滑液囊支原体成品培养基，在37°C培养48h，培养物PH值下降至6.5，收获作为一级种子液；以同样方法将一级种子液按1: 10的比例再接种传代I次收获作为二级种子液，测定其生长滴度为108_ 5CXUAiL ；
(2)采用机械搅拌发酵罐连续增菌培养鸡滑液囊支原体菌液:在灭菌好的发酵罐配制鸡滑液囊支原体成品培养基，按1:10的比例接种鸡滑液囊支原体二级种子液。用20%Na0H调节PH7.7，37°C恒温培养，罐压为0.04Pa，溶氧量为40%，观察发酵罐电脑显示屏，待PH下降至6.5左右，往发酵罐内无菌添加基础培养基为原培养体积的30%，再次调节PH至7.7，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养PH下降到6.4时，取样留作灭活前样品检测，按
0.2%的比例往培养好的鸡滑液囊支原体菌液中添加甲醛溶液进行灭活，期间间隙搅拌，在37°C下灭活24小时后，留样检验，置4°C保存，不超过2日。测定灭活前菌液浓度为IO9CXU/mL。
[0030](3)鸡滑液囊支原体灭活检验:取灭活的鸡滑液囊支原体菌液，按1:10比例接种鸡滑液囊支原体成品培养基，进行10倍系列稀释至10_5，置37°C培养10天，均无鸡滑液囊支原体生长。
[0031]3疫苗配制
采用一步乳化法，制成油包水油乳剂疫苗。
[0032]水相成分:鸡滑液囊支原体灭活抗原96份即6000ml加入4份吐温_80即250ml 油相成分:取96份注射用白油即173520ml，加入4份司本-80即7230ml
乳化方法:现将油相成分进料到均质机内，在将水相成分进料，循环搅拌至充分混合，乳化成乳白色的均匀乳剂灭活苗，批号090602，批量18.7万ml。
[0033]4疫苗检验
(I)物理性状检验:该疫苗为矿物油油包水型，外观应呈乳白色的均匀乳剂。3000r/min离心15分钟不分层。用Iml吸管(上口内径2.7mm、下口内径1.2mm),吸取25°C左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，流出0.4ml所需时间为3秒。
[0034](2)无菌检验:按现行《中国兽药典》附录进行，均无细菌生长。
[0035](3)安全检验:取7日龄SPF鸡10只，各颈部皮下注射疫苗lml，观察14日，无减食、精神沉郁、体温反应、注射局部炎症等不良反应，且全部健活。
[0036](4)效力检验:用I月龄SPF鸡20只，其中10只颈部皮下注射疫苗0.3ml，另10只不接种，作为对照。30天后，免疫鸡和对照鸡同时各爪垫接种鸡滑液囊支原体培养物0.1 ml(108(XU/ml)，观察14日，观察爪垫肿胀情况。结果对照鸡全部(10/10)发病，免疫鸡8/10保护。
【权利要求】
1.一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备方法，其特征在于其制备抗原用基础培养基及成品培养基制备方法: (I)基础培养基成分=PPLO肉汤20.0~25.5g、水解乳蛋白5~8 g、酵母浸出粉3~7g、烟酰胺0.3 g、质量浓度为0.4%的酚红溶液2ml、去离子水700~800ml。
2.(2)成品培养基制备方法:将上述(I)培养基成分121°C高压灭菌15分钟，冷却后加入滤过除菌的150-200ml猪血清和1000单位/ml青霉素，20%Na0H调PH7.6~7.8，无菌分装，2~8°C保存备用。
3.—种鸡滑液囊支原体灭活疫苗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将鸡滑液囊支原体按1:10的比例接种于鸡滑液囊支原体成品培养基中，在36~37°C培养24~48h收获作为一级种子液；以同样方法将一级种子液按1:10的比例再接种传代I次收获作为二级种子液； (2)采用机械搅拌发酵罐连续增菌培养鸡滑液囊支原体菌液:先将发酵罐中鸡滑液囊支原体基础培养基成分进行灭菌，待温度降至37~38°C时，按1:5~1:10的比例接种鸡滑液囊支原体二级种子液。
4.调节PH、补料，采用连续增菌培养方式，PH为7.6~7.8，37 °C恒温培养，罐压为0.03~0.05Pa,溶氧量为40%，待PH下降至6.5左右，添加基础培养基为原培养体积的30%，用20%Na0H调PH7.6~7.8，如此进行两次增菌培养，待第二次增菌培养PH下降到6.4时，加甲醛溶液灭活，连续增菌培养结束，留样检验，置2~8°C保存，不超过2日。
5.(3)根据活菌计数结果，鸡滑液囊支原体菌液浓度达到IO8~109(XU/mL; (4)所述鸡滑液囊支原体灭活疫苗的配制与疫苗乳化:取96份灭活菌液，加入4份吐温-80,混匀后作为水相溶液备 用；取96份注射用白油，加入4份司本-80,混匀后作为油相溶液备用；将油相溶液和水相溶液按照体积比2.8~3.5:1混和均匀，即获得所述鸡滑液囊支原体灭活疫苗。
【文档编号】A61K9/107GK103495160SQ201310463300
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】丁美娟, 尹秀凤, 汪爱芬 申请人:南京天邦生物科技有限公司