一种疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种疫苗组合物，其中，该疫苗组合物包括免疫量的鸡新城疫病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒抗原以及鸡滑液囊支原体抗原以及载体。本发明还提供了该疫苗组合物地制备方法和应用。本发明三联苗免疫效果要优于新支二联灭活苗与鸡滑液囊支原体灭活单苗疫苗联用的免疫效果。本发明进一步提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物除上述三中抗原还包括鸡毒支原体抗原，该疫苗组合物能有效抵抗四种病原的攻击。CCTCC NO：V2014252014.08.19
【专利说明】一种疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种疫苗组合物，以及其制备方法和应用，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002] 鸡新城疫病（New Castle disease)，是由副粘病毒引起的高度接触传染性、致死 性疾病，又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，常呈急性败血症状。主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊 舌U黏膜和浆膜出血，死亡率高，对养鸡业危害严重。尚无有效治疗药物，只能依靠严格消 毒、隔离和用灭活苗和活苗疫苗接种预防。
[0003] 鸡传染性支气管炎病是由传染性支气管炎病毒引起的鸡的一种急性高度接触性 呼吸道传染病。各种日龄的鸡都易感，其临诊特征是呼吸困难、发出罗音、咳嗽、张口呼吸、 打喷嚏，本病的发病率高，雏鸡的死亡率可达25%以上。产蛋鸡感染后，产蛋量降低，蛋的品 质下降。肉鸡感染后，生长缓慢，且容易继发呼吸道细菌疾病。本病广泛流行于世界各地， 是养鸡业的重要疫病。
[0004] 鸡滑液囊支原体病是由鸡滑液囊支原体（Mycoplasma Synoviae，MS)引起幼龄 鸡和火鸡的一种传染病，又称鸡传染性滑膜炎（avian onfectious synovitis)，其特征是 关节肿大、滑液囊及肌腱发炎和实质器官的肿大。由于本病发展缓慢，病程长，一旦在鸡群 中感染，根除很困难，因此在鸡群中长期蔓延，导致饲料利用率低、生长发育迟缓、淘汰率增 高、产蛋量下降等。鸡群如存在该病原时，易发生混合感染，加剧病情，死亡率增高，造成严 重的经济损失。
[0005] 近年来鸡滑液囊支原体疾病逐年增加，病鸡发育不良，抵抗力下降，从而引发鸡新 城疫及传染性支气管炎病。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种新的鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡 滑液囊支原体疫苗组合物，对现在流行的三种疫病达到较好的保护效果。
[0007] 本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量 的鸡新城疫病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒抗原以及鸡滑液囊支原体抗原以及载体。
[0008] 优选地，所述的鸡新城疫病毒抗原为活的全病毒抗原、减毒的全病毒抗原、灭活的 全病毒抗原或亚单位抗原；所述的鸡传染性支气管炎病毒抗原为活的全病毒抗原、减毒的 全病毒抗原、灭活的全病毒抗原或亚单位抗原；所述的鸡滑液囊支原体抗原为活的全支原 体抗原、减毒的全支原体抗原、灭活的全支原体抗原或亚单位抗原。
[0009] 优选地，所述的鸡新城疫病毒抗原为灭活的La Sota株全病毒抗原，所述的鸡传 染性支气管炎病毒抗原为灭活的M41株全病毒抗原，所述的鸡滑液囊支原体抗原为灭活的 HNl株全支原体抗原。
[0010] 鸡新城疫病毒La Sota株、鸡传染性支气管炎病毒M41株购于中国兽医药品监察 所。
[0011] 鸡滑液囊支原体 HNl 株（Mycoplasma synoviae strain HN1)保藏号：CCTCC NO : V201425,保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC);保藏地址：中国武汉?武汉大学，保藏 日期：2014年08月19日。
[0012] 本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在 组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分 和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年 龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
[0013] 优选地，所述的鸡新城疫病毒抗原含量为彡108_°EID5(i/0. 1ml，所述的鸡传染性支 气管炎病毒抗原含量为彡106_°EID5(l/0. lml，所述的鸡滑液囊支原体抗原含量为彡IO9CXU/ HlLo
[0014] 优选地，所述的鸡新城疫病毒抗原含量为108_°EID5Q/0. Iml?109_°EID5Q/0. lml，所 述的鸡传染性支气管炎病毒抗原含量为l〇6_°EID5(l/0. Iml?107_°EID5(l/0. lml，所述的鸡滑 液囊支原体抗原含量为IO9CCUAiL?KTCCU/mL。
[0015] 优选地，所述载体包括佐剂，所述佐剂包括油佐剂，水溶性佐剂，铝盐佐剂，细胞因 子佐剂；进一步优选地，所述佐剂包括白油佐剂。。
[0016] 优选地,所述疫苗组合物进一步包括佐剂。
[0017] 术语"佐剂"指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知 的佐剂包括，但不限于：油佐剂，水溶性佐剂，铝盐佐剂，细胞因子佐剂。
[0018] 本发明所用术语"油佐剂"又称"油性佐剂"或"油乳佐剂"，是由包括植物油、动 物油、矿物油中的一种或几种组成，用于延缓免疫原在机体内的存留时间，使之持续缓慢释 放，增强巨噬细胞的吞噬与杀菌能力。
[0019] 本发明所用术语"水溶性佐剂"又称"水基佐剂"或"水佐剂"，是一种聚合物水溶 性分散体，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸类合成聚合物 组成。
[0020] 本发明所用术语"铝盐佐剂"，又称"铝胶佐剂"或"铝佐剂"，包括氢氧化铝佐剂和 磷酸铝佐剂，其主要功能为缓释，但同时具有对免疫细胞的激活作用。将抗原和氢氧化铝或 磷酸铝混合注射，能够使抗原保存在注射部位，具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。
[0021] 本发明所用术语"细胞因子佐剂"，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF- γ、GM-CSF、TNF- a、TNF- β、TCA-3 等，又称"细胞因子" 或"细胞素"，是活体宿主细胞分泌的通过扩散、细胞间接触或血液循环到达宿主其他细胞， 在体液中以极低浓度发挥作用的一类非免疫球蛋白、局部天然蛋白或糖蛋白，也是一类由 机体活化的免疫细胞和某些非免疫细胞产生、分泌，能调节细胞生长、分化，与造血、炎症反 应、免疫应答反应和创伤愈合等密切相关的高活性多功能小分子蛋白的统称，可以刺激或 抑制免疫功能，在免疫应答中促进细胞发育分化、调节细胞生理功能和细胞间信息传递，在 免疫系统中起着非常重要的调控作用。
[0022] 适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述"有效量"是指佐剂在 同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过 度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类 型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
[0023] 优选地，所述的疫苗组合物进一步包括鸡毒支原体抗原，所述鸡毒支原体抗原含 量为彡 109CCU/mL。
[0024] 更优选地，所述的疫苗组合物进一步包括灭活的鸡毒支原体CR全支原体抗原，所 述鸡毒支原体抗原含量为10 9CCU/mL?KTCCU/mL。
[0025] 进一步优选地，所述新城疫全病毒抗原含量为109_°EID5(l/0. 1ml，所述鸡传染性 支气管炎全病毒抗原含量为IO7 ciEID5tlA). lml，所述鸡滑液囊支原体全支原体抗原含量为 109_°(XU/mL，所述鸡毒支原体全支原体抗原含量为10 9_°(XU/mL。
[0026] 本发明的另一目的在于提供一种疫苗组合物的制备方法，其中，所述方法包括： (1)分别培养增殖鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡滑液囊支原体；（2)分别灭活 步骤（1)所述培养增殖的鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡滑液囊支原体；以及 (3)将所述灭活的鸡新城疫病毒全病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒全病毒抗原和鸡滑液 囊支原体全支原体抗原混合，加入佐剂。
[0027] 本专利申请通过鸡胚培养法培养鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒，用发酵 罐制备鸡滑液囊支原体（普莱柯自己分离），甲醛灭活后，制成油佐剂三联灭活疫苗，可同 时预防这三种疾病的发生。
[0028] 本发明的再一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，其中，所述方法包 括：（1)分别培养增殖鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡滑液囊支原体和鸡毒支原 体；（2)分别灭活步骤（1)所述培养增殖的鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡滑液 囊支原体和鸡毒支原体；以及（3)将所述灭活的鸡新城疫病毒全病毒抗原、鸡传染性支气 管炎病毒全病毒抗原、鸡滑液囊支原体全支原体抗原和鸡毒支原体全支原体抗原混合，力口 入佐剂。
[0029] 优选地，所述佐剂为白油佐剂。
[0030] 本发明的又一目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗鸡新城疫病 毒、鸡传染性支气管炎病毒以及鸡滑液囊支原体感染的相关疾病的药物中的应用。
[0031] 本发明的还一目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗鸡新城疫病 毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡滑液囊支原体以及鸡毒支原体感染的相关疾病的药物中的 应用。
[0032] 本发明可以应用的鸡新城疫相关疾病的非穷举性列表包括，如呼吸道、消化道粘 膜出血，产蛋量下降等。
[0033] 本发明可以应用的鸡传染性支气管炎相关疾病的非穷举性列表包括，如呼吸困 难、罗音、咳嗽、张口呼吸、打喷嚏、产蛋量下降等。
[0034] 本发明可以应用的鸡滑液囊支原体相关疾病的非穷举性列表包括，如关节肿大、 滑液囊及肌腱发炎、实质器官的肿大、生长发育迟缓、产蛋量下降等。
[0035] 术语"预防"指通过其与鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒以及滑液囊支原体相 关的感染或疾病的症状被阻断或延迟；术语"治疗"指通过与鸡新城疫病毒、传染性支气管 炎病毒以及滑液囊支原体相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0037] 本发明实施例以鸡新城疫毒种LaSota株、鸡传染性支气管炎毒株为M41株、鸡滑 液囊支原体HNl株、鸡毒支原体CR株为例说明本发明。
[0038] 实施例1鸡新城疫、传染性支气管炎病毒液及滑液囊支原体菌液的的制备
[0039] 1.毒株的选择
[0040] 制造本品用新城疫毒种LaSota株，传染性支气管炎毒株为M41株，均购自中国兽 药监察所。滑液囊支原体为实验室自行分离鉴定，为HNl株。
[0041] 2.病毒液制备
[0042] 2. 1鸡新城疫病毒La Sota株制苗用病毒液制备
[0043] 2. I. 1 接种
[0044] 取生产用毒种，用无菌生理盐水稀释至ΚΓ3,经尿囊腔接种10日龄易感鸡胚，每胚 0. lml，接种后封闭针孔，直36?37 C继续鮮育，不必翻蛋。
[0045] 2. 1.2孵育与观察
[0046] 鸡胚接种后，每日照蛋1次，将48小时前死亡的鸡胚弃去，此后，每8?12小时照 蛋1次，随时取出死亡鸡胚，直至120小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于 2?8°C冷却12?24小时。
[0047] 2. 1. 3 收获
[0048] 将冷却后的鸡胚取出，先以碘酊，后以酒精消毒后，逐胚收获鸡胚液。每若干个鸡 胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌容器内，每组抽样测定血凝价，血凝价低于1 : 128 (微 量法）者应弃去，置-15°C以下保存，应不超过30日。
[0049] 2. 1. 4 检验
[0050] 2. 1. 4. 1无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，抽样的病毒液无菌生长。
[0051] 2. 2鸡传染性支气管炎病毒M41株制苗用病毒液制备
[0052] 2. 2. 1 接种
[0053] 取生产用毒种，用无菌生理盐水稀释至ΚΓ3,经尿囊腔接种10日龄易感鸡胚，每胚 0. Iml。接种后封闭针孔，直36?37 C继续鮮育，不必翻蛋。
[0054] 2. 2. 2孵育与观察
[0055] 鸡胚接种后，24小时前照蛋1次，弃去死胚。此后，每8?12小时照蛋1次，随时取 出死亡鸡胚，直至48小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2?8°C冷却12? 24小时。
[0056] 2. 2. 3 收获
[0057] 将冷却后的鸡胚取出，先以碘酊，后以酒精消毒后，逐胚收获鸡胚液。每若干个鸡 胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌容器内，置-15°C以下保存，应不超过30日。
[0058] 2. 2. 4 检验
[0059] 2. 2. 4. 1无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，抽样的病毒液无菌生长。
[0060] 3.支原体菌液的制备
[0061] 3. 1培养基配方
[0062] 基础培养基成分：PPLO肉汤24. 5g、水解乳蛋白7g、酵母浸出粉6g、烟酰胺0. 3g、 质量浓度为〇. 4%的酚红溶液2ml去离子水800ml。
[0063] 成品培养基制备方法：将上述培养基121°C高压灭菌15分钟，冷却后加入滤过除 菌的125ml猪血清和80万单位青霉素，0. OlMNaOH调节pH至7. 6?7. 8,无菌分装，2?8°C 保存备用。
[0064] 3. 2菌液的增殖
[0065] 将鸡滑液囊支原体按1 :10的比例接种于鸡滑液囊支原体成品培养基中，在36? 37°C培养24?48h收获作为一级种子液；以同样方法将一级种子液按I : 10的比例再接种 传代1次收获作为二级种子液；纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养。测定鸡滑液囊 支原体菌液浓度达到10n(XU/mL。
[0066] 3. 3 灭活
[0067] 将收获的病毒液经0. 1%甲醛37°C灭活20小时，将鸡滑液囊支原体菌液，按菌液 体积总量缓慢加入终浓度为〇. 2%的甲醛溶液（V/V)，放37°C灭活，其间每隔4小时搅拌一 次，24h后取出。
[0068] 3. 3. 1灭活检验
[0069] 取灭活后菌液IOml接种于IOOml液体培养基中37°C培养4?7d，再按相同比例 移植于上述培养基IOOml中37°C培养4?7d ;另外，取灭活后菌液0. 5ml接种于固体培养 基，37°C培养7?10d。上述两种方法培养的结果均无菌生长。
[0070] 3. 3. 2无菌检验
[0071] 取灭活过的菌液，按《中华人民共和国兽药典》附录页进行，结果无菌生长。
[0072] 4病毒液的浓缩
[0073] 4. 1浓缩装置的灭菌
[0074] 预过滤柱、容器、管道等采用高压蒸汽121°C灭菌40分钟，超滤膜包清洗后排净膜 包内水分，用2%甲醛溶液循环5?10分钟，关闭循环泵，使甲醛溶液在膜包内保持24小时 以上，使用前放掉甲醛溶液，用无菌注射用水反复冲洗至PH值为7. 0?7. 2。
[0075] 4. 2 浓缩
[0076] 分别取实施例1中所制备的鸡新城疫、鸡传染性支气管炎病毒，然后将病毒液在 无菌条件下用灭菌的二级预过滤柱滤过，除去病毒液的残渣和其他杂质。再用上述超滤浓 缩装置，将病毒液连续循环，水分不断渗出，完成病毒浓缩过程。浓缩结束后，用蒸馏水将超 滤膜包的残留物冲洗出来，然后用〇. 4mol/L NaOH溶液反复循环冲洗30分钟，停止循环，使 NaOH溶液在膜包内保持10小时以上，再用蒸馏水将NaOH洗净，用甲醛溶液浸泡消毒。
[0077] 4. 3浓缩后病毒含量测定
[0078] 将浓缩后的鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒，分别测定EID5tl，每0. Iml鸡新 城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒含量分别为10'1〇8。
[0079] 实施例2疫苗的配制
[0080] 1油相制备
[0081] 取注射用白油94份，加司本-806份混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明 为止，高压灭菌后备用，即为油相。
[0082] 2水相制备
[0083] 将抗原按比例混合于无菌容器中，加入4%灭菌并冷却后的吐温-80,边加边搅 拌，使吐温-80完全溶解为止，即为水相。
[0084] 3 乳化
[0085] 取油相3份置油相罐内，开动电机搅拌，然后徐徐加入1份水相，加完后转入乳 化罐中，再以2800r/min乳化40分钟即可。在乳化终止前加入1 %硫柳汞，使其终浓度为 0.01%。疫苗的具体配方如下表。
[0086] 表1疫苗成分及含量
[0087]
【权利要求】
1. 一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的鸡新城疫病毒抗原、鸡传染性 支气管炎病毒抗原以及鸡滑液囊支原体抗原以及载体。
2. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述的鸡新城疫病毒抗原为活的全病毒 抗原、减毒的全病毒抗原、灭活的全病毒抗原或亚单位抗原；所述的鸡传染性支气管炎病毒 抗原为活的全病毒抗原、减毒的全病毒抗原、灭活的全病毒抗原或亚单位抗原；所述的鸡滑 液囊支原体抗原为活的全支原体抗原、减毒的全支原体抗原、灭活的全支原体抗原或亚单 位抗原。
3. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述的鸡新城疫病毒抗原为灭活的La Sota株全病毒抗原，所述的鸡传染性支气管炎病毒抗原为灭活的M41株全病毒抗原，所述 的鸡滑液囊支原体抗原为灭活的HN1株全支原体抗原。
4. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述的鸡新城疫病毒抗原含量为 彡108_ °EID5Q/0. lml，所述的鸡传染性支气管炎病毒抗原含量为彡106_ °EID5Q/0. lml，所 述的鸡滑液囊支原体抗原含量为> 109CCU/mL;优选地，所述的鸡新城疫病毒抗原含 量为108_ °EID5Q/0. lml?109_ °EID5Q/0. lml，所述的鸡传染性支气管炎病毒抗原含量为 106_°EID5(l/0. lml?107_°EID5(l/0. lml，所述的鸡滑液囊支原体抗原含量为109CCU/mL? 1010CCU/mL。
5. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述载体包括佐剂，所述佐剂包括油佐 齐U，水溶性佐剂，铝盐佐剂，细胞因子佐剂；优选地，所述佐剂包括白油佐剂。
6. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述的疫苗组合物进一步包括鸡毒支原 体抗原，所述鸡毒支原体抗原含量为> 109CCU/mL。
7. 根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述的疫苗组合物进一步包括灭活的鸡 毒支原体CR全支原体抗原，所述鸡毒支原体抗原含量为10 9(XU/mL?KTCXU/mL。
8. 根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中，所述鸡新城疫全病毒抗原含量为 109_°EID5(l/0. lml，所述鸡传染性支气管炎全病毒抗原含量为107_°EID5(l/0. lml，所述鸡滑液 囊支原体全支原体抗原含量为109_°CCU/mL，所述鸡毒支原体全支原体抗原含量为10 9_°CCU/ mL〇
9. 一种制备权利要求1所述疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括： (1) 分别培养增殖鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡滑液囊支原体； (2) 分别灭活步骤（1)所述培养增殖的鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡滑 液囊支原体；以及 (3) 将所述灭活的鸡新城疫病毒全病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒全病毒抗原和鸡 滑液囊支原体全支原体抗原混合，加入佐剂。
10. -种制备权利要求6所述疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括： (1) 分别培养增殖鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡滑液囊支原体和鸡毒支原 体； (2) 分别灭活步骤（1)所述培养增殖的鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡滑液 囊支原体和鸡毒支原体；以及 (3) 将所述灭活的鸡新城疫病毒全病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒全病毒抗原、鸡滑 液囊支原体全支原体抗原和鸡毒支原体全支原体抗原混合，加入佐剂。
11. 根据权利要求1所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗鸡新城疫病毒、鸡传染性支 气管炎病毒以及鸡滑液囊支原体感染的相关疾病的药物中的应用。
12. 根据权利要求6所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗鸡新城疫病毒、鸡传染性支 气管炎病毒、鸡滑液囊支原体以及鸡毒支原体感染的相关疾病的药物中的应用。
【文档编号】A61K39/395GK104258389SQ201410473510
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】张许科, 孙进忠, 李雪锋, 李成山, 田克恭 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司