鸡传染性支气管炎病毒疫苗株(hf2株)及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于兽医生物医药领域，涉及一株鸡传染性支气管炎疫苗株HF2及该疫苗株在防制鸡传染性支气管炎中的应用和应用效果。本发明疫苗株的微生物保藏号是：7708。本发明公开的疫苗株安全性良好，对鸡传染性支气管炎具有良好的保护效力。该疫苗株可用于制备防治鸡传染性支气管炎的灭活单苗或联苗，毒株经致弱后可用于制备防治鸡传染性支气管炎的弱毒活疫苗或联苗。
【专利说明】鸡传染性支气管炎病毒疫苗株(HF2株)及其应用
[0001]【技术领域】
[0002]本发明属于兽医生物新医药【技术领域】，涉及一株鸡传染性支气管炎病毒疫苗株及其应用。
【背景技术】
[0003]鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis virus)引起的一种急性高度接触性传染病,该病流行范围广，有养鸡的地方就有该病的存在。各品种、各日龄的鸡均可感染，除引起支气管炎表现咳嗽、喷嚏、气管罗音等呼吸道症状外，在产蛋鸡会造成产蛋下降、蛋品质降低，有些毒株还会造成肾脏病变，严重时造成死亡。IBV感染引起的家禽生产指标下降以及为防控病毒感染投入的疫苗和其他人力物力，造成巨大的经济损失，是危害养鸡生产的最重要顽疾之一。
[0004]鸡传染性支气管炎历史悠久，自1930年在美国北达科塔州首次发现至今已近百年。在传支防控上除严格生物安全措施外，接种疫苗以提高鸡群的抗感染能力是常规手段，传支病毒变异频繁，血清型之间交叉保护差甚至没有交叉保护，随着新的血清型的出现，不断有新的毒株被研发制造疫苗用来防控疾病。有些疫苗株广泛使用如H120系列的疫苗，也有些疫苗局限在当地或几个地方使用如Ark、4/91等。
[0005]疫苗的使用确实对传支的控制做出了巨大贡献。但是，在疫苗的密集使用下传支仍时有发生，且不断有新的变异株出现，传染性支气管炎病毒变异株众多，单一疫苗株只能对同源的毒株产生免疫力，而对异源毒株只能提供部分保护或根本不保护，被公认为传支防控的难题。
[0006]我国在1953年已有呼吸型IB的报道，1982年邝荣禄等在广东首次报道肾型IB发生。Mass型疫苗(H120、H52)是使用最为广泛的疫苗，而且直到90年代Mass型疫苗仍可以很好的控制传支的流行，之后不断有变异株突破H120的防疫，在免疫了 H120的鸡群中分离到高致病的传支毒株像HF2株、QX株、Ql株、A2株、LX4株等。目前广泛使用的疫苗仍然是Mass型疫苗，主要有H52、H120、Ma、W93等毒株，而对新的流行株这些疫苗株已经不能够提供足够保护作用，因此急需研发新的适用当前流行情况疫苗株。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是针对现有传支疫苗毒株不适应新的流行毒株的问题，从临床发病鸡群中筛选出安全高效且能代表当前流行情况的毒株，用该毒株制备疫苗能更好的防制鸡传染性支气管炎。
[0008]本发明所要解决的技术问题是通过如下途径`实现的:
本发明提供一种鸡传染性支气管炎病毒疫苗株HF2，微生物保藏号是:CGMCC N0.7708,分类命名:禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus);保藏时间2013年5月31日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地点:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。[0009]本发明提供的IBV疫苗株HF2的来源于:
2007年安徽某鸡场23日龄的青脚麻鸡发生类似传支疾病，临床上表现为呼吸道症状，剖检主要为肾脏病变肾脏肿大呈“花斑肾”，采集病死鸡肾脏，进行了病毒的分离鉴定、PCR扩增、鸡胚血清中和试验、动物回归实验等病原生物学特性研究，得到一株可代表现在流行毒株的禽传染性支气管炎病毒，命名为IBVHF2株。[0010]IBVHF2株具有如下特性:
(I)病毒适应鸡胚后，在接毒后144小时鸡胚呈现发育小、蜷缩、内脏有尿酸盐沉积等病变。
[0011](2)病毒回归7日龄SPF鸡可复制出和上述临床发病一样病例，主要表现呼吸道症状、消瘦等，死亡率20-40%，剖检可见气管有炎性渗出物，肾脏肿大，尿酸盐沉积等病变。
[0012](3)该病毒的SI基因序列为seq Nol.与疫苗株的同源性不到78%。
[0013](4)将HF2、M41株阳性血清分别与临床分离毒株进行鸡胚中和实验，结果显示:HF2株对最近分离到的毒株保护效果最好。
[0014]本发明提供的鸡传染性支气管炎病毒有益效果如下:
IBVHF2毒株分离自临床发病鸡群，与当前流行毒株同源性高，通过以下两种途径:一、直接灭活后制备灭活苗；二、通过鸡胚连续传代得到安全无致病力且保留免疫原性的弱毒株生产弱毒疫苗；作为疫苗生产用种毒，有针对性预防临床流行毒株，有效解决了免疫Mass型疫苗后依然发病的现状。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明提供的毒株应用领域和形式构成任何限制。
[0016]实施例1传染性支气管炎病毒HF2毒株分离鉴定 一、病毒的分离培养
无菌采集病死鸡肾脏，按1:5的比列加入灭菌生理盐水，研磨，冻融3次，5000rpm离心20min，上清液滤过除菌后尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，鸡胚37°C孵育,每天照胚2次，弃去24小时之内的死亡胚，96小时取5枚收获尿囊液，其余继续孵育至144小时，记录鸡胚病变情况。如此盲传5代。收获的病毒存于-80°C。至第3代鸡胚呈现典型的传支病毒病变，表现鸡胚发育迟缓、胚体蜷缩失水等。至第5代测定病毒含量为105.5EID50/0.1mlo
[0017]二、病毒鉴定 1、血凝性
1-5代收获的尿囊液进行血凝试验。结果各代次尿囊液对1%的鸡红细胞均不发生凝集，病毒无血凝性，排除为正粘病毒、副粘病毒、腺病毒等有血凝性的禽类病毒的可能性。
[0018]2、PCR 鉴定
第五代尿囊液200微升，TAKARA公司RNA提取试剂RNAiso Plus提取病毒RNA，用OIE推荐的SI高变区引物进行RT-PCR。上游5’ -TGA-AAA-CTG-AAC-AAA-AGA-3’下游:5’-CNG-TRT-TRT-AYT-GRC-A-3’，目的条带700bp左右。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果在700bp左右有目的条带，证明分离病毒为IBV。[0019]3、传支SI基因测序与分析
第五代尿囊液200微升，TAKARA公司RNA提取试剂RNAiso Plus提取病毒RNA，用扩增SI基因全长的引物进行RT-PCR。IBVSl上游:AACAAAAGACAGACTTAGT，IBVSl下游:AACTGTTAGTTATGAGCAC ;产物长度1800bp左右。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，目的条带清晰无杂带，直接送至上海美吉公司测序。序列拼接后全长1788bp。序列见SEQ IDNO:1。
[0020]IB VHF2 SI 基因序列提交 Gene bank, Accession No:JX080381。与H120 (EU822341)、H52 (AF352315)、W93 (AY842862)、M41 (DQ664534) ,4/91 (JN192154)、LDT3-A (AY702975)等疫苗株的SI基因进行多重比对，同源性较低均低于85%，分别为77.9%,77.8%,77.7%,77.8%,79.0%、84.5%。与疫苗株相比 IBVHF2 和 LDT3-A 在 70-72 为有3个碱基的插入，IBVHF2、LDT3-A和4/91在361-367有7个碱基插入，此外IBVHF2S1还有多处核苷酸发生变异。Si基因编码的纤突蛋白位于病毒的表面，诱导机体产生中和抗体，与机体的保护反应密切相关。Si基因是病毒演化过程中最易发生变异的基因，其序列相差大于5%可能就不能产生或不能完全产生交叉保护作用。
[0021]4、动物回归试验
7日龄SPF鸡10只，滴鼻点眼途径接种第五代病毒，50微升每只，鸡群在攻毒2天后开始出现临诊症状，6天后开始有鸡只死亡，发病率为100% (10/10)，死亡率为40% (4/10)。发病鸡表现出轻度呼吸道症状，部分鸡精神不振，拉稀，饮水增多，采食量下降。病死鸡极度消瘦，剖检可见肾脏肿大、花斑肾、气管出血、气管粘液等。从第10天以后临床症状逐渐出现好转，到攻毒后14天，基本上恢复正常。用分离到的传支病毒感染易感雏鸡可复制出临床病例。
[0022]5、血清中和试验` 5.1 IBVHF2毒株阳性血清制备:20日龄SPF鸡20只饲养于负压隔离器中，滴鼻点眼途径接种IBVHF2第五代毒，剂量0.1ml/只，10天后将没有死亡的小鸡颈部皮下注射IBVHF2油乳剂灭活苗0.3ml, 14天后再次颈部皮下注射HF2油乳剂灭活苗0.5ml, 10天后心脏采血，无菌分离血清，按每毫升2000单位加入青链霉素，分装备用。
[0023]5.2血清鸡胚半数保护量测定:采用固定病毒稀释血清的方法，IBVHF2、M41病毒分别用灭菌生理盐水稀释至200个EID50/0.lml,M41阳性血清(购自中国兽医药品监察所)与上述自制IBVHF2阳性血清分别用灭菌生理盐水2倍倍比稀释，各稀释度血清(2_5-2_8)分别与相应病毒等量混合，室温中和lh，每组尿囊腔接种6枚10日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，接种后继续孵化至6天后记录鸡胚感染数,参照Reed和Muench方法,计算鸡胚半数保护量(Ero5tl)。结果见表1。
[0024]表1血清的鸡胚半数保护量
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_ WivmM.HTO5_%l_5fi)LfiO-121
5.3鸡胚中和试验:采用固定病毒(200个EID5tl)固定血清(20个EPD5tl)的方法，将以上2种阳性血清与12株2007-2010年间临床分离株和疫苗毒株M41株、IBVHF2株等量混合，置室温中和I小时，分别尿囊腔接种6枚10日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，接种后继续孵化至6天后记录鸡胚感染数。结果见表2。
[0025]表2鸡胚中和试验结果
【权利要求】
1.一种鸡传染性支气管炎病毒疫苗株IBVHF2，微生物保藏号CGMCC No是7708。
2.一种疫苗组合物，其特征在于包含灭活的如权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株和药学上可接受的佐剂。
3.一种疫苗组合物，其特征在于包含致弱的如权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株和药学上可接受的冻干保护剂。
4.权利要求1所述的疫苗株IBVH`F2在制备防制禽传染性支气管炎药物中应用。
【文档编号】A61K39/215GK103497934SQ201310463171
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】许秀梅, 毛火云, 王伟 申请人:南京天邦生物科技有限公司