基于胶原包覆的组织的膜的制作方法
【专利摘要】一种基于胶原包覆的组织的膜，所述膜两侧面都光滑以抑制细胞和组织粘附。还公开了用于制备基于胶原包覆的组织的膜的方法。
【专利说明】基于胶原包覆的组织的膜
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请是于2012年2月29日提交的美国申请号13/408，319的国际申请，将其内容以其整体通过引用结合于此。
[0003]背景
[0004]生物相容性膜可以通过多种不同方法制备。在一种方法中，使用提取自富胶原的组织(例如，腱和真皮)的纯化的胶原纤维来重构膜，如在美国专利6，391，333,6, 599，524和7，807，192中描述的。一种替代方法依赖于使用源自组织的膜(例如，心包膜，腹膜，和小肠粘膜下层(small intestine submucosa)作为起始材料,如在美国专利5，837，278和5，993，844中描述的。
[0005]源自组织的膜(比如心包膜和腹膜)典型地含有两个侧面。与内部器官和体液相接触的一侧被称为脏层或浆液层，而与腹壁或心壁相接触的一侧被称为体壁层。脏层(其是光滑的)不粘附至相邻身体组织。相反，体壁层与其相邻的组织结合在一起。体壁层必须机械地与相邻体壁组织分离以从身体取下基于组织的膜。从体壁的整合软组织撕下的基于组织的膜的体壁层覆盖有纤维材料。体壁层的这些覆盖有纤维的表面是粘附性的，促成细胞粘附和组织生长。在分离自动物的膜的体壁侧上的纤维材料可以在显微镜，如扫描电子显微镜下容易地被鉴定。
[0006]生物相容性膜经常用于医疗和牙科手术。有时，需要使用任一侧面都是非粘附性的膜以避免与周围组织的任何粘附。例如，非粘附性膜可以用于撕裂的硬脊膜的手术修复，以及用于需要导向的组织修复的牙科手术。
[0007]对于可以在其中与膜的细胞粘附是不期望的情况中使用的基于组织的生物相容性膜存在需求。
[0008]概述
[0009]本发明的主要目的在于向手术团体提供在两侧面上都具有最小粘附性的生物相容的基于组织的膜(tissue-based membrane),其用于组织修复和再生应用。
[0010]因此，本发明的一个方面涉及基于组织的包覆的膜，其包括具有用胶原的层包覆的纤维表面的衆膜(serous membrane)和未包覆的光滑表面,使得包覆的纤维表面和未包覆的光滑表面对细胞和组织较差地(很弱地，poorly)粘附。浆膜可以是，例如，心包膜、腹膜、羊膜(amn1n)、小肠粘膜下层、胸膜(pleural)或阴道被囊(阴道膜，vaginal tunics)。在一个优选的实施方案中，浆膜是心包膜或腹膜。在另一个优选的实施方案中，浆膜的纤维表面用形成纤维的胶原(fiber-forming collagen)包覆。形成纤维的胶原可以是I型胶原、II型胶原、III型胶原，或这三种类型中的两种或更多种的组合。
[0011]本发明的另一个方面涉及用于制备生物相容的胶原包覆的浆膜的方法。所述方法包括其中刮擦浆膜的纤维侧以除去粘附纤维(adhering fiber)的步骤。然后处理刮擦过的浆膜以除去细胞、脂质以及可提取的血液和非胶原分子，之后冷冻干燥处理过的浆膜。将处理过的浆膜的纤维侧压紧(压缩，com press)，然后用胶原包覆。最后，将胶原包覆的浆膜暴露于交联剂以发生交联。在一个实施方案中，在刮擦步骤之前用脱水剂冲洗浆膜以允许更有效除去粘附至所述膜的纤维侧的纤维。脱水剂可以是小的有机分子，如丙酮或醇。在另一个实施方案中，处理过的浆膜的纤维侧用形成纤维的胶原包覆，所述胶原可以是I型胶原、II型胶原、III型胶原，或其组合。优选所述胶原是I型胶原。可以将胶原通过喷涂(喷雾，spraying)、刷涂(brushing)或浸溃(dipping)而包覆到处理过的衆膜的纤维侧上。优选地，将胶原喷涂在浆膜的纤维侧的。
[0012]还提供了通过上述方法制备的生物相容的胶原包覆的浆膜。
[0013]本发明的一个或多个实施方案的细节列于以下描述中。根据该描述和权利要求，本发明的其它特征、目的和优势将明显。
[0014]详细描述
[0015]本发明涉及用于制备基于组织的包覆的膜的方法，其产生两侧都光滑以最小化组织粘附的膜。
[0016]用于生产光滑的基于组织的包覆的膜的方法包括以下六个关键步骤。第一，刮擦分离的基于组织的膜的纤维(即，体壁)侧以除去粘附纤维。第二，用酶和化学物质处理基于组织的膜以除去细胞、脂质，以及可提取的血液和非胶原分子。第三，将经处理的基于组织的膜冷冻干燥。第四，将基于组织的膜的纤维侧压紧。第五，将经压紧的基于组织的膜的纤维侧用胶原包覆。最后将胶原包覆的基于组织的膜暴露于交联剂。
[0017]基于组织的膜，例如，由商业供应商提供的牛或猪腹膜或心包膜通常含有粘附至膜的体壁侧的纤维，这是由于从相邻组织机械分离基于组织的膜所导致的。
[0018]取决于膜在身体中的位置和收获技术，粘附纤维的量变化。粘附纤维的除去对于最小化可能的表面不规则是重要的。 申请人:公开了，用脱水剂(如低分子量有机化合物或醇)冲洗膜，可以有利于粘附纤维的除去，因为部分脱水使纤维坚硬并且更易于通过刮擦或其它机械手段除去。例如，可以用丙酮，甲醇，乙醇或异丙醇冲洗所述膜。处理基于组织的膜中的下一步骤是使用酶和化学物质的组合来尽可能多地除去松散结合的蛋白质、细胞碎片、DNA物质、血液相关蛋白、水溶性部分和脂质。进行一系列的相继化学处理和用酶的处理以从组织除去非胶原部分、以从组织除去来自细胞和细胞核DNA分子，以及从组织使不需要的潜在有害病毒失活。用于实施此步骤的化学物质和酶包括0.1-3%辛基酚聚氧乙烯BI (octylphenol ethoxylate) (TRITON X-100?, 2-8 小时处理)、DNA 酶(2-18 小时处理)、IM Na0H(5-10小时处理)、0.5M HCl (5-10小时处理)、IM NaCl (24-48小时处理)、异丙醇(24-72小时处理)和水(5-24小时处理)。
[0019]上述酶和化学处理从组织除去大多数的非胶原蛋白质、脂质和细胞相关部分。但是，组织仍保留其天然结构以及相关的处理和机械性质。
[0020]随后将干净的、经处理的组织在本领域已知的条件(如美国专利6，391，333中公开的那些条件，将其内容以其整体通过引用结合于此)下冷冻干燥。典型地，对于薄的膜，冷冻干燥通过将膜在低于300Torr的真空下在_20°C温育24-48小时，接着在20°C干燥8-24小时实现。
[0021]在上述处理之后，冷冻干燥的膜在其体壁侧(即纤维侧)仍然是粗糙的。为了使纤维侧光滑，将其用胶原包覆。在两个步骤中制备用于包覆的膜。第一，通过在加湿的小室中温育使其软化。将膜暴露于大于90%的相对湿度达I至4小时通常足以使膜软化用于进一步处理。第二，接着通过使辊(滚筒，roller)在该膜的纤维侧上通过而将经软化的膜压紧。所述辊具有足够的重量以完全使仍然粘附于该膜的纤维侧的任何表面纤维变平且光滑。例如，辊的重量可以为2至8kg。
[0022]可以通过用pH为2.3-2.5的酸分散胶原纤维(例如，分散在乳酸中)，或pH为11至12的碱分散胶原纤维(例如，分散在NaOH中)喷涂所述表面而实现膜的包覆。任何商业的喷雾器(例如，Badger Airbrush Model 150)可以用于将分散的胶原纤维喷涂在膜的纤维侧上。可以使用0.1-1.0mm的喷嘴尺寸在10_60psi进行喷涂。喷涂溶液中的胶原纤维的浓度范围为约0.05%至约0.1% (w/v)，以使胶原以均匀包覆膜表面的薄雾形式喷涂，尽管可能存在任何微小不规则。胶原涂层的单层或多层可以经由这种喷涂技术施加。典型地，胶原涂层的厚度范围为5-50 μ m。
[0023]备选地，纤维表面可以使用毛刷用酸分散的胶原包覆。用于毛刷涂覆的胶原的浓度可以显著高于用于喷涂的浓度,范围为约0.1%至约0.9% (w/v) O使用毛刷施加的胶原涂层比通过喷涂施加的胶原涂层显著更厚，范围为约50 μ m至约100 μ m。
[0024]而且，可以将膜浸溃到胶原分散液中以包覆膜的纤维表面。
[0025]与采用的胶原涂覆技术无关，将包覆的膜干燥以更牢固地结合胶原与膜表面。
[0026]包覆的膜可以使用本领域公知的交联剂交联。交联可以在含有交联剂(例如，戊二醛，甲醛)的溶液中或通过将包覆的膜暴露于交联剂蒸汽(例如，甲醛蒸汽)进行。溶液中交联的程度是交联剂的浓度、溶液的温度和交联时间的函数。例如，可以通过在室温将包覆的膜暴露于0.5%甲醛溶液达5小时实现交联。交联条件可以显著影响膜的特性。例如，高浓度的交联剂和较长的交联时间将导致产生具有低体内再吸收速率的较不合适的膜。相反，为了制备更合适的膜，优选低浓度的交联剂。该原理同样适用于蒸汽交联，其中较低的交联剂蒸汽压将产生更适合的膜。交联的膜可以进行冲洗或暴露于空气以将任何交联剂残余物的量减少至对于人移植是可接受的水平。
[0027]无需进一步详述，认为以上描述已足以能够实现本发明。因此，以下三个实施例被认为仅是说明性的，并且无论怎样不以任何方式限制本公开内容的其他方面。
[0028]实施例1:胶原包覆的牛心包膜
[0029]纯化的腱胶原的制备
[0030]将牛屈肌腱的脂肪和筋膜小心除去并用水清洗腱。将清洁过的腱冷冻并通过用切片机切为0.5_的薄片分割。首先将切片的腱在净化水中于室温提取24小时。在滗析水后，加入在0.5M Na2SO4中的0.2M HCl溶液并将该腱薄片在室温提取24小时。通过加入3MNaOH以将pH升到约7来中和酸溶液。将屈肌腱薄片在该第一中和盐溶液中提取18小时，这之后通过滗析除去溶液。然后将酸提取过的腱在室温用在I M Na2SO4中的0.75M NaOH进一步提取24小时。通过加入3MHC1将此碱溶液中和至pH为约7。将腱薄片在该第二中和盐溶液中提取18小时，这之后通过滗析除去该溶液。在两次刚提到的中和盐提取之后，将腱薄片用净化水冲洗4次以除去任何残留的盐。随后将经提取、冲洗的腱用99%异丙醇在室温脱脂8小时。将异丙醇滗析并加入另一等体积的99%异丙醇以进一步在室温提取腱薄片达18小时。
[0031]上述的所有提取步骤在恒定搅拌下进行。而且，每克处理的腱使用5ml的提取溶液进行所有的提取(除了异丙醇提取之外)。每克处理的腱使用3ml异丙醇进行异丙醇提取。
[0032]随后将脱脂的腱在清洁空气罩(clean air hood)下干燥。将处理的腱材料(主要由纯化的纤维状胶原组成)干燥储存在室温备用。
[0033]酸分散的胶原纤维的制备
[0034]通过在冰箱中于4°C将Ig纯化的纤维状胶原在一升的0.07M乳酸中溶胀过夜而制备0.1% (w/v)的酸性胶原分散液。然后使用Silverson均化器将溶胀后的纤维均化60秒并通过50目不锈钢滤器过滤。然后将酸性分散液储存于冰箱中备用。
[0035]牛心包腊的钝仆,
[0036]将脂肪和无关组织从未加工的牛心包膜组织机械地除去并用水清洗。首先将预先清洁的牛心包膜在净化水中于室温清洗2小时。滗去水，加入0.1 % TRITON X-100TM/DNA酶(DNase)，并在室温提取该心包膜两小时。使用的DNA酶的量为4个活性单位/cm2膜。将溶液滗析并随后将牛心包膜用净化水冲洗2小时。然后将去污剂/酶-提取的牛心包膜通过用99%的异丙醇室温温育三次(6，18和24小时)进行脱脂。然后将脱脂的牛心包膜在室温在0.5M Na2SO4中的0.5M HCl中提取6小时。通过加入3M NaOH将该酸性溶液中和至pH为约7。随后将牛心包膜在中和的盐溶液中提取18小时并将溶液滗析。然后将酸提取的牛心包膜在室温在1.2M Na2SO4中的IM NaOH中进一步提取6小时。通过加入3M HCl将该碱溶液中和至PH为约7。随后将牛心包膜在中和的盐溶液中提取18小时并将溶液滗析。在盐提取之后，将牛心包膜用净化水洗涤4次以除去与纯化的牛心包膜相关的残留盐。所有提取步骤在恒定搅拌下进行。
[0037]除了异丙醇提取之外，所有提取使用3ml提取溶液/cm2处理的牛心包膜进行。异丙醇提取使用2.7ml异丙醇/cm2处理的牛心包膜进行。
[0038]随后将纯化的牛心包膜冷冻干燥并储存备用。
[0039]用酸分散的胶原包覆纯化的牛心包膜
[0040]将冷冻干燥的纯化的牛心包膜在湿化罐(humidificat1n tank)中以90-100%的相对湿度加湿处理约30-60分钟。然后将膜的纤维(体壁)侧使用辊在轻压力(lightpressure)下在单个均一方向上压紧以使纤维沿该方向变平。辊重量为4kg，并且仅以辊重量提供轻压力。将膜置于清洁空气罩中以干燥最少15分钟。然后将膜置于保持架中并使用气刷枪(air-brush gun) (Badger Airbrush Model 150),将膜用 0.1 % (w/v)酸性胶原分散液喷涂30秒。通过0.3_喷嘴以40psi喷涂胶原分散液。随后将喷涂过的膜置于玻璃皿中并轻微地与0.001%戊二醛溶液交联3小时。之后将交联的膜用净化水冲洗并再次冷冻干燥。
[0041]月交原包覆的牛心包膜的表征
[0042]使用扫描电子显微镜(JE0L Ltd.Model JSM6100SEM)，在胶原包覆的和未包覆的样品上以50x放大倍数进行扫描子显微镜(SEM)。使用粘性碳胶带将样品安装在铝圆片上。将约500埃的纯金溅射到样品上以改善电子束传导和阻止样品放电。
[0043]由于膜的表面上的随机取向的纤维所致，牛心包膜的纤维(体壁)侧具有粗糙的外观，如在SEM下可视化的。按照上述程序，在用胶原包覆牛心包膜的体壁表面之后，在SEM下观察到光滑表面。牛心包膜的光滑(内脏)非包覆侧在外观上类似于包覆的纤维侧。
[0044]实施例2:胶原包覆的猪腹膜
[0045]将脂肪和无关组织从猪腹膜机械地除去并用水清洗。首先将预先清洁的猪腹膜在净化水中于室温清洗2小时。将水滗析并将3% TRITONX-100?加入至腹膜并在室温孵育7小时。将TRITON X-100?溶液滗析并随后将腹膜在DNA酶溶液中温育18小时。使用的DNA酶的量为8个活性单位/cm2膜。通过用99%异丙醇在室温温育三次(3，3，18和24小时)而将去污剂和酶提取的猪腹膜脱脂。将脱脂的猪腹膜在室温在0.5MNa2S04中的0.5MHCl中提取6小时。使用3M NaOH将该酸溶液中和至pH为约7。将猪腹膜在中和的盐溶液中进一步提取18小时并将溶液滗析。随后将酸提取的猪腹膜在室温在1.2M Na2SO4中的IMNaOH中提取6小时。使用3M HCl将该碱性溶液中和至pH为约7。将猪腹膜在中和的盐溶液中进一步提取18小时并将溶液滗析。在盐提取之后，将猪腹膜用净化水清洗4次以除去与纯化的猪腹膜相关的残留盐。
[0046]除异丙醇提取之外，所有提取使用3ml提取溶液/cm2处理的猪腹膜进行。异丙醇提取使用2.7ml异丙醇/cm2处理的猪腹膜进行。
[0047]将纯化的猪腹膜冷冻干燥并储存备用。
[0048]如上文对牛心包膜描述的，将纯化的猪腹膜用酸分散的胶原包覆。
[0049]实施例3:用碱分散的胶原纤维包覆牛心包膜
[0050]通过在冰箱中将Ig如上所述纯化的纤维状胶原在一升的0.0lMNaOH中于4°C溶胀过夜来制备0.1% (w/v)碱胶原分散液。然后使用Silverson均化器将溶胀后的纤维均化90秒，这之后将它们通过50目不锈钢滤器过滤。随后将碱分散液储存于冰箱中备用。
[0051]牛心包膜如上所述进行纯化。如上文对酸分散的胶原纤维的描述，将碱分散胶原纤维包覆在纯化的膜上。
[0052]实施例4:用碱分散的胶原纤维包覆猪腹膜
[0053]通过在冰箱中将Ig如上所述纯化的纤维状胶原在一升的0.0lMNaOH中于4°C溶胀过夜来制备0.1% (w/v)碱胶原分散液。随后使用Silverson均化器将溶胀后的纤维均化90秒，这之后将它们通过50目不锈钢滤器过滤。随后将碱分散液储存于冰箱中备用。
[0054]猪腹膜如上文所述进行纯化。如上文对酸分散的胶原纤维描述的，将碱分散的胶原纤维包覆在纯化的膜上。
[0055]其它实施方案
[0056]可以以任意组合将本说明书中公开的所有特征进行组合。本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、相当或类似目的的备选特征替代。因此，除非另有明确陈述，公开的每个特征仅是通用系列的相当或类似特征的实例。本领域技术人员可以从以上描述容易地确定本发明的本质特性，同时不偏离其精神和范围，可以进行本发明的各种改变和改进以使其适于不同用途和条件。因此，其它实施方案也在所附权利要求的范围内。
【权利要求】
1.一种基于组织的包覆的膜，其包括浆膜和胶原涂层，其中所述浆膜具有纤维表面和光滑表面，所述胶原涂层存在于所述纤维表面上，并且所述胶原包覆的纤维表面和所述光滑表面都对细胞和组织较差地粘附。
2.权利要求1所述的基于组织的膜，其中所述浆膜是心包膜、腹膜、羊膜、小肠粘膜下层、胸膜或阴道被囊。
3.权利要求1所述的基于组织的膜，其中所述胶原是形成纤维的胶原。
4.权利要求3所述的基于组织的膜，其中所述形成纤维的胶原为I型胶原、II型胶原、III型胶原，或其组合。
5.权利要求4所述的基于组织的膜，其中所述形成纤维的胶原是I型胶原。
6.权利要求5所述的基于组织的膜，其中所述浆膜是心包膜或腹膜。
7.一种用于制备生物相容的胶原包覆的浆膜的方法，所述方法包括: 刮擦浆膜的纤维侧以除去粘附纤维； 处理所述浆膜以除去细胞、脂质以及可提取的血液和非胶原分子； 冷冻干燥经处理的浆膜； 压紧所述浆膜的所述纤维侧； 用胶原包覆所述浆膜的所述纤维侧；和 将胶原包覆的浆膜暴露于交联剂以发生交联。
8.权利要求7所述的方法，其中在所述刮擦步骤之前，将所述浆膜用脱水剂冲洗。
9.权利要求8所述的方法，其中所述脱水剂是醇。
10.权利要求7所述的方法，其中所述浆膜是心包膜、腹膜、羊膜、小肠粘膜下层、胸膜或阴道被囊。
11.权利要求7所述的方法，其中所述胶原是形成纤维的胶原。
12.权利要求11所述的方法，其中所述形成纤维的胶原是I型胶原、II型胶原、III型胶原，或其组合。
13.权利要求12所述的方法，其中所述形成纤维的胶原是I型胶原。
14.权利要求7所述的方法，其中所述包覆通过将所述胶原喷涂到所述浆膜的所述纤维侧上实现。
15.权利要求7所述的方法，其中所述包覆通过将所述胶原刷涂在所述浆膜的所述纤维侧上实现。
16.权利要求7所述的方法，其中所述包覆通过将所述浆膜的所述纤维侧浸溃在所述胶原中实现。
17.权利要求14所述的方法，其中所述浆膜是心包膜或腹膜。
18.权利要求17所述的方法，其中所述胶原是I型胶原。
19.一种通过权利要求7所述的方法制备的生物相容的胶原包覆的浆膜。
20.一种通过权利要求18所述的方法制备的生物相容的胶原包覆的浆膜。
【文档编号】A61F2/02GK104168925SQ201380011027
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年1月30日 优先权日:2012年2月29日
【发明者】李树东 申请人:胶原基质公司