一种检测进行性家族性肝胆汁淤积症基因突变的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于试剂盒领域，特别涉及一种检测进行性家族性肝胆汁淤积症基因突变 的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 进行性家族性肝内胆汁淤积症是一种严重的胆汁淤积性肝病，为常染色体隐性遗 传疾病。主要是由于基因突变而造成肝细胞和胆管上皮细胞上各功能蛋白的生成、修饰、调 控缺陷导致肝细胞性胆汁淤积，通常在婴儿期或儿童期起病，最终发展为肝衰竭。根据其致 病基因不同，PFIC主要分为3型:①PFICl(Byler病）由ATP8B1基因突变引起，导致该基因编 码的P型ATP酶-FIC1缺陷，PFIC1患者肝细胞胆汁酸过负荷，不过FIC1缺陷如何进展成胆汁 齡积尚不清楚；②PFIC2源于编码胆盐排泄栗(bilesaltexportpump，BSEP)蛋白的基因 ABCB11突变，影响了毛细胆管膜胆盐转运蛋白（BSEP)的表达，导致胆盐分泌降低，从而使得 肝细胞内胆盐聚积而造成严重损伤;③PFIC3为编码多药耐药糖蛋白（MDR3)的ABCB4基因的 突变，影响了毛细胆管磷脂转运器，导致磷脂输出障碍。
[0003]该病为一种罕见疾病，其确切发病率目前不明，发病率即便在美国尚未有确切报 道，但是在一些具有近亲婚配文化习俗的人群中发病率要高一些。本病男女发病率相似，主 要发生于婴幼儿和儿童，在儿童期或青春期可因肝功能衰竭致死。估计新生儿发病率约1/ 50000到1/100000之间，占儿童胆汁淤积原因的10%到15%，占儿童肝移植的10%到15%。 三种型的PFIC临床表现有所不同：①PFIC1患者通常在出生后几周就发病，表现为瘙痒和黄 疸。在发病早期可呈间歇性，但逐渐发展为持续性症状;②PFIC2没有PFIC1的肝外症状，而 肝病的临床表现及病情进展却较PFIC1剧烈。出生后几个月就表现出持续性的胆汁淤积性 黄疸，可很快进展为急性肝衰竭;③PFIC3发病稍晚，通常在生命的头几年，少数会在学龄期 甚至青少年时期才起病，表现为胆汁淤积和瘙痒，但瘙痒程度较PFIC1和PFIC2轻。所有类型 PFIC均呈世界性分布，2/3的PFIC病例是PFIC1、PFIC2,其余1/3病例是PFIC3。
[0004] 与PFIC1相关的ATP8B1基因位于18q21-22。突变分析表明，PFIC1的ATP8B1基因突 变多是无义突变和缺失突变，严重影响了FIC1蛋白功能，而且许多FIC1病患者是复合杂合 子，更难以明辨基因型-表型相关性。PFIC2基因型-表型相关性亦不明了，ABCBll(BSEP)位 于2q24-31，含有28个外显子。但大多数BSEP突变儿童，不论其突变类型，肝细胞毛细胆管膜 均无BSEP蛋白表达;现已报道PFIC2患者BSEP的突变可达100余种。严重表型常与蛋白截断 或蛋白生成衰竭的基因突变有关。其中大多为无效突变，表现为终止密码子提前出现及碱 基的插入或缺失。而发生移码突变，余多为复合错义突变，这些突变均严重影响了BSEP蛋白 的表达和(或）功能；已报道与PFIC3相关的ABCB4突变达30余种，ABCB4位于7q21.1，含有28 个外显子，全长74kb。已有的研究显示ABCB4基因突变热点涉及外显子6、9、12、14、18、23、 26,均位于编码蛋白的主体区，并且突变的类型与胆淤的严重性相关。近1/3病例突变致截 断蛋白生成，肝脏免疫染色检测不出MDR3糖蛋白。另2/3病例为错义突变，多发生在高度保 守的涉及ATP结合的WalkerA和B基序。这些氨基酸变化并不影响ATP酶活性与转运过程，而 是造成细胞内MDR3糖蛋白组装错误，功能缺陷。
[0005]PFIC1型及PFIC2型临床表型相似，通过对ATP8B1和ABCB11基因的检测，有助于进 行确诊。PFIC为常染色体隐性遗传病，患儿兄弟姐妹有25 %的发病、50 %的携带致病突变的 可能性。对无症状兄弟姐妹进行致病基因检测不但有助于早期发现疾病、早期治疗。而且， 由于各型的缺陷基因都已研究清楚，所以基因诊断最准确。Sanger测序法是目前公认的，大 多数临床分子诊断项目的金标准，特异性甚至能达到100%，是分子诊断方面的经典技术平 台。因此采用Sanger测序法对ATP8B1、ABCB11和ABCB4的序列进行突变检测，具有稳定性高， 特异性好的优点，能够有效避免假阳性的产生。
[0006]为了给Sanger测序提供可靠的模板，首先必须针对该项目的特点，建立一个稳定 可靠的PCR体系。该项目PCR部分在技术环节存在以下两个难点：1.该项目需要提取血液基 因组DNA，由于临床标本物流运输中存在众多不可控因素，因此临床检验中往往得不到质量 优良的全血标本，因此获得的DNA质量也会存在较大的样本间差异。2.由于需检测的外显子 数目较多，即PCR目的片段过多，导致PCR条件不统一。
[0007]溶解温度(Tm)是PCR中一个很重要的参数，是50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度，对于设定PCR退火温度是必须的，合适的退火温度能够有效的减少非特 异性结合，还能保证目的序列有效退火。所以在保证特异性的情况下，设计引物的Tm值尽量 接近，使PCR的退火温度可以保持一致，从而达到PCR条件的统一。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是提供一种检测进行性家族性肝胆汁淤积症基因突 变的试剂盒及其检测方法，该试剂盒可用于检测ATP8B1基因、ABCB4基因、ABCB11基因的突 变位点，特异性好，灵敏度高。
[0009]本发明的一种检测进行性家族性肝胆汁淤积症基因突变的试剂盒，所述试剂盒包 括PCR扩增反应试剂以及用于样本DNA中ATP8B1基因、ABCB4基因、ABCB11基因扩增的PCR引 物;其中，PCR引物如下：
[0010] ATP8B1 基因：
[0151] 所述PCR扩增反应试剂包括GoTaq?DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和反应缓冲液。
[0152] 本发明的一种检测进行性家族性肝胆汁淤积症基因突变的试剂盒的检测方法，包 括如下步骤：
[0153] (1)采集待测血液样本，提取DNA;
[0154] (2)以该DNA为模板，采用用于样本DNA中ATP8B1基因、ABCB4基因、ABCB11基因扩增 的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物，进行测序分析，确定是否存在碱基突变。
[0155] 所述步骤（2)中的PCR反应条件为：95°C5min; 95°C30s、62°C30s、72°C40s，15个循 环；95°C30s，55°C30s，72°C40s，25 个循环；最后 72°C10min。
[0156] 所述步骤(2)中的PCR反应体系为:PCR扩增反应试剂10yL，ddH20 6yL，上下游引物 各lyL，样品DNA2yL。
[0157]有益效果
[0158] 本发明可用于检测ATP8B1基因、ABCB4基因、ABCB11基因的突变位点，特异性好，灵 敏度高;可用于临床作为进行性家族性肝胆汁淤积症早期发现、早期明确诊断的辅助性指 标，降低误诊率和避免延误治疗;家系成员进行筛查可明确发病风险，产前筛查并进行干 预，可降低后代进行性家族性肝胆汁淤积症的发病率，使用方法简单，具有良好的应用前 景。
【附图说明】
[0159] 图1是ATP8B1(A)、ABCB4(B)和ABCBll(C)基因突变型的测序峰图。
【具体实施方式】
[0160] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0161] 实施例1
[0162] 1.样本抽提
[0163] (1)抽取200yL的全血，加入20yL蛋白酶K溶液，混匀。
[0164] (2)加入200yL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56°C放置10分钟，其间颠倒混匀数次，溶 液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0165] (3)加入200yL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去 除管盖内壁的水珠。
[0166] (4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12000rpm(13400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[0167] (5)向吸附柱CB3中加入500yL缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12000rpm(13400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0168] (6)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12000rpm(13400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0169] (7)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW，12000rpm(13400Xg)离心30秒，倒掉废 液。
[0170] (8)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(13400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸 附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0171] (9)将吸附柱CB3转入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50