一种纺锤体驱动蛋白(Eg5)单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种Eg5单克隆抗体(anti-Eg5)、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述单克隆抗体能够有效的标记高表达Eg5蛋白的非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌以及前列腺癌，其抗体ELISA效价可以达到1.6×106。
【专利说明】一种纺锤体驱动蛋白(Eg5)单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种纺锤体驱动蛋白(Eg5)的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及所述的抗体的应用。
【背景技术】
[0002]在癌细胞中，通常会特异性的发生某些基因的异常，如果能找到某种基因异常，导致它所编码的蛋白质表达或者定位发生改变，就能将该蛋白作为癌症诊断和治疗的靶分子。
[0003] 纺锤体驱动蛋白(Eg5)在有丝分裂早期对双极纺锤体的形成和复制染色体的分离起着至关重要的作用⑴。在许多肿瘤细胞中都表达Eg5蛋白。Eg5在小细胞肺癌、前列腺癌及许多淋巴瘤细胞中持续高表达，扰乱了纺锤体的正常组装，最终导致纺锤体的缺失、基因组不稳定性以及肿瘤的发生。因此对于高表达Eg5的肿瘤，可以通过特异抑制Eg5的驱动蛋白活性，从而起到抗肿瘤的效果。因此，Eg5已成为一个具有吸引力的肿瘤化疗的靶点。目前开发出许多特异抑制Eg5活性的药物⑵。1999年报道了第一个小分子Eg5蛋白抑制剂monastrol?,由于其能诱导单星样纺锤体(monoastral spindle)的形成而得名。该药能特异性的结合Eg5蛋白并抑制其功能，诱导增殖的肿瘤细胞停滞在有丝分裂期，并促使细胞凋亡。Eg5蛋白抑制剂不作用于微管，不能被P-糖蛋白转移到细胞外，可克服由于P-糖蛋白过表达而引起的多重耐药性，故对紫杉烷类耐药的肿瘤也能起到有效的治疗效果。鉴于monastrol的有效的抗肿瘤细胞增殖作用，大量小分子Eg5抑制剂被相继研究开发出来。
[0004]S (MeO) TLC (S_ (methoxytrityl) -L-cysteine)⑷,一种强有力的细胞渗透性小分子Eg5蛋白抑制剂。S(MeO)TLC能特异性的与Eg5蛋白结合，诱导单极纺锤体的形成，其抑制细胞增殖。已有研究报道了 S(MeO)TLC作为新型的Eg5蛋白靶向抑制剂，在膀胱癌、肾癌以及前列腺癌中表现出强有力的抗癌效能，并且相比以往报道的大量Eg5抑制剂，有效给药浓度更低、疗效更好、安全性和靶向特异性更高。
[0005]Eg5相关的化疗药物的效果与Eg5的表达水平有密切关系。例如在非小细胞肺癌患者中，Eg5阳性的肿瘤化疗有效率是37%。而Eg5阴性的化疗有效性只有10%，表明Eg5的表达与化疗的效果是高度相关的，Eg5的表达情况可以预测非小细胞肺癌的化疗效果。检测肿瘤中的Eg5蛋白表达量，能够为肿瘤的治疗提供有力的用药依据，指导合理有效的用药。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种Eg5单克隆抗体(anti_Eg5)、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0007]本发明所述的杂交瘤细胞为抗人Eg5杂交瘤细胞系3F1，该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为=CGMCC N0.8353。保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期2013年10月17日，分类名为“小鼠杂交瘤细胞株”。
[0008]本发明还涉及所述单克隆抗体在制备抗肿瘤药物辅助制剂或诊断试剂中的应用，所述的肿瘤包括但不限于非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌以及前列腺癌。
[0009]本发明所述的抗肿瘤药物辅助制剂包括但不限于，用于制定临床给药策略的阳性反应检测试剂、所述阳生反应为特定个体的Eg5蛋白高表达；或是用做特定抗肿瘤药物的偶联剂以增强该药物的祀向定位效果，所述的祀向定位为祀向Eg5蛋白。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1、SDS-PAGE分析纯化后的GST_Eg5重组抗原。Lanel:未诱导的细菌全细胞裂解液；Lane2:1PTG诱导的细菌全细胞裂解液；Lane3:1PTG诱导的细菌裂解液上清；Lane4:IPTG诱导的细菌裂解液沉淀；Lane5:纯化的GST_Eg5重组抗原；M:蛋白marker。
[0011]图2、SDS-PAGE分析纯化后的Eg5单克隆抗体。
[0012]图3、免疫印迹法(Western blot)检测 Eg5 在 A549 (Lanel)、HeLa (Lane2)和PC-3(Lane3)细胞中的表达。Eg5单克隆抗体的稀释倍数分别为1:5000和I: 10000。
[0013]图4、免疫沉淀法纯化HeLa细胞中的Eg5蛋白。
[0014]图5、免疫共沉淀检测Eg5和DCTNl的相互作用。
[0015]图6、免疫荧光检测PC-3细胞中Eg5蛋白的定位。
【具体实施方式】
[0016]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0017]试剂、酶、载体及细胞株:
[0018](I)、细胞株:HeLa(ATCC? CCL-2?)、大肠杆菌Rosetta(DE3) (Novagen)、骨髓瘤细胞 SP2 / O ( ATCC? CRL-1581?) ；A549 ( ATCC? CCL-185?)、PC3 ( ATCC? CRL-1435?)
[0019](2)、实验动物:雌性BALB / c小鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司);
[0020](3)、载体:pET41a (Novagen)
[0021](4)、酶及抗体试剂:构建载体过程和PCR过程的各种酶购自Fermentas，ELISA实验所用抗体 ant1-mouse IgG / HRP (Jackson ImmunoResearch), ELISA 底物 TMB (Sigma)、逆转录试剂盒(Fermentas), BSA购自(北京元亨金马生物科技有限公司)
[0022](5)、其他试剂如无特别说明为国产分析纯。
[0023]实施例1:杂交瘤细胞株3F1及其产生的单克隆抗体的获得。
[0024]1.抗原制备
[0025](I)获得目的基因
[0026]在该实施例中，根据Eg5的基因序列(NM_004523)的编码框，设计一对特异引物:
[0027]引物1:5’ -ATGGATCCATCACTGAGAAATCAGATGGACGT-3’
[0028]引物2:5，-AGAATTCTTAAAGGTTGATCTGGGCTCGCAGAGGT-3 ’
[0029]Trizol Reagent试剂提取HeLa细胞总RNA，将总RNA反转录为cDNA并以cDNA为模板PCR扩增Eg5基因。
[0030]抗原蛋白DNA序列为:
【权利要求】
1.一种分泌抗Eg5蛋白单克隆抗体(ant1-Eg5)的杂交瘤细胞株3F1,该细胞株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.8353。
2.权利要求1所述的细胞株3F1分泌的抗Eg5蛋白单克隆抗体(ant1-Eg5)。
3.根据权 利要求1或2任一所述的细胞株3F1或抗体ant1-Eg5在制备抗肿瘤药物辅助制剂或诊断试剂中的应用。
【文档编号】A61K39/395GK103740648SQ201310581771
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】邱俊康, 聂子梅 申请人:成都正能生物技术有限责任公司, 邱俊康, 聂子梅