齐墩果酸在制备预防和治疗胆汁淤积症药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开齐墩果酸在制备预防和治疗胆汁淤积症药物中的应用。通过实验以过量给予石胆酸造成小鼠肝损伤为模型，协同给予齐墩果酸5~20mg/kg后，能有效减轻肝损伤和降低胆汁酸水平，具体表现为小鼠存活率显著升高，血清中ALT，AST和ALP的活性显著降低，肝组织坏死程度显著减轻，同时血清中的总胆汁酸与总胆红素含量，以及肝脏中的总胆汁酸含量也有显著的降低。肝脏基因与蛋白表达分析证实齐墩果酸能够显著上调Mrp2,Mrp3,Mrp4表达，并且激活Nrf2，但对其它的胆汁酸转运体和代谢酶无显著影响。结果表明齐墩果酸能够预防治疗石胆酸所诱导的胆汁淤积性肝损伤，机制涉及Nrf2-Mrps通路。
【专利说明】齐墩果酸在制备预防和治疗胆汁淤积症药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药领域，具体涉及齐墩果酸在制备预防和治疗胆汁淤积症药物中的应用。
【背景技术】
[0002]胆汁淤积是一种体内循环或者肝脏滞留过多的毒性胆汁酸而产生肝损伤的临床症状，最终可能发展成为致命性的肝疾病，例如原发性胆汁性肝硬化和硬化性胆管炎等。胆汁淤积的形成可能由于肝细胞胆汁分泌紊乱或者胆管阻塞造成。石胆酸(LCA)是一种毒性较强的疏水性次级胆汁酸，是由肠道细菌将鹅去氧胆酸(CDCA)的7a位去羟基化后生成。 在慢性胆汁淤积性疾病患者的血中可检测到LCA水平的显著增加，并且研究发现在患者体循环中累积的LCA被认为能导致肝损害。此外，在动物水平上，给予小鼠过量的LCA能造成胆管部分梗阻以及胆管炎。因此，LCA作为一种胆汁淤积的造模药物广泛用于胆汁淤积治疗药物的研发中。
[0003]齐墩果酸作为一个五环三萜类的化合物广泛存在于一些药用植物中，在我国齐墩果酸已经成为OTC药物被用于治疗急慢性肝炎。国内外对齐墩果酸药理作用的报道主要有抗炎，糖尿病治疗以及抗肿瘤等，此外齐墩果酸被报道具有显著的肝保护作用，能够用于多种肝毒性药物如对乙酰氨基酚，四氯化碳等所致肝损伤的保护与治疗。最近有报道齐墩果酸能够导致小鼠的胆汁淤积，所用剂量高达90 mg/kg或以上，机制为影响调控胆汁酸稳态的基因表达，但并无特定指出齐墩果酸具体是通过影响哪些基因的表达来导致胆汁淤积， 同时导致胆汁淤积的剂量高于齐墩果酸以往报道的肝保护剂量4倍左右。在低剂量下，齐墩果酸能否预防治疗胆汁淤积尚未有报道，本发明旨在通过动物实验揭示齐墩果酸能否在低剂量下预防和治疗LCA所诱导的小鼠胆汁淤积症，并探讨其内在机制。
【发明内容】
[0004]本发明的发明目的在于提供齐墩果酸在制备预防和治疗胆汁淤积症药物中的应用。
[0005]本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现:
齐墩果酸在制备预防和治疗胆汁淤积症药物中的应用。
[0006]本发明所述药物还包括赋形剂和助剂等医药领域常规的药物载体，如填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂，矫味剂、防腐剂等。
[0007]所述填充剂可选自淀粉、蔗糖、甘露醇或乳糖。
[0008]所述黏合剂可选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮。
[0009]所述湿润剂可选自甘油。
[0010]所述崩解剂可选自琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠。
[0011]所述吸收促进剂为本领域公知的吸收促进剂，可选自季胺类化合物、脂肪酸及其混合物等。优选的，季胺类化合物为烷基二甲基苄基氯化铵或烷基二甲基乙基苄基氯化胺，脂肪酸为葵酸、油酸或其单甘油脂。
[0012]所述表面活性剂可选自滑石粉、硬脂酸镁或钙和聚乙二醇。
[0013]所述矫味剂可选自糖精钠、蔗糖或甜蜜素。
[0014]所述防腐剂可选自苯甲酸、山梨酸或尼泊金。
[0015]本发明所述药物可以为医药领域常规剂型，包括胶囊剂、颗粒剂、片剂、散剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等。
[0016]根据实际需要，所述药物的剂型还可以是缓释剂或控释剂。
[0017]本发明将齐墩果酸用于制备预防和治疗胆汁淤积症药物，预防和治疗胆汁淤积症是指通过激动Nrf2,上调胆汁酸外排转运体Mrp2, Mrp3, Mrp4的表达,从而增加胆汁酸的外排来实现的，而不是通过降低胆汁酸摄入转运体0atplb2和Ntcp基因表达、增加胆汁酸外排转运体Bsep基因表达、增加胆固醇外排转运体Mdr3基因表达、增加胆汁酸代谢相关酶 Cyp3all, Cyp2bl0, Cyp7al, Sult2al和Ugtlal基因表达、以及增加胆汁酸稳态相关核受体Pxr, Car和Fxr基因表达来实现的。
[0018]本发明具有如下有益效果:
本发明实验以过量给予石胆酸造成小鼠肝损伤为模型，协同给予齐墩果酸5，10，20 mg/kg后，能有效减轻肝损伤和降低胆汁酸水平，具体表现为小鼠存活率显著升高，血清中 ALTjAST和ALP的活性显著降低，肝组织坏死程度显著减轻，同时血清中的总胆汁酸与总胆红素含量，以及肝脏中的总胆汁酸含量也有显著的降低，结果表明齐墩果酸能够预防治疗石胆酸所诱导的胆汁淤积性肝损伤。肝脏基因与蛋白表达分析证实齐墩果酸能够显著上调 Mrp2, Mrp3, Mrp4表达，并且激活Nrf2，但对其它的胆汁酸转运体和代谢酶无显著影响。 结果表明齐墩果酸能够预防和治疗石胆酸所诱导的胆汁淤积性肝损伤， 机制涉及Nrf2-Mrp 通路。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为齐墩果酸逆转石胆酸所致小鼠存活率的下降结果图；
图2为齐墩果酸减轻石胆酸所致肝坏死程度结果图；
图3为齐墩果酸剂量依赖性逆转石胆酸所致小鼠血清生化指标的升高结果图；
图4为齐墩果酸剂量依赖性逆转石胆酸所致小鼠血中总胆汁酸和总胆红素，以及肝中总胆汁酸水平的升高结果图；
图5为齐墩果酸对小鼠胆汁酸胆汁酸转运体基因表达的影响结果图；
图6为齐墩果酸对小鼠胆汁酸代谢酶基因表达的影响结果图；
图7为齐墩果酸对Nrf2以及胆汁酸稳态调控相关核受体的影响结果图；
图8为齐墩果酸对小鼠Mrp转运体以及核内Nrf2蛋白表达的影响结果图。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
[0021]实施例1 (一)材料与方法1、主要仪器:
5417-R低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；多功能酶标仪(美国Molecular devices 公司)；Mini_protein3 电泳系统(美国 Bio-Rad 公司)；Mini Trans-Blot 转移系统 (美国 Bio-Rad 公司);ImageQuant LAS 4000 曝光成像仪(美国 General Electric 公司);梯度 PCR 仪(德国 Eppendorf 公司);7500 Real Time PCR System (美国 Applied Biosystems 公司)。
[0022]2、药品和试剂
齐墩果酸，石胆酸(纯度> 98%，上海阿拉丁试剂有限公司)，玉米油(药用级，上海阿拉丁试剂有限公司)；Pregnenolone_16 a-Carbonitrile (PCN)(纯度> 98%, Sigma 公司)； ALT、AST、ALP、总胆汁酸、总胆红素检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠Nrf2干扰序列(广州锐博公司)；Trizol试剂、RT-PCR试剂盒，qRT-PCR试剂盒(Takara公司)；Nrf2、 Mrp2> Mrp3 一抗(Santa cruz公司)；Mrp4—抗(Abeam公司)；RIPA裂解液、核蛋白提取试剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所);ECL发光液(北京英格恩生物科技公司)；其它试剂均为分析纯级别。
[0023](二)实验动物及给药方案
C57BL/6小鼠，雄性，周龄8-9周，由中山大学(大学城)实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK(粤)2011-0029，正常小鼠用维持饲料喂养。齐墩果酸(5，10，20 mg/kg)溶于含2%吐温80的生理盐水；石胆酸(125 mg/kg)与PCN (50 mg/kg)溶于玉米油。小鼠随机分成7组，每组6-12只，组别为空白对照组、高剂量齐墩果酸组、石胆酸造模组、石胆酸+低剂量齐墩果酸组、石胆酸+中剂量齐墩果酸组、石胆酸+高剂量齐墩果酸组以及石胆酸+PCN 组。齐墩果酸、石胆酸和PCN的给药方式均为腹腔注射，其中齐墩果酸与PCN连续给药7天， 每天一次，而石胆酸在第四天开始协同给药，共给药4天，每天两次。最后一次给药后24h 处理小鼠，计算每组小鼠存活率，解剖后对在体的肝脏及胆囊的形态进行拍照，然后收集血清以及肝脏，每组取三只小鼠部分肝脏置于10%甲醛中固定，其它样本在_80°C冷冻保存备用。
[0024](三)肝组织与血清化学检测`肝组织切片与H&E染色由中山大学实验动物中心病理切片室完成，血清中的ALT，AST, ALP,总胆汁酸，总胆红素以及肝脏中的总胆汁酸检测方法按照试剂盒的说明书来完成。
[0025](四)qRT-PCR
按照Trizol试剂的说明书得到小鼠肝细胞总RNA，按照RT试剂盒说明书得到cDNA， 按照qRT-PCR试剂盒说明书检测特定基因的mRNA表达量。实验涉及的引物序列如表1所述。
[0026]表1.引物序列
【权利要求】
1.齐墩果酸在制备预防和治疗胆汁淤积症药物中的应用，其特征在于，所述药物中齐墩果酸的含量为5~20 mg/kg。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物还包括药物载体。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述药物载体选自填充剂、粘合剂、湿润剂、 崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂，矫味剂或防腐剂中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述填充剂为淀粉、蔗糖、甘露醇或乳糖；所述黏合剂为纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述湿润剂为甘油；崩解剂为琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠。
6.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述吸收促进剂为季胺化合物或脂肪酸。
7.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述表面活性剂为滑石粉、硬脂酸镁或钙和聚乙二醇；所述矫味剂为糖精钠、蔗糖或甜蜜素。
8.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述防腐剂为苯甲酸、山梨酸或尼泊金。
9.根据权利要求1-8中任一项所述应用，其特征在于，所述药物的剂型包括胶囊剂、颗粒剂、片剂、散剂、溶液剂、乳剂、混悬剂。
10.根据权利要求1-8中`任一项所述应用，其特征在于，所述药物的剂型包括缓释剂或控释剂。
【文档编号】A61P1/16GK103599108SQ201310585202
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】黄民, 毕惠嫦, 陈攀, 范晓梅, 姜伊鸣 申请人:中山大学